高效液相色譜法測定補腎養血顆粒中二苯乙烯苷含量

徐沖，劉霞，范智琴，楊敏

（重慶市中醫院藥劑科，重慶400021）

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高效液相色譜法測定補腎養血顆粒中二苯乙烯苷含量

徐沖，劉霞，范智琴，楊敏

（重慶市中醫院藥劑科，重慶400021）

目的建立測定補腎養血顆粒中二苯乙烯苷含量的高效液相色譜法。方法色譜柱采用Phenomenex Gemini5u C18柱（250 mm× 4.6 mm，5 m），流動相為乙腈－水（18∶82），流速為1.0 m L/min，檢測波長為320 nm，柱溫為25℃。結果二苯乙烯苷進樣量在0.288～2.304 g范圍內與峰面積積分值線性關系良好（r＝0.999 6），平均回收率為96.27%，RSD為1.20%（n＝9）。結論該方法測定結果準確、穩定，重復性好，簡便易行，可用于該制劑中二苯乙烯苷的含量測定。

補腎養血顆粒；二苯乙烯苷；含量測定；高效液相色譜法

補腎養血顆粒為我院自制制劑，由制何首烏、熟地黃、菟絲子、桑葚等19味中藥組方，具有補腎養血、烏發生發、填精補腦的功效，用于肝腎不足、氣血兩虛或脾虛生濕所致的脫發，癥見毛發松動或呈稀疏狀脫落、毛發干燥或油膩、頭皮瘙癢，或斑禿、早禿、脂溢性脫發與病后、產后脫發見上述證候者[1]。該方以湯劑形式在我院臨床應用10余年，療效確切，且安全可靠。為方便患者服用，我院擬將其開發為顆粒劑，為進一步提高該制劑質量的可控性和穩定性，保證臨床用藥安全，根據2015年版《中國藥典（一部）》及文獻[2－5]，本研究中采用高效液相色譜(HPLC)法測定該制劑中二苯乙烯苷含量，經方法學驗證，操作簡便，專屬性強，重復性好，且陰性對照無干擾?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent－1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；AE－200型電子天平（天津Mettler公司），JA3003J型電子密度天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；ZNHW－Ⅱ型智能恒溫電熱套（河南愛博特公司）；KQ3200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

二苯乙烯苷對照品（化學名為2，3，5，4′－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷，中國食品藥品檢定研究院，批號為110844－201411）；補腎養血顆粒（醫院自制制劑，批號分別為20150513，20150514，20150515）；乙腈、甲醇均為色譜純；水為純化水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：PhenomenexGemini5u C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈－水（18∶82）；流速：1.0 m L/min；檢測波長：320 nm；柱溫：25℃；進樣量：10μL。理論板數按二苯乙烯苷峰計算應不低于2 000。

2.2 溶液制備

對照品溶液：稱取二苯乙烯苷對照品適量，精密稱定，加稀乙醇制成每1m L含二苯乙烯苷0.36 mg的溶液，即得。

供試品溶液：取本品約15 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 m L，稱定質量，加熱回流30min，放冷，再稱定質量，用稀乙醇補足減失的質量，搖勻，靜置，取上清液濾過，取續濾液，即得。

陰性對照品溶液：按處方量并以相同工藝制備不含二苯乙烯苷的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

系統適用性與陰性干擾試驗：將對照品溶液、供試品溶液和陰性對照品溶液在擬訂色譜條件下進樣測定。結果所測成分與樣品中其他組分色譜峰基線分離，陰性對照無干擾。色譜圖見圖1。

1.二苯乙烯苷A.對照品溶液B.供試品溶液C.陰性對照品溶液圖1高效液相色譜圖

線性關系考察：精密吸取對照品溶液0.2，0.4，0.8，1.2，1.6m L，置5m L容量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻。按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以進樣量（X，μg）為橫坐標、峰面積積分值（Y）為縱坐標，繪制標準曲線。得二苯乙烯苷回歸方程Y＝3 146X＋40.947，r＝0.999 6（n＝5）。結果表明，二苯乙烯苷在0.288～2.304μg范圍內與峰面積積分值線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取同一對照品溶液10μL，連續進樣6次，測定峰面積。結果二苯乙烯苷峰面積的RSD為0.83%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液，分別于0，2，4，8，12 h時進樣10μL，測定，記錄峰面積。結果二苯乙烯苷峰面積的RSD為0.91%（n＝5），表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

重復性試驗：取同一批（批號為20150513）樣品，分別依法制備供試品溶液6份并測定含量。結果二苯乙烯苷的RSD為1.02%（n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：稱取已知含量的同一批（批號為20150513，含量為1.680 mg/g）樣品約0.5 g，精密稱定，共9份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入0.36mg/g二苯乙烯苷對照品溶液1.8，2.4，2.8 mL，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，計算回收率。結果見表1。

表1 二苯乙烯苷加樣回收試驗結果（n＝9）

2.4 樣品含量測定

取3批樣品（批號分別為20150513，20150514，20150515），按擬訂方法測定含量，測得二苯乙烯苷含量分別為1.68，1.57，1.74mg/g。

3 討論

3.1 檢測指標成分選擇

補腎養血顆粒為我院自制制劑，由制何首烏、熟地黃、菟絲子、桑葚等組方。方中制何首烏具有補肝腎、益精血、烏須發、強筋骨之功效，《本草綱目》謂“何首烏……，能養血益肝，固精益腎，健筋骨，烏髭發，為滋補良藥，不寒不燥，功在地黃、天門冬諸藥之上”，故為君藥。制何首烏主要含有蒽醌類、黃酮類、二苯乙烯苷類、磷脂類、多糖類等化合物[6－8]，其中二苯乙烯苷是制何首烏的主要藥效成分之一，具有抗氧化、清除自由基作用，還有較好的抗腫瘤、調血脂、抗動脈粥樣硬化作用，保護肝臟、舒張血管、抗衰老和防治老年癡呆等作用[9]。故選擇二苯乙烯苷作為含量測定的指標成分。

3.2 流動相選擇

曾考察了甲醇－水（25∶75）、乙腈－水（18∶82）、乙腈－0.1%磷酸水（18∶82）等不同流動相系統，結果發現，采用乙腈－水（18∶82）為流動相時分離較好，且柱效較高，故流動相選乙腈－水（18∶82）。

3.3 提取方法選擇

分別考察了稀乙醇作為溶劑超聲提取和加熱回流提取30min方式處理樣品，結果稀乙醇加熱回流提取30min二苯乙烯苷的含量高于超聲提取，故選取加熱回流30min。

參考文獻：

[1]范智琴.梅花針配合中藥治療脫發80例[J].實用中醫藥雜志，2005，21(9)：539.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京：中國醫藥科技出版社，2015：176.

[3]王紅，楊慈海，宋軍.高效液相色譜法測定補腦安神片中二苯乙烯苷含量[J].中國藥業，2016，25(16)：72－74.

[4]高艷彬.生血寶合劑中二苯乙烯苷的含量測定[J].中國藥業，2014，23(16)：45－46.

[5]朱蘭蘭，遲雪潔，孫蓉.益腎烏發口服液中二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚的含量測定[J].中國藥物警戒，2011，8(5)： 281－283.

[6]蔡麗芬，鐘國躍，張倩，等.HPLC測定不同生長年限及采收期何首烏中二苯乙烯苷和蒽醌類成分的含量[J].中國中藥雜志，2010，35(10)：1221－1225.

[7]王亭，龔千鋒.何首烏炮制后化學成分及藥理作用的研究進展[J].中國實驗方劑學雜志，2017，23(2):220－226.

[8]高淑紅，蘇珍枝，肖學鳳.制首烏化學成分及藥理作用研究進展[J].山西中醫學院學報，2012，13(2)：74－77.

[9]汪姣.何首烏中二苯乙烯苷的現代研究[J].中國社區醫師：醫學專業，2011，13(31)：17－18.

Content Determ ination of Stilbene G lucoside in Bushen Yangxue G ranu les by HPLC

Xu Chong,Liu Xia,Fan Zhiqin,Yang Min
(Chongqing Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine,Chongqing,China 400021)

Objective To establish an HPLC method for the content determination of stilbene glucoside in Bushen Yangxue Granules.M ethods The method was achieved on Phenomenex Gemini 5u C18column(250 mm×4.6 mm,5μm)using acetonitrile－water(18∶82)as mobile phase at a flow rate of 1.0 m L/min,and the detection wavelength was 320 nm,the column temperature was 25℃.Resu lts Stilbene glucoside showed good linear relationship in the range of 0.288－2.304μg(r＝0.999 6).The average recovery rate was 96.27%,RSD＝1.20(n＝9).Conclusion The method is sensitive,accurate and reproducible,which can be used to determine the content of stilbene glucoside in Bushen Yangxue Granules.

Bushen Yangxue Granules;stilbene glucoside;content determination;HPLC

R284.1

A

1006－4931(2017)09－0020－03

2017－02－29)

10.3969/j.issn.1006－4931.2017.09.006

國家中藥炮制技術傳承基地項目[國中醫藥科技〔2015〕111號]；重慶市科委基本科研業務費計劃項目[cstc2015 jbky330025009]；重慶市科委科技平臺與基地建設（內設機構法人化改革)[cstc2015pt－kjyfsf0019]。

徐沖（1982－），男，主管中藥師，研究方向為中藥藥效物質基礎與活性評價，（電話）023－67063732（電子信箱）loran587＠aliyun.com。

楊敏（1969－），男，主任中藥師，研究方向為中藥炮制與制劑，（電話）023－67063732（電子信箱）cqyangmin＠126.com。