混合藻體溶液中藻體濃度檢測方法優化的研究

馮唐鍇++江雪++王炳山++蔡新安++張耀++付金梅

摘 要：文章試圖聯用分光光度法和干重法，優化水中混合藻體生物量的檢測方法，為自然水域混合藻體生物量監控提供有效措施。文章主要研究了混合藻體溶液可見光最大吸收峰值波長的測定方法、沉降時間對藻體溶液吸光值的影響，以及初步建立了混合藻體溶液“吸光值-干重”相關性的線性方程。

關鍵詞：分光光度法；藻體；濃度；干重；吸光值

中圖分類號：X832 文獻標志碼：A 文章編號：2095-2945（2017）20-0020-02

前言

大量有害藻體在水中堆積生長并死亡后，會產生有害藻毒素、降低水的氧容量、散發硫化氫等有毒氣體給水體帶來異味、細菌大量繁殖、水生動植物死亡、甚至產生致癌物危害水體安全[1]。因此，污水中藻體含量的檢測對水體富營養化污染監控有重要意義。水體藻類生物量檢測的基本方法有分光光度法、干重法、細胞計數法等[2]。目前水中藻類生物量檢測的研究，多使用單一藻類為研究對象。但天然水體中是混合藻體，因此單一藻類檢測結果并不見得適用于自然水體中藻類含量的檢測。有文章[3]提到使用改良的細胞計數法測定自然水體中混合藻類的生物量。受此啟發，本文設計實驗了分光光度法配合干重法探索溶液中混合藻體生物量的檢測方法，希望利用這種檢測方法能夠更加快速便捷的檢測自然水體中總藻的含量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 混合藻體溶液的配置

本文所用的含混合藻體的水樣是從景德鎮學院生物與園林實訓基地的蓄水池中取得的水樣，將該水樣接種至人工藻體培養液進行擴大培養，然后經過高鹽除蟲、蒸餾水清洗并濃縮富集后，將藻體濃縮液儲藏于5℃冰箱中，供后續實驗按需取用。

1.1.2 儀器與設備

752sp型紫外分光光度計，GZX-9140 MBE型電熱鼓風干燥箱，BSA223S型電子天平，SHB-III型循環水式多用真空泵、ZD-85恒溫振蕩器、直徑7.0cm定性濾紙，SB-348A曝氣增氧裝置、海爾BCD-186KB型冰箱、HCMJQ-100B型高壓滅菌鍋。布氏漏斗、塑料藻體培養容器、日光燈、蒸餾水及燒杯、試管、玻璃棒等其他實驗室常用玻璃器皿。

1.2 方法

1.2.1 混合藻體的取樣、放大培養和濃縮保存

含有混合藻體的水樣取自景德鎮學院生物與園林實訓基地蓄水池。取500ml水樣接種至10L本課題組人工配置的藻體培養液中，白天自然光輔助日光燈照明，24h曝氣不間斷連續培養。每周向培養體系中補充人工培養液500ml。每兩周從培養容器底部收集藻體，并轉移至200ml高鹽溶液（近飽和鹽水），常溫（25℃左右）振蕩處理1天，除蟲抑菌。高鹽處理后，抽濾藻體溶液，濾紙上的藻體轉入500ml蒸餾水清洗，震蕩2天充分除鹽，再次抽濾后的藻體轉至500ml高溫高壓消毒蒸餾水中。多次重復收集藻體，5℃冰箱冷藏備用。

1.2.2 吸光值-藻體質量相關性曲線的建立

（1）混合藻體溶液吸收波峰的研究

取少量藻體，在蒸餾水中配制兩種任意濃度的藻體溶液，混勻后直接取樣粗測不同波長可見光的吸光值，檢測波長分別設置為420nm、450nm、500nm、550nm、600nm、650nm、700nm。

結果顯示樣品在450nm～500nm之間有最大吸收峰值。進一步在420nm～520nm處每隔10nm對樣品溶液進行精測，結果顯示，混合藻體溶液的可見光吸收峰值在480nm～490nm范圍內。

（2）沉降時間與吸光值的關系研究

任意配制三種不同濃度的混合藻體溶液，混勻后對三個樣品分別測定吸光值。取2ml溶液置于分光光度計比色皿中檢測485nm波長光吸收，每隔1min測定一次，記錄吸光值數據，作圖分析。

（3）藻體溶液吸光值-藻體干重相關性曲線的建立

藻體溶液吸光值與其所含藻體干重相關性的研究分兩步進行：

a.取少量混合藻體，晾干后配制成200ml藻體溶液（濃度設定為C），混勻。取100ml、50ml、25ml、12.5ml藻體溶液，后三份溶液皆定容為100ml，故其濃度分別被稀釋為0.5C，0.25C，0.125C，搖勻，靜置10min。測定四個混合藻體溶液樣品的吸光值，作圖分析。

b.按照由少到多的規律，隨機取少量濃縮混合藻體，晾干后配制成50ml混合藻體溶液，合計11個樣品，分別測定其吸光值及所含藻體干重，作圖分析。

每個樣品溶液所含藻體干重的測定方法：從配置好的50ml藻體溶液中取2ml樣品檢測吸光值，測定完畢后將加入比色皿的2ml藻體溶液回收，與其余48ml溶液合并。比色皿中殘留的藻體用蒸餾水沖洗3次，清洗液一并并入原50ml藻體溶液。取一張抽濾濾紙，烘干（于恒溫干燥箱中60℃烘2小時），盡量去除水分，稱取重量（g1）。利用該濾紙進行抽濾。抽濾過程中倒入藻體溶液時應盡量緩慢，溶液接觸濾紙的位置應該位于濾紙的中央，盡量防止溶液濺出至濾紙外，降低誤差。將帶有藻體的濾紙自然晾干后，從布氏漏斗中取出，烘干（于恒溫干燥箱中60℃烘2小時），稱重（g2）。即得藻體干重g=g2-g1。

2 結果與分析

混合藻體溶液中藻體的生物量與其所含光合色素的量通常會具有正相關性，光合色素的量與其吸光值的大小通常也具有正相關性。因此可利用分光光度計測定藻體溶液光合色素（主要為葉綠素a）的光吸收情況，從而間接反應溶液中藻體的濃度大小[4、5]。不同藻類細胞中所含光合色素的種類和數量不同，不同色素對不同波長的光吸收情況不同，因此混合藻體與單一色素甚至單一藻體相比，其對光吸收的峰值對應的波長肯定都不會相同。因此，本文首先對混合藻體溶液的光吸收峰值對應的波長進行了研究。

2.1 混合藻體溶液最大吸收峰值對應波長位置的研究

2.1.1 粗測混合藻體溶液最大吸收峰值對應波長大小

本文首先對兩個不同濃度的藻體溶液樣品在420nm～700nm波段可見光區的吸光度進行了檢測，測出每隔50nm波長間距的混合藻體光吸收情況。根據該數據作混合藻體溶液在不同波長吸光值的變化趨勢圖，可以發現，最強吸收峰在500nm左右。

2.1.2 精測混合藻體溶液最大吸收峰值對應波長的大小

根據粗測結果，縮小范圍，在420nm～520nm波段處每隔10nm對上述兩個樣品溶液進一步精測并作不同濃度混合藻體溶液在不同波長的吸光值變化趨勢圖。可以發現，本研究中兩個不同濃度混合藻體溶液的最大吸收峰皆位于480nm～490nm之間。但是由于兩個樣品的濃度有一定區別，測定過程中存在誤差，所以兩條曲線的最高峰值并未完全重合。因此，折中選取485nm作為后續實驗的吸光值檢測波長。

2.2 沉降時間與吸光值的關系

在上述實驗進行中發現，對新配制混勻的藻體溶液立即檢測吸光值，同一樣品用于多次檢測得到的數據不同，隨著時間推移數據呈逐漸減小趨勢。本文據此配制了三個不同濃度的混合藻體溶液，測定其不同沉降時間條件下485nm處的吸光值并作不同濃度混合藻體溶液在不同沉降時間測定的吸光值變化趨勢圖。我們發現，三個樣品的檢測結果顯示了相似的變化趨勢，即不同濃度的樣品在前5min每隔1min檢測，吸光值呈下降趨勢。但是5min以后，三個樣品的吸光值先后趨于穩定，且不同樣品吸光值大小關系不隨時間改變。因此，測定混合藻體溶液吸光值前，應先將配制好的待測樣品靜置一段時間，待其溶液達到平衡狀態以后，再行檢測。靜置五分鐘后三個樣品溶液的吸光值就已趨于穩定，但是考慮到隨著藻體濃度進一步提高，可能靜置五分鐘仍不夠。故后續實驗都選擇在配制混勻混合藻體溶液后靜置10min再開始檢測。

2.3 混合藻體溶液濃度、藻體干重與吸光值相關性研究

為了測定混合藻體溶液藻體生物量與吸光值的關系，本文選取了不同濃度的樣品，研究混合藻體溶液在485nm處吸光值的變化情況。

2.3.1 混合藻體濃度與其吸光值變化關系研究

通過測定某混合藻體溶液（濃度以C表示）及其成倍稀釋溶液（濃度分別為C/2，C/4，C/8）485nm處的吸光值。根據該數據作藻體濃度與吸光值相關性變化趨勢圖，可以看出該混合藻體溶液吸光值大小與其濃度成正比線性關系。

2.3.2 混合藻體溶液吸光值與其所含藻體干重相關性的研究

本文進一步對11個不同濃度的混合藻體溶液進行檢測，測得其藻體溶液485nm吸光值與其所含藻體干重數據。根據該數據，做混合藻體溶液吸光值與其藻體干重的相關性變化趨勢圖（圖1），并生成回歸直線方程。從圖中可以看出，吸光值與藻體干重也具有正比關系，所有數據皆圍繞回歸直線呈正態分布。生成的線性方程為：

Y=0.6216X+0.0200，R2=0.9187

其中，Y為吸光值大小，X為溶液中藻體干重，R為y的期望值。

3 結束語

本文利用分光光度法，建立了一套鑒定水中藻體含量的方法。該方法可在除藻抑藻工作中，作為檢測除藻抑藻效果的重要方法。但是在研究中存在一些不足，需要改進和提高，主要包括以下幾個方面：

3.1 不同水體需測定不同的最大可見光吸收峰值波長

本文測定的最大吸收峰值波長適用于本研究樣本來源的水體，但是不見得適用于其他水體。因此，在測定不同水體吸光值時，建議都應重新確定其光吸收峰值對應的波長大小。鑒于此，我們還應進一步研究天然水體與利用該水體接種后人工培養的混合藻體溶液在藻體種類和數量上是否存在較大差異，這種差異也可能對“吸光值-藻體干重”回歸直線和方程的建立及應用產生一定的影響。

3.2 混合藻體溶液“吸光值-干重”相關性回歸曲線及方程需要進一步完善

本文建立的混合藻體溶液“吸光值-干重”相關性回歸直線及方程的準確性和精確度有待進一步提高。主要問題在于：（1）測定藻體干重的方法仍有改進空間；（2）取得的有效數據數量較少，因此形成的回歸直線和方程的代表性不足。在今后的研究中，我們將進一步優化檢測方法，補充實驗數據，以形成更加完善的天然水體混合藻類濃度的檢測方法。

參考文獻：

[1]王家玲，李順鵬，黃正.環境微生物學[M].第二版.北京：高教出版社，2004：372-382.

[2]黃美玲，何慶，黃建榮，等.小球藻生物量的快速測定技術研究[J].河北漁業，2010，196（4）：1-3.

[3]王瓚，喬俊蓮，王國強，等.濃縮過濾-超聲振蕩法檢測水中藻類[J].中國給水排水，2008，24（14）：86-87.

[4]段剛，劉曉海，高云濤，等.分光光度法測定滇池藻類生長的研究[J].化學與生物工程，2006（23）：4，55-57.

[5]陳晨，馬曉雁，李軍，等.水中典型致臭藻類培養濃度與吸光度、濁度關系探討[J].四川環境，2010，29（4）：31-34.