紅平菇液體培養(yǎng)條件的優(yōu)化

王殿振++賀曉龍++趙瑞華++房云云++任桂梅++劉月芹

摘要：為了優(yōu)化紅平菇液體培養(yǎng)條件，更好應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐，本試驗(yàn)采用Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法，以溫度、pH值、維生素B1含量為自變量，以紅平菇菌絲體干質(zhì)量為響應(yīng)值進(jìn)行了優(yōu)化。先分別探究了不同因素對(duì)其生長(zhǎng)的影響，確定最佳水平，然后采用響應(yīng)面法擬合出最佳培養(yǎng)條件，最后結(jié)合實(shí)際驗(yàn)證得出了紅平菇液體菌種的適宜培養(yǎng)條件。結(jié)果表明，紅平菇液體培養(yǎng)適宜條件，培養(yǎng)溫度為32 ℃，pH值為6.0，維生素B1含量為 16.0 mg/L。在上述條件下，紅平菇菌絲體干質(zhì)量達(dá)10.19 mg/mL，與方程預(yù)測(cè)10.34 mg/mL結(jié)果一致，比優(yōu)化前7554 mg/mL提高了34.895%，表明所得模型有一定的生產(chǎn)實(shí)踐指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞：紅平菇；菌絲干質(zhì)量；液體培養(yǎng)基；響應(yīng)面

中圖分類號(hào)： S646.1+4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）09-0105-04

紅平菇（Pleurotus djamor），在真菌分類學(xué)上屬于真菌門層菌綱傘菌目側(cè)耳科側(cè)耳屬，別稱紅側(cè)耳、桃紅平菇[1-3]，是熱帶、亞熱帶地區(qū)木腐菌類，菌絲生長(zhǎng)快，出菇早，產(chǎn)量高，子實(shí)體色澤鮮艷，味道鮮美，是一種“能吃能觀賞”的珍稀蕈菌[4]。紅平菇子實(shí)體營(yíng)養(yǎng)豐富，屬于低脂肪、高蛋白的健康食品，纖維素含量達(dá)到25%以上[5]；含多種人體必需和非必需的氨基酸、維生素和礦物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗菌、提高機(jī)體免疫力等功能；產(chǎn)量與生物學(xué)效率高[6-8]。

目前，紅平菇雖然在國(guó)內(nèi)已被廣泛研究，1991年，河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝系李明等從泰國(guó)曼谷農(nóng)業(yè)大學(xué)引進(jìn)了1株高溫型T-紅平菇，通過(guò)3年的研究，掌握了該菌株的生物學(xué)特性，取得了一定的研究進(jìn)展[9]。賴萬(wàn)年曾進(jìn)行過(guò)紅平菇深層發(fā)酵培養(yǎng)的研究[10]，但關(guān)于紅平菇液體培養(yǎng)方面的報(bào)道還很少，而相對(duì)于傳統(tǒng)制種和栽培方式而言，液體培養(yǎng)技術(shù)具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)，更容易滿足大規(guī)模工廠化生產(chǎn)的需求，是食用菌產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的必然趨勢(shì)。本試驗(yàn)旨在通過(guò)對(duì)紅平菇在不同維生素B1濃度、不同pH值、不同溫度時(shí)應(yīng)用響應(yīng)面法進(jìn)行液體培養(yǎng)條件的優(yōu)化，為紅平菇液體培養(yǎng)提供一定的參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌種

紅平菇菌種由延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院食用菌實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基：稱取去表皮洋蔥200 g，切片，沸水煮30 min，8層紗布過(guò)濾，取濾液，加入已稱量好的藥品（葡萄糖20 g、酵母膏5 g、磷酸二氫鉀1.5 g、硫酸鎂0.5 g、維生素B1 10 mg、瓊脂15 g），加熱攪拌溶解，定容，分裝試管（8 mL/管），121 ℃滅菌30 min，無(wú)菌檢驗(yàn)，備用。

液體培養(yǎng)基：方法同上，去掉瓊脂，配成后裝入三角瓶（規(guī)格為150 mL）中，50 mL/瓶，121 ℃滅菌30 min，無(wú)菌檢驗(yàn)，備用。

1.1.3試劑

DNS試劑：取6.3 g 3，5-二硝基水楊酸和 262 mL 2 mol/L的氫氧化鈉溶液加到含192 g酒石酸鉀鈉的熱溶液中，再加5 g苯酚和5 g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定溶至1 000 mL，于棕色瓶中待用[11]。

1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：葡萄糖干燥至恒重，準(zhǔn)確稱取1.00 g葡萄糖，用蒸餾水溶解并定容至1 000 mL。

1.2方法

1.2.1菌株活化

將母種接種于斜面培養(yǎng)基中，于25 ℃培養(yǎng)8 d，制得活化菌株。

1.2.2菌種培養(yǎng)

將活化后的菌種制成菌懸液，并且接種于液體培養(yǎng)基中，每瓶接種1 mL，于25 ℃、180 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)。

1.2.3生長(zhǎng)曲線的繪制

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制試驗(yàn)見(jiàn)表1。以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。

還原糖含量測(cè)定：按表2添加試劑，搖勻，沸水浴5 min，取出迅速放入冷水中，降到室溫時(shí)，加蒸餾水定容至25 mL，搖勻，測(cè)定吸光度D550 nm。

菌絲干質(zhì)量的測(cè)定：濾紙烘干至恒質(zhì)量，質(zhì)量記為m1；每天取3個(gè)三角瓶，真空泵抽濾，得到菌絲體與菌液，菌液放在冰上用于還原糖的測(cè)定，菌絲與濾紙烘干至恒質(zhì)量稱量，質(zhì)量記為m2。m2-m1即為菌絲干質(zhì)量。

根據(jù)還原糖含量的變化和菌絲干質(zhì)量的變化繪制菌絲生長(zhǎng)曲線。

1.2.4單因素試驗(yàn)

溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響：將菌懸液接種于液體培養(yǎng)基中，分別置于20、25、30、35、40 ℃條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定還原糖和菌絲干質(zhì)量，每個(gè)溫度設(shè)3個(gè)重復(fù)。

pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響：接種方法同上，pH值設(shè)5個(gè)梯度：pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定還原糖和菌絲干質(zhì)量，每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)重復(fù)。

維生素B1濃度對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響：接種方法同上，維生素B1濃度設(shè)5個(gè)梯度，分別為0、5、10、15、20 mg/L，培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定還原糖和菌絲干質(zhì)量，每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.5響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，優(yōu)化最佳條件的范圍，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[12]，運(yùn)用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，分別以影響最大的因素為自變量，菌絲干質(zhì)量為響應(yīng)值。Box-Behnken試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表3。

2結(jié)果與分析

2.1紅平菇基礎(chǔ)試驗(yàn)

2.1.1紅平菇生長(zhǎng)曲線

從圖2可以看出，紅平菇在培養(yǎng)后2 d開(kāi)始生長(zhǎng)，8 d左右生長(zhǎng)速率達(dá)到最大，10 d菌絲干質(zhì)量達(dá)到最大，菌絲干質(zhì)量整體曲線呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，繼續(xù)培養(yǎng)菌絲體干質(zhì)量基本保持不變，符合其生長(zhǎng)規(guī)律。故確定紅平菇液體培養(yǎng)最佳時(shí)間為8 d。

2.1.2紅平菇還原糖含量測(cè)定

從圖3可以看出，在前2 d還原糖含量呈下降趨勢(shì)，這可能是培養(yǎng)基經(jīng)高溫滅菌后，某些淀粉類物質(zhì)降解的還原糖為紅平菇菌絲體的初期生長(zhǎng)提供速效碳源，在2～12 d，還原糖含量整體呈上升趨勢(shì)，但在4 d時(shí)含量急劇下降，變化比較明顯，可能是碳源物質(zhì)的消耗和菌絲體數(shù)量的增長(zhǎng)，使得培養(yǎng)后期還原糖含量下降。

2.2單因素試驗(yàn)

2.2.1不同溫度對(duì)紅平菇菌絲體生長(zhǎng)的影響

從圖4、圖5可以看出，在溫度為20～35 ℃時(shí)，隨著溫度提高菌絲干質(zhì)量呈上升趨勢(shì)，還原糖含量呈下降趨勢(shì)，可能是菌絲體生長(zhǎng)旺盛，還原糖消耗較快；當(dāng)溫度高于35 ℃時(shí)菌絲干質(zhì)量下降，生長(zhǎng)速度明顯減慢，還原糖含量也開(kāi)始上升，可能是菌絲體活力下降，還原糖消耗減慢。表明紅平菇在溫度為35 ℃時(shí)生長(zhǎng)最好。

2.2.2不同pH值對(duì)紅平菇菌絲體生長(zhǎng)的影響

從圖6、圖7可以看出，pH值在4～6時(shí)，隨pH值增加菌絲干質(zhì)量呈上升趨勢(shì)，還原糖含量呈下降趨勢(shì)；pH值為6時(shí)，菌絲干質(zhì)量達(dá)到最大，還原糖含量也較低。pH值在6～8時(shí)，菌絲干質(zhì)量和還原糖含量都降低。表明紅平菇最適pH值為6。

2.2.3不同濃度維生素B1對(duì)紅平菇菌絲體生長(zhǎng)的影響

從圖8、圖9可以看出，維生素B1濃度為0～15 mg/L時(shí)，菌絲干質(zhì)量隨著維生素B1濃度的增加呈上升趨勢(shì)，還原糖含量呈下降趨勢(shì)；濃度為15～20 mg/L時(shí)紅平菇菌絲干質(zhì)量下降，還原糖含量有所增加。試驗(yàn)結(jié)果表明，紅平菇最適維生素B1濃度為15 mg/L。

2.3響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.3.1Box-Benhnken設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，以溫度、pH值、維生素B1含量為自變量，以紅平菇菌絲干質(zhì)量為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表4。 2.3.2回歸方差分析

由表4數(shù)據(jù)擬合的全變量編碼水平的二次回歸方程（1）菌絲干質(zhì)量=-7.877 05-0.145 55A+3.020 82B+0.358 61C-3.389 50×10-3AB-3.527 75×10-3AC+0.011 944BC+2.152 73×10-3A2-0.255 17B2-9847 17×10-3C2。

從表5可以看出，對(duì)紅平菇菌絲干質(zhì)量所建立的二次多項(xiàng)模型具有顯著性；失擬項(xiàng)不顯著（P=0.654 3>0.05），表明回歸方程擬合充分，可以用此模型對(duì)紅平菇菌絲生長(zhǎng)進(jìn)行分析。顯著性檢驗(yàn)表明，溫度對(duì)菌絲干質(zhì)量極顯著，維生素B1含量對(duì)菌絲干質(zhì)量影響顯著，pH值對(duì)菌絲干質(zhì)量影響顯著，各因子對(duì)菌絲干質(zhì)量的影響程度為：A（溫度）>C（維生素B1）>B（pH值）。各交互項(xiàng)按影響大小排序依次為AC、BC、AB，表明不同因素對(duì)菌絲干質(zhì)量的影響不是簡(jiǎn)單線性關(guān)系。

2.3.3響應(yīng)面分析

根據(jù)回歸曲線作出的響應(yīng)面曲面圖和等高線圖可直觀地考察出不同因素對(duì)菌絲體干質(zhì)量的影響，等高線圖的形狀反映出因素交互影響的強(qiáng)弱，橢圓形或馬鞍形的等高線圖表示交互影響顯著，而圓形圖則表示不顯著，結(jié)果見(jiàn)圖10、圖11、圖12，溫度與維生素B1的交互影響極顯著，溫度與pH值的交互影響顯著，pH值與維生素B1的交互影響不顯著。

2.3.4回歸模型預(yù)測(cè)優(yōu)化值

根據(jù)回歸方程（1）分別求3個(gè)自變量的一階偏導(dǎo)并查出對(duì)應(yīng)真實(shí)值分別為A=32 ℃、B=609、C=16.23 mg/L，菌絲干質(zhì)量預(yù)測(cè)值為 10.28 mg/mL。

2.3.5優(yōu)化工藝條件的驗(yàn)證

考慮實(shí)際的可操作性，對(duì)優(yōu)化工藝參數(shù)修正溫度為32 ℃、pH值為6.00、維生素B1含量為16.00 mg/L，對(duì)回歸優(yōu)化模型的條件進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，菌絲干質(zhì)量為10.19 mg/mL，與方程預(yù)測(cè)一致，表明所得模型有一定的生產(chǎn)實(shí)踐指導(dǎo)意義。

3討論

本試驗(yàn)采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)獲得紅平菇液體培養(yǎng)最優(yōu)條件：培養(yǎng)溫度為32 ℃，pH值為6.0，維生素B1含量為 16.0 mg/L。在最優(yōu)條件下，紅平菇菌絲干質(zhì)量可達(dá)到了 10.19 mg/mL，比優(yōu)化前7.554 mg/mL提高了34.895%。試驗(yàn)結(jié)果表明，在紅平菇液體菌種培養(yǎng)的過(guò)程中，響應(yīng)面法能有效地優(yōu)化培養(yǎng)條件。

國(guó)內(nèi)外不少學(xué)者通過(guò)響應(yīng)面分析法在培養(yǎng)基優(yōu)化方面取得了良好效果。本試驗(yàn)通過(guò)響應(yīng)面分析，以菌絲干質(zhì)量為響應(yīng)值，采用回歸擬合方程，并通過(guò)方差分析獲得了最佳培養(yǎng)條件，為今后紅平菇液體培養(yǎng)提供了技術(shù)依據(jù)。

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