枯草芽孢桿菌發酵米糠制備活性肽及其抗氧化性評價

羅斌 邱波 謝作樺

摘要[目的]研究枯草芽孢桿菌發酵米糠中蛋白多肽的水解度和抗氧化活性，為米糠的高值化綜合利用提供技術參考。[方法]以枯草芽孢桿菌為菌種，研究米糠發酵制備活性肽的條件，并對活性肽的抗氧化活性進行評價。[結果] 當枯草芽孢桿菌接種量5%、發酵時間48 h、發酵溫度36 ℃、pH 8時，米糠發酵液中水解度較高，達到了21.74%。枯草芽孢桿菌發酵制備的米糠活性肽具有較強的清除DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基的能力。此外，米糠活性肽分子量主要分布在100～5 000 Da，富含天冬氨酸和谷氨酸，并包含了6種人體必需氨基酸。[結論]枯草芽孢桿菌發酵具有提高米糠功能特性的潛力，可為米糠的高值化利用提供參考。

關鍵詞 米糠；枯草芽孢桿菌；發酵；多肽；抗氧化性

中圖分類號 TS21 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）02-0122-03

Abstract[Objective] To study the degree of hydrolysis and antioxidant properties of bioactive peptide from rice bran fermented with Bacillus subtilis， which can apply a new method of comprehensive utilization of rice bran.[Method] B.subtilis was used to prepare active peptide and to evaluate the antioxidant activity of active peptide.[Result] The results showed that the degree of hydrolysis in the fermented solution was as high as 21.74%，when B.subtilis content was 5%，fermented time was 48 h，temperature was 36 ℃ and pH was 8.The peptide of rice bran showed excellent antioxidant properties including clearance abilities of DPPH radical，hydroxyl free radical and superoxide radical.The molecular weight of active peptides from rice bran was mainly distributed in 100-5 000 Da.The peptide included Asp and Glu，as well as six kinds of human essential amino acids.[Conclusion] Fermentation with B.subtilis is potential to improve the functional properties and helpful to increase the value of rice bran.

Key words Rice bran；Bacillus subtilis；Fermentation；Peptide；Antioxidant properties

我國是稻谷生產大國，年產量約為1.85億t[1]。米糠是稻谷經碾米加工生產精米過程中的主要副產物，占稻谷整體重量的9%左右[2]。米糠含有大量的營養成分，如蛋白質、水溶性多糖、膳食纖維、礦物質、維生素等[3-4]。其中，蛋白質占米糠重量的16%～18%，其氨基酸組成接近聯合國糧農組織/世界衛生組織（FAO/WHO）的推薦模式[5]。然而，目前我國的米糠資源利用率低，大部分仍作為飼料，甚至直接被丟棄，造成了資源的浪費和環境污染[1]。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一種革蘭氏染色陽性菌，常作為生物發酵劑用于豆類蛋白質水解制備氨基酸、多肽和氨類化合物[6-7]。然而，目前鮮有報道將枯草芽孢桿菌用于發酵米糠制備多肽。基于米糠的利用現狀和枯草芽孢桿菌水解蛋白的特性，筆者利用枯草芽孢桿菌發酵米糠制備抗氧化肽，以期提高米糠的附加值，為米糠的高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料。枯草芽孢桿菌，中國工業微生物菌種保藏管理中心；米糠，來自當地一家大米加工廠，蛋白質含量15.78%，脂肪含量17.84%，水分含量8.24%，灰分含量9.07%。

1.1.2 主要試劑。

DPPH，希格瑪公司；鄰二氮菲、鄰苯三酚，國藥集團化學試劑有限公司；鹽酸等試劑，均為分析純，天津市大茂化學試劑廠。

1.1.3 主要儀器。生化培養箱，上海躍進醫療器械廠；pH計，梅特勒-托利多儀器有限公司；可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 發酵菌株種子液的制備。將2環活化的菌種接入50 mL種子培養基（蛋白胨1.0%，酵母浸出物0.5%，氯化鈉1.0%）中，37 ℃，120 r/min，培養24 h。

1.2.2 米糠發酵。

以發酵液的水解度為評價指標，研究接種量、發酵時間、發酵溫度和pH對米糠發酵制備活性肽的影響。將適量種子液接種至發酵液中，在一定的溫度下培養一定時間后，取發酵液進行水解度測定。研究某一變量時，其他因素的條件為接種量5%、發酵時間48 h、發酵溫度36 ℃、pH 8。

水解度的測定：通過溶液中游離氨基含量的測定來計算水解度，游離氨基采用TNBS法進行測定[8]。

水解度DH=（Lt-L0）/（ Lmax-L0）×100%

式中，Lt表示發酵一段時間后發酵液中的游離氨基含量；L0表示發酵前溶液中的游離氨基含量；Lmax表示米糠中蛋白完全水解后溶液的游離氨基含量。

1.2.3 米糠活性肽的制備。

將發酵液于4 000 r/min下離心30 min，上清液再進行過濾，凍干后即得到米糠活性肽粉末。

1.2.4 米糠活性肽抗氧化性的測定。

通過考察米糠活性肽對DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基的清除能力，對米糠多肽的抗氧化性進行評價，測定方法參照李艷紅[9]的報道。

1.2.5 米糠抗氧化肽氨基酸組成測定。

取10 mg大豆多肽粉末，用10 mL 6 mol/L HCl于120 ℃水解24 h，然后用氨基酸自動分析儀進行檢測。

2 結果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌接種量對米糠發酵產物水解度的影響

由圖1可見，隨著枯草芽孢桿菌接種量的增大，米糠發酵產物水解度先增大后趨于平緩，當接種量達到5%后，水解度無顯著性增長，原因可能是米糠中能被利用的蛋白質已基本上被枯草芽孢桿菌分泌的酶系水解，所以接種量相對米糠達到飽和后再進一步增大，不會起到增加體系水解度的效果。

2.2 發酵時間對枯草芽孢桿菌發酵米糠產物水解度的影響

由圖2可見，隨著發酵時間的增加，米糠發酵產物水解度起初顯著增長，當發酵時間達到48 h后，水解度達到最大值，發酵時間進一步延長對水解度沒有明顯的影響。發酵后期水解度趨于平緩的原因可能是枯草芽孢桿菌逐步衰亡，分泌的水解酶很少；此外，發酵后期發酵體系的整體環境不利于酶的水解。

2.3 發酵溫度對枯草芽孢桿菌發酵米糠產物水解度的影響

由圖3可見，隨著發酵溫度的升高，發酵液的水解度呈現先增大后減小的趨勢，當發酵溫度為36 ℃時，發酵液中水解度達到最大值。可能的原因是在此溫度下，枯草芽孢桿菌的生長速度最快，分泌的蛋白質水解酶最多，因而米糠發酵液中蛋白降解物最多，即水解度值最大。

2.4 pH對枯草芽孢桿菌發酵米糠產物水解度的影響

由圖4可見，在pH 6～10時，發酵液水解度隨著pH的增加呈現了先增加后降低的趨勢，當pH為8時，發酵液的水解度達到最大。此結果可能與枯草芽孢桿菌的最適生長酸堿度和蛋白酶酶解的最適pH有關。

基于上述因素對枯草芽孢桿菌發酵米糠產活性肽的影響結果，該試驗選定枯草芽孢桿菌接種量5%、發酵時間48 h、發酵溫度36 ℃和pH 8用于枯草芽孢桿菌發酵制備米糠活性肽的工藝條件，經過再次試驗，確定在此條件下，發酵液中的水解度為21.74%。此外，該試驗在此工藝基礎上，對制備得到的米糠活性肽抗氧化活性和氨基酸組成進行評價。

2.5 米糠活性肽的抗氧化活性評價

試驗得出，米糠活性肽具有較好的抗氧化活性，其中清除DPPH自由基能力的IC50值為7.53 mg/mL，清除羥自由基能力的IC50值為6.48 mg/mL，清除超氧陰離子自由基能力的IC50值為5.74 mg/mL。因此，枯草芽孢桿菌發酵可作為一種制備米糠抗氧化肽的有效手段。

2.6 米糠活性肽的分子量分布

多肽的分子量分布是影響其活性發揮的重要因素，通過高效液相色譜確定的不同標準肽的出峰時間、面積，以分子量的對數（lnMw）對保留時間作圖得到分子量校正曲線方程，如Y=-4.376 8X+45.841，R2=0.989 2。通過高效液相色譜圖（圖5）可知，米糠活性肽分子量在1 000～5 000 Da的組分占85.30%，分子量在100～1 000 Da的組分占14.70%。

2.7 米糠活性肽的氨基酸組成

多肽的氨基酸組成和含量是影響其活性發揮的重要因素，如Adebiyi等[10-11]研究結果表明，米糠蛋白酶解物的氨基酸組成與其抗氧化活性有很大的相關性；劉志國等[12]則報道米糠ACE抑制肽活性可能與C端的苯環結構有關。該試驗采用枯草芽孢桿菌制備的米糠活性肽富含天冬氨酸和谷氨酸。此外，米糠活性肽氨基酸組成豐富，含有6種人體必需氨基酸，分別為蛋氨酸、亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸和異亮氨酸（表1）。由此可見，米糠活性肽是一種良好的營養補充劑。

3 結論

該試驗研究了枯草芽孢桿菌發酵因素對發酵液水解度

的影響，隨著接種量和發酵時間的延長，發酵液水解度先增加后趨于平緩；隨著發酵溫度和pH的增加，發酵液水解度呈先增加后減少的趨勢。在枯草芽孢桿菌接種量5%、發酵時間48 h、發酵溫度36 ℃和pH 8的發酵條件下，發酵液水解度達到了21.74%。枯草芽孢桿菌發酵制備的米糠活性肽分子量主要分布在100～5 000 Da，富含天冬氨酸和谷氨酸，包含了6種人體必需氨基酸，且具有較強的清除DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基的能力，是一種頗具潛力的活性肽營養補充劑。

參考文獻

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