正交試驗法優選四黃定痛貼提取工藝

潘傳波，郭劍華，郭亮，李卿，馬善治，劉渝松，漆偉，劉才英，葉承莉，唐彥

（1.重慶市中醫骨科醫院，重慶400010；2.重慶市中藥研究院，重慶400065）

·實驗研究·

正交試驗法優選四黃定痛貼提取工藝

潘傳波1，郭劍華1，郭亮1，李卿2，馬善治1，劉渝松1，漆偉1，劉才英1，葉承莉1，唐彥1

（1.重慶市中醫骨科醫院，重慶400010；2.重慶市中藥研究院，重慶400065）

目的優化四黃定痛貼提取工藝。方法采用正交試驗法，以鹽酸小檗堿為指標，考察乙醇濃度、用量、提取時間、提取次數對提取工藝的影響。結果最佳提取工藝為8倍量60%乙醇，回流提取3次，每次60 min。結論優化的提取條件穩定可行，重復性好，適用于該制劑的工業化生產。

四黃定痛貼；正交試驗；鹽酸小檗堿；驗證；提取工藝

痛風為人體內嘌呤代謝紊亂所致疾病，隨著生活方式的改變，患病率呈逐年上升趨勢，已成為一種常見病、多發病。痛風的病因主要有尿酸生成增多，排泄減少或含有易感基因3個方面，其中尿酸生成增多或排泄減少是原發性高尿酸血癥的主要病因。痛風性關節炎的急性期表現為以關節紅腫熱痛為主，病及1個或多個關節，伴發熱、舌紅、苔黃、脈數，高尿酸血癥是痛風性關節炎的主要致病原因。四黃定痛貼是我院全國名老中醫傳承工作室專家郭劍華主任中醫師依據中醫的辨證論治并結合臨床實踐，通過療效觀察，不斷對處方優化組合和劑量的配比擬訂的，由黃連、黃柏、獨活、乳香、沒藥、細辛組方，具有散寒祛濕、通經止痛功效，主要用于急性痛風性關節炎。為使其質量穩定，便于攜帶和使用，將其改良為貼劑。由于處方藥味含有生物堿類、黃酮類、樹膠、環烯醚萜苷類等化合物，結合藥理動物藥效學篩選試驗結果，擬采取藥材乙醇回流提取法進行提取工藝研究。本試驗中采用L9(34)正交試驗，以鹽酸小檗堿含量為測評指標，優化四黃定痛貼的提取工藝，為該制劑的規范化生產和臨床療效提供理論依據。

1 儀器與試藥

2010A型高效液相色譜儀(日本島津公司)；鹽酸小檗堿對照品(批號為0713－9906，含量為98.14%，中國食品藥品檢定研究院)；藥材購自重慶慧遠藥業有限公司，經重慶市中藥研究院肖銘玉副研究員鑒定，均符合2015年版《中國藥典(一部)》收載品種；乙腈、磷酸為色譜純；水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 含量測定

色譜柱：迪馬－C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈－0.03 moL/L磷酸二氫鈉－磷酸（28∶72∶0.08）；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：265 nm。

2.1.2 溶液制備

對照品溶液：取鹽酸小檗堿對照品6.24 mg，精密稱定，置100mL容量瓶中，加甲醇適量使溶解，并用甲醇定容至刻度，搖勻，作為對照品貯備溶液。精密吸取對照品貯備溶液5.0m L，置25mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

供試品溶液：照處方比例稱取藥材，按正交試驗進行提取，濾過，合并濾液，濃縮至適量，加乙醇定容至500m L，搖勻。精密量取1.0mL，置25m L容量瓶中，加甲醇適量，超聲處理15min，放冷，用甲醇定容至刻度，搖勻，用0.45μm濾膜濾過，取續濾液，即得。

缺黃連、黃柏的陰性對照品溶液：取不含黃柏的陰性樣品適量，照供試品溶液制備方法制備，得陰性對照品溶液。

2.1.3 方法學考察

專屬性考察：精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照品溶液各10μL，進樣測定。供試品溶液色譜中，在與對照品色譜相同保留時間有相應色譜峰，陰性對照品溶液色譜無相應色譜峰，表明陰性對照無干擾，目標峰與相鄰色譜峰分離度均大于1.5。色譜圖見圖1。

鑒于此，飛灰的固化穩定化技術成為國內外機構廣泛研究的課題。目前，常用的固化方法有水泥固化法、熔融固化法和藥劑固化法等。藥劑固化法是利用化學藥劑通過化學反應使有毒有害物質轉變為低溶解性、低遷移性及低毒性物質的過程。藥劑固化法流程如圖1所示。

線性關系考察：按測訂色譜條件，分別精密吸取對照品溶液2，4，8，10，16，20μL，進樣測定鹽酸小檗堿峰面積。以鹽酸小檗堿進樣量（C）為橫坐標，以相對應峰面積（A）為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程A＝2 084 472C－156 288.5，r＝0.999 9(n＝6)。結果表明，鹽酸小檗堿進樣量在0.024 496～0.244 96μg范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取鹽酸小檗堿對照品溶液10μL，連續進樣6次，測定。結果鹽酸小檗堿峰面積的RSD為0.58%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：精密吸取供試品溶液10μL，按擬訂色譜條件分別于0，1，4，8，12 h時進樣測定。結果鹽酸小檗堿峰面積的RSD為0.72%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內基本穩定。

重復性試驗：取同一批樣品6份，依法制備供試品溶液，進樣測定，記錄鹽酸小檗堿峰面積，計算樣品中鹽酸小檗堿含量。結果樣品中鹽酸小檗堿含量為4.66%，RSD為1.04%（n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密量取已知含量的同批樣品6份（鹽酸小檗堿含量為4.66%），分別加入不同濃度的鹽酸小檗堿對照品溶液適量，依法制備供試品溶液，進樣測定，計算回收率。結果鹽酸小檗堿平均回收率為98.31%，RSD為0.84%（n＝6），詳見表1。

1.鹽酸小檗堿A.對照品溶液B.供試品溶液C.陰性對照品溶液圖1高效液相色譜圖

2.2 正交試驗

2.2.1 因素水平

以提取液中的鹽酸小檗堿為考察指標，采用L9(34)正交試驗對乙醇濃度（因素A）、乙醇量（因素B）、提取時間（因素C）、提取次數（因素D）進行試驗。因素水平見表2。

表1 鹽酸小檗堿加樣回收試驗結果(n＝6)

表2 L9(34)正交試驗因素水平表

2.2.2 正交試驗結果與方差分析

試驗設計及結果見表3和表4。可見，各因素對提取效果均有影響，影響小檗堿提取因素中(C＞A＞B＞D)，最佳提取工藝為A2B2C3D1，即用8倍量60%乙醇，回流提取1次，提取60min。方差分析表明，C因素對試驗結果有顯著影響，A，B因素有一定影響，D因素無甚影響。從生產實際角度考慮，選擇用8倍量60%乙醇，回流提取3次，每次60min，即可。

表3 L9(34)正交試驗結果

表4 方差分析結果

2.2.3 提取工藝的驗證試驗

按處方比例稱取藥材，采用擬采用工藝條件提取，照正交試驗項下色譜條件測定鹽酸小檗堿含量。第1次小檗堿含量為4.67%，第2次為4.67%，第3次為4.66%。可見，正交試驗最優提取工藝中，綜合考慮，小檗堿含量較高，可作為四黃定痛貼的提取方法，即用8倍量60%乙醇，回流提取3次，每次60min，即可。

3 討論

3.1 提取溶劑選擇[1－4]

本處方中含黃連、黃柏、乳香、沒藥等多味藥材。其中，黃連、黃柏含生物堿成分，主要為小檗堿；梔子主要包括環烯醚萜苷類、二萜類(西紅花苷類)、有機酸酯類及其他類化合物；獨活根含白芷素、虎耳草素、佛手柑內酯、花椒毒素、牛防風素、異虎耳草素、異佛手柑內酯等多種呋喃香豆精類；乳香含大環二萜、四環三萜及五環三萜等多種揮發油類化學成分；沒藥含樹脂、揮發油、樹膠。提取工藝預試驗曾考察水提取法、乙醇提取法，并比較鹽酸小檗堿含量和處方浸得收率，結果表明，采用乙醇提取法鹽酸小檗堿含量較高，而處方浸膏得率相對較少，結合本處方前期藥理動物試驗和藥效學試驗結果，本處方提取工藝選用乙醇提取。

3.2 提取方法考選擇5－7]

滲漉法和熱回流提取法為乙醇提取的常用方法，該提取方法的考察以鹽酸小檗堿為檢測指標，試驗結果表明，滲漉提取法中鹽酸小檗堿含量與熱回流提取法中小檗堿含量基本接近，由于采用滲漉法提取需將藥材粉碎為一定細度，且生產過程需較長時間，從工業化大生產角度考慮，采用熱回流提取法操作更簡單，生產效率更高。故選用乙醇回流法作為提取方法。

3.3 檢測指標選擇[8－9]

黃連藥材及以黃連藥材入藥的中藥成方制劑中，其提取工藝常用單一成分作為考察指標，而黃連藥材中還含有其他多種生物堿類成分，如鹽酸藥根堿等；以黃連入藥的中藥成方制劑中由于成分更復雜，考慮的因素更多。結合文獻報道，以鹽酸小檗堿作為單一檢測指標考察黃連藥材及其入藥的中藥成方制劑，與采用多成分、多指標進行綜合評價，其所得優化提取工藝基本一致。故本試驗采用單一的鹽酸小檗堿含量作為優化提取工藝的檢測指標，正交試驗結果表明，方法簡單可行，易于操作。

3.4 色譜條件選擇[10－17]

方法，測定鹽酸小檗堿液相色譜條件，多以離子對試劑作為流動相，離子對試劑對色譜柱及色譜儀影響較大。本試驗中同時測定鹽酸小檗堿的含量，經優化色譜條件，選用乙腈－0.03moL/L磷酸二氫鈉（含0.08%磷酸）為流動相，方法簡單，實用可行，基線平穩，峰形對稱，目標峰與相鄰峰分離度良好，能用于測定制劑中鹽酸小檗堿含量。

綜上所述，該中藥復方制劑是由黃連、黃柏、獨活等多味藥材組方，為便于攜帶，將原來的湯劑制為貼劑，保持了原方療效。采用乙醇提取法進行制備，通過L9(34)正交試驗法優化工藝參數，確定各項工藝條件，工藝穩定可行，可用于工業化大生產。

參考文獻：

[1]方芳，宋英，李圓圓.正交試驗優選糖郁舒顆粒提取工藝[J].中國實驗方劑學雜志，2014，20（3）：24－27.

[2]張紅梅，程雪梅，王長虹.黃連中生物堿提取工藝的正交試驗研究[J].中國醫藥工業雜志，2008，39（8）：588－590.

[3]徐媛，張琰，劉新友.正交試驗法優選黃連中小檗堿提取工藝[J].中國中醫藥信息雜志，2011，18（5）：60－62.

[4]岑志芳，郭淑英.用正交設計法優化黃連的提取工藝研究[J].中國民族民間醫藥雜志，2009，18(12)：16－17.

[5]石偉，葉玉妹，唐英.多指標綜合加權評分法考察冬柏通淋合劑提取工藝[J].遼寧中醫雜志，2014，41（3）：530－532.

[6]譚達全，肖德華，謝誼.正交試驗優選參木腸溶膠囊提取工藝的研究[J].湖南中醫雜志，2014，30（9）：148－149.

[7]龔濤，孫冰，歐陽雪梅.黃連提取工藝的研究[J].中草藥，1998，29(7)：446－448.

[8]黃傳俊，李其蘭，高中蓉.正交試驗優選黃連提取工藝[J].中國藥師，2005，8(8)：699－670.

[9]施曉偉，劉文，陳大業.葛根芩連提取液超濾工藝優選[J].中國實驗方劑學雜志，2014，20（7）：19－22.

[10]李紅玲，莫炫永.HPLC法同時測定川黃柏中鹽酸黃柏堿和鹽酸小檗堿的含量[J].中國藥房，2014，25（27）：2562－2564.

[11]莫國棟，楊瑾，梅全喜.消炎止癢洗劑中藥材的提取方法研究[J].中國藥房，2013，24（31）：2920－2922.

[12]李穎梅，衛峰，王志威.復方蒲芩片中鹽酸小檗堿的HPLC法測定[J].中國醫藥工業雜志，2014，45（2）：161－163.

[13]王洪明，許學麗.HPLC法測定頸復康顆粒中鹽酸小檗堿的含量[J].中國藥房，2013，24（48）：4586－4588.

[14]劉堅初，林麗，強姣.多指標正交試驗優選連芩軟膏的提取工藝[J].中國藥業，2014，23（14）：64－66.

[15]師永清，康淑荷，王愛軍.HPLC法同時測定黃連雙清丸中梔子苷、芍藥苷、鹽酸小檗堿、鹽酸小檗堿和大黃素的含量[J].藥物分析雜志，2013，33（9）：1612－1616.

[16]黃鐵花，胡松，張耕.HPLC法同時測定復方黃松洗液中鹽酸小檗堿和醋酸氯己定的含量[J].中國藥房，2013，24（39）：3709－3711.

[17]游元元，王天志，陳璐.草連生物堿成分的研究[J].華西藥學雜志，2005，20(6)：505－506.

Extraction Technology Op tim ization of Sihuang Dingtong Patch by O rthogonal Test

Pan Chuanbo1,Guo Jianhua1,Guo Liang1,Li Qing2,Ma Shanzhi1,Liu Yusong1,Qi Wei1,Liu Caiying1,Ye Chengli1,Tang Yan1
(1.Chongqing traditional Chinese medicine orthopaedics hospital,Chongqing,China 400010; 2.Chongqing Academy of Chinese Materia Medica,Chongqing,China 400065)

Objective To optimize the extraction technology of Sihuang Dingtong Patch.M ethods The orthogonal test was performed to investigate the effects of ethanol concentration,ethanol amount,extraction times and extraction time on the extraction results with the content of berberine hydrochloride as the evaluation index.Resu lts The best optimum conditions were as follows:the amount of ethanol 8 times,60%was used as the extraction solvent,extraction times 3 times and the extraction duration for each time was 60 min.Conclusion The optimized extraction technology of Sihuang Dingtong Patch is stable,feasible and reproducible,which can apply to the production of Sihuang Dingtong Patch.

Sihuang Dingtong Patch;orthogonal test;berberine hydrochloride;verification;extraction technology

TQ460.6

A

1006－4931(2017)09－0013－04

2017－01－10；

2017－02－18)

10.3969/j.issn.1006－4931.2017.09.004

重慶市衛生和計生委中醫藥科技項目[ZY20150227]。

潘傳波，男，碩士研究生，副主任醫師，研究方向為公共衛生服務與衛生事業管理，（電話）023－63930833（電子信箱）panchbo＠tom.com。