生物法生產25—羥基維生素D3條件優化

付躍 李連威 張陽陽

摘要[目的]優化25-羥基維生素D3[25（OH）VD3]的轉化條件，提高25（OH）VD3產量。[方法]通過單因素試驗和正交試驗對菌株UV-FY-141轉化生產25（OH）VD3的條件進行優化。[結果]確定其最佳發酵培養基：葡萄糖15.00 g，蛋白胨20.00 g，NaCl 5.00 g，CaCO3 2.00 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，去離子水1 000 mL。優化后轉化條件：發酵初始pH 6.5，發酵溫度為28 ℃，發酵時搖床轉速為200 r/min，發酵時間為72 h。在優化條件下，25（OH）VD3產量由原來的9.460 mg/L提高到13.130 mg/L，提高了38.79%。[結論]采用優化后的轉化條件，可顯著提高25（OH）VD3的產量。

關鍵詞 25-羥基維生素D3；優化；發酵

中圖分類號 R914.5 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）02-0007-04

Abstract[Objective] The aim was to optimize the conversion efficiency of 25（OH）VD3.[Method]We optimized fermentation conditions of strain UVFY141 by single factor and orthogonal experiment.[Result] The optimum fermentation conditions were determined as follows：glucose 15.00 g，peptone 20.00 g，NaCl 5.00 g，CaCO3 2.00 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，and deionized water 1 000 mL.Conversion conditions were determined as follows：initial pH 6.5，fermentation temperature 28 ℃，rotation speed 200 r/min，fermentation time 72 h.The production of 25（OH）VD3 was improved by 38.79%，from 9.460 mg/L to 13.130 mg/L.[Conclusion] The optimized conditions can improve the yield of 25（OH）VD3 significantly.

Key words 25（OH）VD3；Opitimization；Fermentation

維生素D3（VD3）在人體內是沒有活性的，只有轉化成有活性的代謝產物才能發揮作用。維生素D3的活性衍生物主要有骨化二醇、骨化三醇等。維生素D3首先在肝臟轉化成骨化二醇，然后在腎臟中轉化成骨化三醇[1]，其中骨化二醇是血液中主要存在形式，骨化三醇是最有活性的代謝衍生物[2]。25-羥基維生素D3[25（OH）VD3]，又稱骨化二醇，是通過人體內的VD3羥化酶轉化而來的[3-4]，對光、空氣、熱敏感，不溶于水，易溶于乙醇等極性有機溶劑[5]。骨化二醇臨床上用于治療甲狀腺功能衰退、骨質疏松、牛皮癬、慢性腎功能衰竭[1]。骨化二醇能夠化學合成，但是步驟復雜，成本高，相對于化學合成，生物轉化具有明顯優勢。研究表明，一些微生物能夠將維生素D3轉化成骨化二醇和骨化三醇，步驟簡單，成本低[6]。生物轉化速率不僅受微生物培養組分、培養過程的影響，而且受培養條件（pH、溫度等）的影響[7] 。發酵條件的優化對生物轉化生產VD3十分重要。筆者采用單因素試驗和正交試驗對生物法合成25（OH）VD3條件進行了優化，旨在為提高VD3的轉化率提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種。

放線菌UV-FY-141：廣西大學生命科學與技術學院食品與發酵研究所保存。

1.1.2 試驗藥劑。維生素D3（分析純）、25-羥基維生素D3（分析純），美國Sigma公司；氯化鈉（分析純），天津博迪化工有限公司。

1.1.3 培養基。

斜面培養基：可溶性淀粉20.00 g，硝酸鉀1.00 g，NaCl 0.50 g，磷酸氫二鉀0.50 g，MgSO4·7H2O 0.50 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，去離子水1 000 mL。種子培養基：葡萄糖15.00 g，蛋白胨15.00 g，玉米漿干粉5.00 g，NaCl 5.00 g，CaCO3 2.00 g，去離子水1 000 mL，pH 7.0。發酵培養基：葡萄糖15.00 g，植物用大豆蛋白胨15.00 g，玉米漿干粉5.00 g，NaCl 5.00 g，CaCO3 2.00 g，去離子水1 000 mL，pH 7.0。

1.1.4 儀器。

EBA21型高速離心機，Hettich zentrifugen公司；YP1200型電子天平，上海精科實業有限公司；島津10-AT高效液相色譜儀，日本島津有限公司；UV1601紫外分光光度計，日本Shimadiu公司；依利特Hypersil C18 色譜柱（4.60 mm×250.00 mm，5 μm），美國熱電公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化。

從-80 ℃冰箱中取出甘油保藏的菌種UV-FY-141，接種到裝液量為50.00 mL的250.00 mL三角瓶中，28 ℃、180 r/min培養7～15 d；細菌活化好后梯度稀釋，涂平板，在28 ℃生化培養箱中培養7 d；用接種環挑取單菌落，接種到斜面培養基；在28 ℃生化培養箱中培養7 d，-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 孢子溶液的制備。

從-20 ℃冰箱中取出斜面，滅菌15～20 min，用5.00 mL移液槍向斜面加滅菌去離子水10.00 mL，用接種環輕輕刮下孢子，用移液槍反復吹打后轉移到裝有玻璃珠的50.00 mL三角瓶中，28 ℃、180 r/min振蕩30 min，打散孢子，然后4層紗布過濾，制備孢子懸液。

1.2.3 發酵。用移液槍吸取1.00 mL孢子懸液接種到種子培養基中，28 ℃、180 r/min培養48 h，吸取1.00 mL種子液接種到發酵培養基中，48 h后向發酵培養基中加入用無菌濾膜過濾的反應底物，相同條件下繼續培養72 h。

1.2.4 發酵條件優化。

為了提高25（OH）VD3的產量，對發酵條件進行優化，主要優化碳源、氮源、無機鹽離子、初始pH、溫度和轉速。控制其他條件不變，只改變其中1個條件逐步優化。優化完成后，選擇對發酵影響顯著的單因素進行正交試驗，選擇最優條件。

1.2.5 供試品的制備。

采用Bligh-Dyer法[8]制備供試品。發酵結束后取1.00 mL發酵液于離心管中，每個樣品中加入3.75 mL氯仿和甲醇的混合溶液（1∶2，V/V），振蕩混勻后再向其中加入1.25 mL氯仿溶液，振蕩混勻，此時會看到大量絮狀沉淀，然后加入1.25 mL純水，振蕩混勻，此時會看到溶液分層；6 000 r/min離心5 min。取1.00 mL下層溶液于離心管中，旋轉蒸發儀干燥。檢測時用乙腈溶解，并用無菌濾膜過濾。

1.2.6 標準溶液的制備。

稱25（OH）VD3標準品1 mg，溶解于10.00 mL無水乙醇中，配制成100 μg/mL母液。稀釋母液為20、40、60、80、100 μg/mL梯度濃度標準液。

1.2.7 檢測條件。

采用依利特Hypersil C18色譜柱（4.60 mm×250.00 mm，5 μm），流動相為乙腈-水（80∶20，V/V），流速為1 mL/min，柱溫設為50 ℃，檢測波長為265 nm。

2 結果與分析

2.1 碳源對25（OH）VD3產量的影響

碳源是一類能夠提供碳素化合物的營養物質，能夠為微生物新陳代謝提供生命活動所需的能量，提供細胞或合成產物的物質基礎。選擇可溶性淀粉、葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖5種碳源按2%的添加量加入到培養基中進行單因素試驗。由圖1可知，以葡萄糖為碳源時，25（OH）VD3的產量最高，所以選擇葡萄糖作為發酵過程中的碳源。

選擇合適的碳源濃度進行試驗。由圖2可知，在一定濃度范圍內25（OH）VD3 的產量隨著葡萄糖濃度升高而升高，超過一定濃度后產量下降，當葡萄糖濃度為2%時25（OH）VD3產量最高，所以發酵濃度選擇2%。

2.2 氮源對25（OH）VD3產量的影響

氮源也是微生物生長和合成產物的重要物質。選擇酵母膏、蛋白胨、玉米漿干粉、KNO3、NH4Cl進行試驗，添加量為2%。由圖3可知，蛋白胨對發酵影響顯著。因此，對蛋白胨的濃度進行優化。由圖4可知，25（OH）VD3產量隨蛋白胨濃度的增加先升高后降低，在蛋白胨濃度為3%時達到最大值。因此，發酵培養基中蛋白胨濃度選擇3%。

2.3 無機鹽離子對25（OH）VD3產量的影響

無機鹽離子對微生物生長和產物合成也十分重要。它們或者是酶活性中心組成成分，或者參與維持大分子和細胞結構的穩定性，調節滲透壓平衡，控制細胞的氧化還原電位，或者作為微生物生長的能源物質。微生物生產代謝所需要的無機鹽一般包括磷酸鹽、硫酸鹽、氯化物及含有鈉、鉀、鈣、鎂、鐵等金屬元素的化合物。研究CaCO3、MeSO4·7H2O、NaCl、K2HPO4、CaCl2對25（OH）VD3產量的影響。由圖5可知，NaCl、CaCO3對發酵影響顯著。因此，對該2種無機鹽離子的濃度進行研究。由圖6可知，25（OH）VD3的產量隨著CaCO3濃度的升高先升高后降低，當CaCO3濃度為0.2%時25（OH）VD3產量最高；當NaCl濃度為0.5%時25（OH）VD3產量最高。因此，2種無機鹽離子及其濃度分別選擇0.5%NaCl和0.2%CaCO3。

2.4 發酵培養基組分的正交試驗結果

通過單因素試驗發現，葡萄糖、蛋白胨和CaCO3的濃度對25（OH）VD3產量影響顯著，因此，選擇這3個單因素進行L9（34）正交試驗，每組試驗設3個平行（表1）。

由表2可知，在試驗2的條件下，25（OH）VD3的產量最高，為11.130 mg/L，此時發酵培養基中營養成分的配比為葡萄糖1.50%、蛋白胨3.00%、CaCO3 0.20%。在上述條件下重復試驗，試驗結果與試驗2結果基本一致，所以培養基的最佳配比為A1B2C2。極差值RA>RB>RC，所以3個因素對25（OH）VD3產量影響大小排序為葡萄糖、蛋白胨、CaCO3。

方差分析表明，FA>FB> F0.95（2，2）>FC，表明葡萄糖和蛋白胨對25（OH）VD3產量影響顯著，CaCO3影響不顯著。

2.5 初始pH對25（OH）VD3產量的影響

微生物生長需要適宜的環境，其中pH是一項重要的因素。pH能夠改變蛋白質、核酸等生物大分子所帶電荷，可引起細胞膜的電荷變化，改變微生物細胞吸收和利用營養物質的能力。不同微生物對pH的要求各不相同，因此，選擇合適的pH對微生物發酵具有重要意義。研究初始pH 5、6、7、8、9對25（OH）VD3產量的影響，由圖7可知，25（OH）VD3的產量隨著初始pH的升高而先升高后降低，當pH為7時25（OH）VD3產量最高， 所以發酵時選擇pH 7。

2.6 溫度對25（OH）VD3產量的影響

溫度是微生物生長的重要因素之一，不僅可以影響酶活性，改變酶的反應速率，還能夠影響細胞膜的流動性，改變物質的運輸能力，從而影響營養物質的吸收與代謝產物的分泌。研究發酵溫度26、28、30、32、34 ℃對25（OH）VD3產量的影響，由圖8可知，在一定溫度范圍內，25（OH）VD3的產量隨溫度的升高而升高，超過一定范圍，隨溫度的升高而降低。溫度對產物產量的影響主要通過影響酶的活性來實現，同時溫度的高低還會影響細胞膜的通透性，當溫度適合時細胞膜的通透性增強，可以使更多的反應底物通過細胞膜，當溫度為28 ℃時25（OH）VD3的產量最高，確定發酵溫度為28 ℃。

2.7 搖床轉速對25（OH）VD3產量的影響

搖床轉速與三角瓶中的溶氧量有直接關系，主要通過溶氧量來影響發酵，轉速較慢時，發酵液中的溶氧量少，不利于細菌發酵，如果過快則對細菌損傷大，也不利于發酵。研究轉速140、160、180、200、220 r/min對25（OH）VD3產量的影響，由圖9可知，當搖床轉速為200 r/min時，25（OH）VD3的產量最高。分析原因，當搖床轉速為200 r/min時，搖瓶中的容氧量充足，機械碰撞對菌體的損傷相對較小，兩者達到平衡，有利于產物的合成。因此，選擇200 r/min為發酵時的搖床轉速。

2.8 發酵時間對25（OH）VD3產量的影響

發酵時間對產物合成的影響也十分顯著，因為隨著發酵時間的延長，菌體的狀態、培養基組分、pH等都會發生變化，因此，對發酵時間進行優化十分必要。加入底物后，每隔12 h測1次產量，記錄12、24、36、48、60、72、84、96 h的產量。由圖10可知，加入反應底物后，25（OH）VD3的產量開始升高，60 h后產量基本穩定，所以確定發酵時間為60 h，與原來發酵時間相比，發酵時間縮短了12 h。

2.9 轉化條件正交試驗結果

經過單因素試驗發現，初始pH、發酵溫度和搖床轉速3個因素對25（OH）VD3的產量影響顯著，因此，選擇這3個單因素進行L9（34）正交試驗，每組試驗設3個平行（表3）。

由表4可知，在試驗2的條件下，25（OH）VD3的產量最高，為13.130 mg/L左右，此時轉化條件的3個因素為：pH 6.5，發酵溫度為28 ℃，轉速為200 r/min。在上述條件下重復試驗，試驗結果與試驗2結果基本一致，所以培養基的最佳配比為A1B2C2。極差值RA>RB>RC，所以3個因素對25（OH）VD3產量影響大小排序為pH、發酵溫度、搖床轉速。

方差分析表明，FA >F0.95（2，2）>FB>FC。因此，pH對25（OH）VD3產量影響顯著，溫度和轉速影響不顯著。

3 結論

通過單因素試驗和正交試驗對發酵培養基和轉化條件進行優化，確定發酵培養基的組成：葡萄糖15.00 g，蛋白胨20.00 g，NaCl 5.00 g，CaCO3 2.00 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，去離子水1 000 mL。優化后轉化條件：發酵初始pH為6.5，發酵溫度為28 ℃，搖床轉速為200 r/min，發酵時間為72 h。優化后，25（OH）VD3產量由原來的9.46 mg/L提高到13.13 mg/L，提高了38.79%。

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