葉下珠飲片質量標準研究

韓越，鄒愷平，周琴妹，張源

（南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇南京210029）

·實驗研究·

葉下珠飲片質量標準研究

韓越，鄒愷平，周琴妹，張源

（南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇南京210029）

目的建立葉下珠飲片的質量標準，提高其質量控制水平。方法采用薄層色譜（TLC）法對葉下珠飲片中的沒食子酸進行定性鑒別；以沒食子酸和柯里拉京為指標成分，采用高效液相色譜（HPLC）法測定含量。結果葉下珠飲片沒食子酸薄層色譜中，在與對照品溶液同一位置顯相同顏色的斑點。HPLC定量分析結果中，沒食子酸的線性回歸方程為Y＝30.715X－0.172 9，質量濃度線性范圍為0.66～26.40 g／mL（r＝1.000 0），平均回收率為97.99%，RSD＝1.44%（n＝6）；柯里拉京的線性回歸方程為Y＝13.192X＋1.494 6，質量濃度線性范圍為1.79～71.84 g／mL（r＝0.999 8），平均回收率為95.68%，RSD＝1.04%（n＝6）。結論該方法簡單易行，專屬性強，重復性好，可作為葉下珠飲片的質量控制方法。

葉下珠；飲片；質量標準；薄層色譜法；高效液相色譜法

葉下珠為大戟科葉下珠屬植物葉下珠Phyllanthus urinaria L.的干燥全草，中醫應用廣泛，具有清熱利尿、平肝解毒功效，對肝炎、腸炎、泌尿系統感染等有良好療效。葉下珠屬植物含有木脂素、萜類、黃酮、鞣質、生物堿等多種化合物[1]，其中酚酸類為葉下珠的主要有效成分，沒食子酸、柯里拉京和短葉蘇木酚為含量相對較高的酚酸類成分[2]。目前，尚無葉下珠飲片的質量標準，為了提高其質量控制水平，本研究中參照《江蘇省中藥飲片炮制規范》修訂工作的要求，對10個批次的葉下珠飲片進行了薄層色譜（TLC）鑒別，并測定了水分、總灰分、浸出物、沒食子酸和柯里拉京的含量，為葉下珠飲片質量標準的制訂提供了試驗基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AX 224ZH／E型萬分之一電子天平，AR 2140型十萬分之一電子天平（美國OHAUSCorp公司）；HH－2型數顯恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；RT－02A型粉碎機（上海羅技機械設備有限公司，單次最大粉碎能力100 g）；SK6200H型超聲清洗儀（上海科導超聲儀器有限公司）；1260S型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；DHG－9123A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；RJM－28－10型茂福爐（沈陽市電爐廠）。

1.2 試藥

沒食子酸對照品（批號為16081904，CAS：149－91－7），柯里拉京對照品（批號為16080905，CAS：23094－69－1），葉下珠對照藥材（批號為121374－200401），均購自中國食品藥品檢定研究院；葉下珠飲片經江蘇省藥品檢驗所胡浩彬主任鑒定為葉下株Phyllanthus urinaria L.的干燥全草，均購自安徽井泉集團中藥飲片有限公司（批號分別為20160101，20160102，20160103，20160201，20160202，20160203，20160301，20160302，20160303，20160401）；聚酰胺薄膜（供薄層層析用，批號為20120210，浙江臺州市路橋四甲生化塑料廠）；聚酰胺－6－薄膜（供薄層層析用，批號為20150413，國藥集團化學試劑有限公司）。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 鑒別方法

取葉下珠飲片(批號為20160102)適量，用粉碎機研為粉末，取葉下珠粉末1.0 g，加50%甲醇50mL，超聲（功率280W，頻率50 kHz）0.5 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1mL溶解，作為供試品溶液。另取葉下珠對照藥材，同法制備葉下珠對照藥材溶液。取沒食子酸對照品，加甲醇制成每1m L含1mg的溶液，作為對照品溶液。

照薄層色譜法[2015年版《中國藥典（四部）》通則0502]試驗，吸取上述溶液各2μL，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以冰乙酸作為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%的三氯化鐵乙醇溶液，晾干，日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品、對照藥材溶液色譜相應位置顯相同顏色的斑點[3]，見圖1。

1.供試品溶液2.對照品溶液3.葉下珠對照藥材溶液圖1葉下珠與沒食子酸薄層色譜圖

2.1.2 耐用性考察

取10個不同批次的葉下珠飲片，按2.1.1項下方法制備供試品溶液，取10份供試品溶液與對照品溶液，每份各1μL，分別點于聚酰胺－6－薄膜和聚酰胺薄膜，按擬訂方法進行試驗，結果重復性良好，見圖2。

1－10.不同批次的葉下珠飲片11.沒食子酸對照品A.聚酰胺－6－薄膜B.聚酰胺薄膜圖2 10批次葉下珠飲片沒食子酸薄層色譜圖

2.2 水分、總灰分測定

照2015年版《中國藥典（四部）》通則0832第二法中的水分測定法及通則2302中的總灰分測定法，對10批葉下珠飲片進行水分及總灰分測定。結果見表1。

2.3 浸出物測定

取10批不同批次葉下珠飲片粉末各4g，精密稱定，用70%乙醇作溶劑，照2015年版《中國藥典（四部）》通則2201醇溶性浸出物測定法項下的熱浸法測定。結果見表1。

2.4 含量測定

2.4.1 溶液制備

供試品溶液：稱取葉下珠對照藥材200.49 mg，精密稱定，置100m L容量瓶中，加50%甲醇適量，加熱回流1.5 h，過濾，放冷，加50%甲醇補足至刻度，搖勻，0.45μm濾膜濾過，即得。

表1 葉下珠飲片相關含量測定結果（%）

混合對照品溶液：稱取沒食子酸、柯里拉京對照品適量，精密稱定，置容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 m L含沒食子酸26.4μg、柯里拉京71.84μg的混合對照品溶液。

2.4.2 色譜條件及系統適用性試驗

色譜柱：Hypersil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：A為0.1%磷酸溶液，B為乙腈，梯度洗脫，0～5 min時95%A，5～35 min時95%A～85%A，35～38 min時85%A～95%A，38～45 min時95%A；檢測波長：270 nm；柱溫：35℃；流速：1.0 m L／min；進樣量：10μL。在此色譜條件下的色譜圖見圖3。

1.沒食子酸2.柯里拉京A.混合對照品溶液B.供試品溶液圖3高效液相色譜圖

2.4.3 方法學考察

線性關系考察：取混合對照品溶液，稀釋0，2，4，8，20，40倍。吸取適量，精密稱定，按擬訂色譜條件進樣測定。以峰面積值（Y）為縱坐標、對照品質量濃度（X）為橫坐標進行線性回歸，得沒食子酸、柯里拉京的回歸方程分別為Y＝30.715X－0.172 9（r＝1.000 0）和Y＝13.192X＋1.494 6（r＝0.999 8），質量濃度線性范圍分別為0.66～26.4μg／mL及1.79～71.84μg／mL。結果表明，各對照品溶液的質量濃度與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取2.4.1項下混合對照品溶液，連續進樣6次，計算沒食子酸、柯里拉京對照品含量。結果的RSD分別為0.20%和0.15%（n＝6），均小于5%，表明儀器精密度良好。詳見表2。

重復性試驗：精密稱取葉下珠對照藥材200mg，共6份，按2.4.1項下方法制備供試品溶液，進樣測定，計算沒食子酸、柯里拉京的含量。結果沒食子酸、柯里拉京的平均含量分別為2.06μg／mL和36.82μg／mL，RSD分別為0.55%和0.34%（n＝6），均小于5%，表明該方法的重復性良好，詳見表3。

表2 精密度試驗結果（n＝6）

穩定性試驗：取同一供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h時進樣測定，計算其含量。結果沒食子酸、柯里拉京含量的RSD分別為0.80%和0.96%（n＝6），均小于5%，表明供試品溶液在24 h內穩定，詳見表4。

表3 重復性試驗結果（n＝6）

表4 穩定性試驗結果（n＝6）

表5 加樣回收試驗結果（n＝6）

加樣回收試驗：精密稱取葉下珠對照藥材200mg，共6份，置100mL容量瓶中，分別精密加入一定量的沒食子酸和柯里拉京對照品溶液，加50%甲醇定容至刻度，搖勻，過濾，進樣測定，計算回收率，見表5。

2.4.4 樣品含量測定

取10批不同批次的葉下珠飲片，依法制備供試品溶液，進樣測定，每批平行測定2次計算峰面積，按擬訂方法計算沒食子酸和柯里拉京的含量。結果見表1。

3 討論

本研究中對葉下珠飲片中所含酚酸類成分與黃酮類成分進行了TLC考察，選用沒食子酸、蘆丁、槲皮素作為對照品，經過比較，葉下珠飲片所含主要成分沒食子酸斑點清晰，方法簡便可行，重復性好，可作為葉下珠飲片的定性鑒別依據。

含量測定項中對比了使用50%甲醇進行超聲提取15，30min和進行加熱回流1，1.5 h，結果加熱回流1.5 h的樣品中沒食子酸和柯里拉京的含量最高，故選用50%甲醇加熱回流1.5 h作為提取方法。本研究中參考文獻[4－8]的方法，比較了乙腈－0.2%冰醋酸水、甲醇－0.1%磷酸溶液、乙腈－0.1%磷酸溶液等不同流動相及不同流動相比例對各種化合物的分離效果，結果發現，沒食子酸和柯里拉京在乙腈－0.1%磷酸溶液中的峰形和分離度均較好，故以此作為流動相進行梯度洗脫，對沒食子酸和柯里拉京的含量進行測定。

本研究中收集了10批不同批次的葉下珠飲片進行炮制規范研究，研究結果能充分反映葉下珠飲片的實際情況。根據測定結果，按照《江蘇省中藥飲片炮制規范》中藥質量標準研究制定技術要求，并參考2015年版《中國藥典（四部）》中車前草、積雪草和金錢草等全草類藥材的標準，建議規定葉下珠飲片的水分不得過12.0%，總灰分不得過15.0%；照通則2201醇溶性浸出物測定法項下的熱浸法測定，用70%乙醇作溶劑，不得少于15.0%；照高效液相色譜法（通則0512）測定，沒食子酸含量不得少于0.03%，柯里拉京含量不得少于0.30%。

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[2]閆小玉，孫蒙，楊國光，等.RP－HPLC法同時測定葉下珠中沒食子酸、柯里拉京和短葉蘇木酚的含量[J].沈陽藥科大學學報，2012，29（1）：45－48.

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[6]張文霞，戴衛波.葉下珠質量控制研究進展[J].今日藥學，2014，24（9）：693－696.

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[8]張芝英.高效液相色譜法測定葉下珠中沒食子酸的含量[J].中國藥業，2002，11（7）：53.

Quality Standard of Phyllanthus Urinaria

Han Yue，Zou Kaiping，Zhou Qinmei，Zhang Yuan
（Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing，Jiangsu，China 210029）

Objective To establish the quality standard of Phyllanthus Urinaria and improve its quality control level.M ethods Gallic acid and corilagin were selected as index ingredients.The qualitative and quantitative analyses were performed by TLC and HPLC methods.Resu lts The TLC spots of gallic acid had similar color with the reference solution at the same position.The results of quantitative analyses showed that the linear equation of gallic acid is Y＝30.715X－0.172 9，the liner range was 0.66－26.40μg／m L（r＝1.000 0）and the average recovery was 97.99%，RSD＝1.44%（n＝6）；the linear equation of corilagin is Y＝13.192X＋1.494 6，the liner range was 1.79－71.84μg／mL（r＝0.999 8），and average recovery was 95.68%，RSD＝1.04%（n＝6）.Conclusion The method is convenient，accurate，repeatable and specific，which can be used for the quality control of Phyllanthus Urinaria.

Phyllanthus Urinaria；crude drug；quality standard；TLC；HPLC

R282.5；R284.1

A

1006－4931(2017)10－0014－04

2017－02－10)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.10.004

江蘇省中藥飲片炮制規范修訂專項[蘇藥會字[2015]30號]。

韓越，大學本科，副主任中藥師，研究方向為中藥資源與鑒定，（電話）025－86617141－20136（電子信箱）hanyuehan123＠yeah.net。

張源，大學本科，主任中藥師，研究方向為中藥制劑，（電話）025－86614204（電子信箱）2217764733＠qq.com。