萊茵衣藻玀APK4基因RNAi載體的構建及鑒定

王子賀 鄧曉東 張陽 費小雯 ??

摘要[目的] 構建萊茵衣藻2A38的MAPK4基因的RNAi載體。 [方法]提取萊茵衣藻細胞總RNA，利用PCR擴增出編碼MAPK4的基因片段，用基因工程技術將MAPK4基因片段連接載體pMD18-T上，經過2次不同的雙酶切后，與RNAi中間載體pT282連接，最后連接到干涉載體pMaa7IR/XIR上，用酶切及測序鑒定MAPK4基因RNAi載體并轉化萊茵衣藻。 [結果]經限制性內切酶酶切及測序鑒定，證實為重組質粒，并且該重組載體可在萊茵衣藻中表達。 [結論]構建的MAPK4基因RNAi載體結構正確，為進一步利用RNAi技術使MAPK4基因沉默表達，研究MAPK4在萊茵衣藻中的生物學功能奠定了試驗基礎。

關鍵詞萊茵衣藻；MAPK4基因；RNAi

中圖分類號S188文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）19-0126-04

Construction and Identification of MAPK4 Gene RNAi Vector of Chlamydomonas reinhardtii

WANG Zihe1， DENG Xiaodong2， ZHANG Yang1， FEI Xiaowen1*

（1.College of Basic Medicine and Life Science，Hainan Medical College， Haikou， Hainan 571101；2. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101）

Abstract[Objective] To construct a MAPK4 gene RNAi vector of Chlamydomonas reinhardtii 2A38. [Method] Total RNA was extracted from C. reinhardtii， and the MAPK4 gene was amplified by reverse transcription polymerase chain reaction（PCR）. By using gene engineering technique， C. reinhardtii MAPK4 gene was inserted to pMD18T vector. The forward and reverse fragments ，which were obtained by two different double enzyme digestion of pMD18T vector， were inserted into the RNAi intermediate vector pT282. The invertedrepeat fragment was digested by enzyme EcoRI and linked to the vector pMaa7IR/XIR.The recombined plasmid was identified by digestion and sequencing. [Result] Through restriction enzyme digestion and nucleotide sequencing identification， the recombinant vector was successfully constructed， it could be expressed in C. reinhardtii. [Conclusion] The constructed MAPK4 gene RNAi vector has correct structure， which laies the foundation for using RNAi technique to silence the gene expression and further research on MAPK4 biological function in C. reinhardtii.

Key wordsChlamydomonas reinhardtii；MAPK4 gene；RNAi

鐵是自然界生物質生長和繁殖不可缺少的元素，在植物中，鐵是最早發現的必需營養因子。鐵直接或間接參與植物光合、呼吸作用中的光合磷酸化和氧化磷酸化，固氮作用及硝酸鹽還原過程中的電子傳遞，又參與植物的細胞分裂，影響葉綠體的組成[1-2]。在哺乳動物中，鐵的主要作用是運載和儲存體內的氧和二氧化碳，參與細胞色素氧化酶等動物生長所必需的活化因子的組成，最重要的是參與血紅蛋白和肌紅蛋白的組成[3]。筆者所在實驗室以萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）為研究對象，在缺鐵應答突變體庫中篩選得到一個突變體mu9， 已經證明該突變體Femu9p基因的缺失是造成報告基因活性喪失的原因，其編碼蛋白含有絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶（MAPKKK）結構域，在缺鐵的條件下可以誘導表達[4]。MAPKKK是絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）信號轉導通路中的組成部分，故預測MAPK信號轉導通路參與鐵的調控。MAPK存在于真核生物中，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，MAPK級聯信號轉導通路由MAPK、MAPKK、MAPKKK組成，其信號轉導過程中，MAPKKK、MAPKK、MAPK通過依次磷酸化作用而被激活[5]，參與介導細胞的生長發育、分裂、分化和凋亡等生理活動[6]。該試驗通過RT-PCR擴增萊茵衣藻MAPK4基因干涉片段，并通過連接、轉化等重組方法，構建MAPK4基因的干涉載體，為下一步研究MAPK4基因在萊茵衣藻鐵代謝機制中的作用奠定試驗基礎。

1材料與方法

1.1材料

藻株、菌株及載體：所使用的萊茵衣藻2A38是由購自美國杜克大學衣藻中心的萊茵衣藻 CC425改造而成；E.coli DH5α菌株、載體pT282、RNAi載體pMaa7IR/XIR是由筆者所在實驗室提供；PMD-18T 載體購自TaKaRa 公司。

試劑與儀器：PCR 試劑盒（海南微氪生物科技有限公司），巴龍霉素、5-氟吲哚、L-色氨酸、Trizol、DEPC、T4 DNA連接酶、質粒提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒和PCR 產物回收試劑盒（上海生工生物工程有限公司），HindIII和BamHII等限制性內切酶、SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ 試劑盒（TaKaRa），Tgradient梯度PCR 儀（Biometra， GER），高速冷凍離心機，渦旋器，恒溫搖床，六一電泳系統，恒溫培養箱。

1.2方法

1.2.1

總RNA的提取及反轉錄。 將2A38藻株接于50 mL的TAP液體培養基中培養至對數期，用Trizol法提取萊茵衣藻的總RNA，再用大連寶生物公司的M-MLV反轉錄試劑盒合成cDNA。

1.2.2萊茵衣藻MAPK4基因干涉片段的擴增。 根據 Phytozome 數據庫公布的MAPK4（Cre17.g745447）的序列，設計用于擴增干涉片段的引物為 F-GCACAGCCTCATAGGAAAGG/R-CCAATCACTGTGTGCAGGTC。通過PCR擴增用于構建RNA載體的干涉片段，反應體系為cDNA模板1 μL，引物F 1 μL，引物R 1 μL， 1×Mix 12.5 μL，Taq酶0.5 μL，DMSO 1 μL ，ddH2O補足至25 μL。PCR反應條件為95 ℃預變性 3 min；95 ℃變性1 min，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR 產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3干涉片段與載體pMD18-T連接。 將擴增得到的目的片段回收并純化，與載體pMD18-T連接（圖1a），連接產物轉化E.coli DH5a感受態細胞，挑取單克隆菌落培養后進行菌液PCR鑒定，經測序驗證正確，得到pMD-18T-MAPK4。

1.2.4正向片段與載體pT282連接。 用HindIII和BamHII分別進行雙酶切 pMD-18T-MAPK4和中間載體pT282，切膠回收酶切后的MAPK4正向片段和線性化載體pT282并連接（圖1b），轉化E.coli DH5a感受態細胞，挑取單克隆菌落，提取質粒，并用HindIII和BamHII雙酶切鑒定重組質粒，得到pT282-MAPK4正向片段質粒。

1.2.5反向片段與載體pT282連接。用XbaI和SalI 雙酶切pMD-18T-MAPK4 和 pT282-MAPK4正向片段重組質粒，切膠回收MAPK4反向片段和線性化的pT282-MAPK4 正向片段載體并連接，轉化E.coli DH5a感受態細胞，挑取單克隆菌落，提取質粒，并用XbaI和SalI雙酶切鑒定。再用EcoRI酶切鑒定，得到由MAPK4干涉片段正反方向插入的中間載體pT282-MAPK4（圖1b）。

1.2.6

正反向重復片段與載體pMaa7IR/XIR連接。用EcoRI酶切中間載體pT282-MAPK4和RNAi空載體pMaa7IR/XIR，回收MAPK4正反重復片段和線性化的pMaa7IR/XIR 載體并將回收的載體進行去磷酸化處理，然后連接（圖1c），轉化E.coli DH5a感受態細胞，挑取單陽性克隆，提取質粒，并用EcoRI酶切鑒定，得到pMaa7IR/MAPK4IR干涉表達載體，并測序鑒定。

1.2.7轉化萊茵衣藻及轉化后鑒定。 將萊茵衣藻2A38在TAP液體培養基中于25 ℃200 r/min、全光照的條件下培養至對數期。用玻璃珠法[7]將pMaa7IR/MAPK4IR干涉載體及空載體pMaa7IR/XIR分別轉化萊茵衣藻，將轉化后的藻細胞于50 mL離心管，避光溫育過夜。3 000 r/min，離心5 min收集藻細胞，涂布于含有5 μg/mL巴龍霉素的TAP固體培養基上，全光照培養6～7 d。挑選單克隆藻株，接種于含5 μmol/L 5-氟吲哚、1.5 mmol/L L-色氨酸的TAP固體培養基上篩選，挑取篩選后的單克隆藻株，進行目標基因MAPK4表達豐度分析。

1.2.8

轉基因藻株MAPK4基因表達豐度檢測。 挑選3個轉基因藻株于液體TAP培養基中培養至對數期，提取總RNA并反轉錄為cDNA，根據SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ 試劑盒說明書進行操作。qPCR引物為F-GCACAGCCTCATAGGAAAGG/R-CCAATCACTGTGTGCAGGTC。反應體系為cDNA模板2 μL，引物F 1 μL，引物R 1 μL，SYBR Premix Ex TaqTM 7.5 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.3 μL，ddH2O補足至15 μL。PCR反應條件為95 ℃預變性 1 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環；72 ℃延伸1 min；4 ℃保溫。每個樣品設3個重復。空載體pMaa7IR/XIR轉基因藻為對照，18S rRNA為內參，數據采用2-ΔΔCt法分析。

2結果與分析

2.1萊茵衣藻MAPK4基因干涉片段的擴增

以萊茵衣藻總RNA反轉錄成的cDNA 為模板，以RNAi片段的特異性引物來擴增（片段大小273 bp），用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在250～500 bp出現特異性條帶，與預期目的片段大小一致（圖2）。

2.2pMD-18T-MAPK4菌落PCR鑒定

挑取單陽性克隆的菌落當模板進行菌液PCR，然后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在250～500 bp處有條帶，且與原先的目的片段大小一致，經測序正確（圖3）。

2.3RNAi正、反向片段的獲得

用2組酶分別雙酶切pMD-18T-MAPK4，將正向片段和反向片段從質粒上切下來，然后再進行膠回收純化目的片段，并與酶切處理過的pT282連接。酶切質粒pMD-18T-MAPK4與pT282所用2組酶分別為 HindIII 和 BamHII（此組酶切下的片段定義為正向片段）、XbaI和 SalI（此組酶切下的片段定義為反向片段）。

2.4正、反向片段與載體pT282連接鑒定

用HindIII和BamHII進行雙酶切pT282-MAPK4正 向片段重組質粒，電泳分析，在100、250 bp處有條帶，表明正向片段已成功地連接到載體pT282上；用XbaI和SalI 雙酶切pT282-MAPK4正反向片段重組質粒，電泳顯示，大小與預期大小一致，表明反向片段已成功地連接到載體pT282上（圖5）。

2.7干涉載體轉化萊茵衣藻后檢測結果

提取培養至對數期藻細胞的總RNA，反轉錄成cDNA，用qPCR法檢測萊茵衣藻MAPK4基因mRNA的表達量。由圖8可知，3個干涉載體pMaa7IR/MAPK4IR轉基因藻菌與空載體pMaa7IR/XIR轉基因藻菌相比，MAPK4的mRNA表達量分別下降了7960%、83.40%、74.70%，說明沉默效果較好。

3討論

目前，基因敲除已經成為研究基因功能不可缺少的工具，而RNA干涉技術又是比較理想的可以使目的基因沉默的工具。RNA干涉（RNA interference，RNAi）是指利用雙鏈小RNA高效、特異性降解細胞內同源mRNA從而阻斷靶基因表達，使細胞出現靶基因缺失的表型的技術[8]，其已經應用于基因功能研究、疾病治療和藥物開發與應用等方面[9]。

與鐵代謝相關的MAPK的報道主要集中在人類癌細胞

的研究方面。研究發現缺鐵將導致肺癌細胞、黑色素瘤細

胞、神經母細胞瘤細胞有絲分裂中斷，并誘導這些細胞凋亡，

所以目前臨床上采用鐵螯合劑desferrioxamine（DFO）或Dp44mT治療上述癌癥[10-12]。缺鐵信號的轉導可通過ASK1（MAPKKK）激活JNK和p38MAPK級聯途徑誘導癌細胞凋亡[13]。除了在癌細胞研究方面，在植物、微藻和酵母的鐵代謝調控研究領域，對MAPK信號轉導通路參與鐵代謝的報道還不多。

綜上所述，有必要研究MAPK4在萊茵衣藻缺鐵應答調控機制中的作用。該研究擴增萊茵衣藻MAPK4基因的干涉片段且成功構建MAPK4-RNAi載體，并轉入萊茵衣藻里，為進一步研究MAPK4在萊茵衣藻缺鐵應答調控中的作用和生物學功能奠定了試驗基礎。

參考文獻

[1] 周曉今，陳茹梅，范云六.植物對鐵元素吸收、運輸和儲存的分子機制[J].作物研究， 2012， 26（5）：605-610.

[2] JEANFRANOIS B， DUBOS C，GAYMARD F.Iron nutrition， biomass production， and plant product quality[J].Trends in plant science， 2015， 20（1）：33-40.

[3] 張玉超，沈媛媛，晏向華，等.哺乳動物鐵穩態分子機制研究進展[J].中國細胞生物學學報， 2011，33（11）：1179-1190.

[4] LI Y J， DENG X D， YANG J H，et al.A putative protein kinase Femu9p contributes to the iron deficiencyinducible expression of ‘FOX1 gene in Chlamydomonas reinhardtii[J].Australian journal of crop science， 2012， 6（12）：1724-1731.

[5] 周志琦，劉強.真核生物的MAPK級聯信號傳遞途徑[J].生物化學與生物物理進展，1998，25（6）：496-503.

[6] 陳建勇，王聰，王娟，等.MAPK信號通路研究進展[J].中國醫藥科學，2011，1（8）：32-34.

[7] 黃非，黃秦，黃敏，等.萊茵衣藻玻璃珠法快速轉化檢測體系的建立[J].四川大學學報（自然科學版）， 2008， 45（3）：694-698.

[8] FIRE A，XU S，MONTGOMERY M K， et al.Potent and inerference by stranded RNA in Caenothabdetols elegans[J].Nature， 1998，391：808-811.

[9] 趙雪萌，余祖江.基因沉默的工具-RNA干擾技術的研究進展[J].河南醫學研究，2015，24（1）：74-75.

[10] BRODIE C， SIRIWARDANA G， LUCAS J， et al.Neuroblastoma sensitivity to growth inhibition by deferrioxamine：Evidence for a block in G1 phase of the cell cycle[J].Cancer rresearch， 1993， 53（17）：3968-3975.

[11] BUSS J L， TORTI F M， TORTI S V.The role of iron chelation in cancer therapy[J].Current medicinal chemistry， 2003， 10（12）：1021-1034.

[12] HILETI D， PANAYIOTIDIS P， HOFFBRAND A V.Iron chelators induce apoptosis in proliferating cells[J].British journal of haematology， 1995， 89（1）：181-187.

[13] YU Y， RICHARDSON D R.Cellular iron depletion stimulates the JNK and p38 MAPK signaling transduction pathways， dissociation of ASK1-thioredoxin， and activation of ASK1[J].Journal of biological chemistry， 2011， 286（17）：15413-15427.