脫脂和脫蛋白處理對蟲草多糖測定的影響

2017-07-15 02:51:40方蘇閆興富周立彪

江蘇農業科學 2017年9期

方蘇++閆興富++周立彪

摘要：以蟲草發酵菌粉為材料，比較多糖提取過程脫脂、脫蛋白操作對硫酸-苯酚法和硫酸-蒽酮法測定多糖值的影響。研究結果表明，同一樣品提取多糖時不脫脂和蛋白（A）、只脫脂（B）、只脫蛋白（C）、脫脂脫蛋白（D）對硫酸-蒽酮法與硫酸-苯酚法測定結果差異顯著，2種比色法測得多糖含量值均呈現A>B>C>D，其中脫蛋白的操作比脫脂操作對2種比色法測定結果影響更大。同時還顯示，硫酸-苯酚法測得的多糖含量較硫酸-蒽酮法測得值大。并通過精密度、回收率、穩定性比較發現，硫酸-苯酚法優于硫酸-蒽酮法。

關鍵詞：蟲草多糖；脫脂；脫蛋白；含量測定；硫酸-苯酚法；硫酸-蒽酮法

中圖分類號： R284.1文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）09-0144-03

測定多糖含量的方法主要有比色法、高效液相色譜法和酶法等，其中高效液相色譜法與酶法由于樣品前處理工序比較繁瑣，測定時間較長，檢測費用較高等原因未能廣泛使用，而比色法中的苯酚-硫酸法與蒽酮-硫酸法由于操作簡單、實用性強，在多糖研究中被廣泛使用[1]。比色法多糖含量測定包括提取和含量測定2部分，農業部標準食用菌中粗多糖含量的測定（硫酸-苯酚法）[2]及中國藥典[3]靈芝多糖含量的測定（硫酸-蒽酮法）均為粗多糖的測定，前者是醇洗后水提，后者是水提后醇沉，均不脫脂不脫蛋白。現行的多糖提取處理與多糖測定的基本流程可歸納為：菌粉→脫脂（兼脫色）→水提→醇沉→脫蛋白→得精多糖液→顯色反應→比色，實際研究中的具體操作各有不同，主要區別在于多糖提取是否經脫脂處理或是否經脫蛋白處理，包括不脫脂和蛋白[4-7]、只脫脂[8-9]和只脫蛋白處理等[10-13]。目前，采用2種比色法進行不同提取處理測定蟲草多糖之間的差異還缺乏研究，因此，本研究以蟲草菌粉為材料，在多糖提取過程中，通過脫脂和脫蛋白處理，用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法進行多糖的測定，研究脫脂和脫蛋白處理對蟲草多糖測定結果的影響，為完善蟲草多糖測定方法和蟲草相關產品開發利用提供參考。

1材料與方法

1.1材料

試驗材料：冬蟲夏草菌來源于中國科學院微生物研究所，經5 L發酵罐發酵、過濾、烘干、粉碎研磨制得。

儀器：分光光度計UV1000，上海精科天美；離心機HC-3016，安徽中科中佳；索氏提取器GG-17 50/42，上海喬楓；旋轉蒸發儀RE-52AA，上海亞榮；移液槍。

試劑：濃硫酸、苯酚、蒽酮、乙醚、氯仿、乙醇（均為分析純）。

1.2試驗設計

本試驗共設4個處理，分別為A：不脫脂也不脫蛋白（對照）；B：脫脂；C：脫蛋白；D：既脫脂又脫蛋白。其中處理B依次包括：脫脂、水提、醇沉、定容和多糖測定；處理C依次包括：水提、醇沉、脫蛋白、定容和多糖測定；處理D依次包括：脫脂、水提、醇沉、脫蛋白、定容和多糖測定。

1.3樣品處理和多糖提取

1.3.1脫脂稱取1.00 g研磨后的菌粉，濾紙包裹于盛有 250 mL 乙醚的索氏提取器，42 ℃回流2 h，取出揮發干[7]。

1.3.2水提將菌粉置于三角瓶中，加水100 mL，95 ℃下浸提1 h，浸提2次合并，8 000 r/min離心10 min后，取上清液于55 ℃下旋轉蒸發，濃縮至約50 mL[9]。

1.3.3醇沉將濃縮液加入3倍體積的95%乙醇，靜置于 4 ℃ 冰箱中12 h。于8 000 r/min下離心10 min，取沉淀，再用無水乙醇洗滌后離心，取沉淀90 ℃熱水復溶至50 mL[9]。

1.3.4脫蛋白將上述復溶的溶液置于分液漏斗，加入Sevage試劑（氯仿 ∶正丁醇體積比4 ∶1）15 mL，振蕩后靜置 5 min，棄下層有機相，重復5次，得多糖液[10]。

1.3.5定容將上述制備好的多糖溶液加蒸餾水定容至100 mL待測。

1.4多糖的測定

1.4.1硫酸-苯酚法[2]

1.4.1.1苯酚溶液的配制稱取80 g苯酚溶于蒸餾水，定容至100 mL，于棕色瓶中4 ℃冰箱中避光保存備用；實際使用時現用現配5%的苯酚溶液。

1.4.1.2標準曲線的制備稱取干燥葡萄糖0.010 g，溶于蒸餾水定容至100 mL；分別移取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 葡萄糖液置于具塞試管中，加蒸餾水至2 mL，另取1支試管加入蒸餾水2 mL作為空白對照。將上述每一試管中分別加入苯酚溶液1 mL，加5 mL濃硫酸，靜置10 min，渦旋振蕩混勻，30 ℃反應20 min，于490 nm下測定吸光度。

1.4.1.3樣液的測定取定容后的樣液0.20 mL，加蒸餾水至2 mL，按照標準曲線制備項下的方法，自加入苯酚溶液起，測定吸光度。

1.4.1.4多糖含量的計算根據測得的吸光度值，按以下公式計算多糖百分含量w。

式中：m1為回歸方程換算出多糖濃度（mg/mL）；V1為樣品定容體積（mL）；m2為樣品濃度（mg/mL）；V2為比色測定時所移取樣品測定的體積（mL）；0.9為葡萄糖換算成葡聚糖的校正系數。

1.4.2硫酸-蒽酮法[3]

1.4.2.1硫酸蒽酮溶液配制準確稱取0.2 g蒽酮，緩慢加入100 mL濃硫酸，溶解置于棕色瓶避光保存。

1.4.2.2標準曲線的制備稱取干燥葡萄糖0.010 g，溶于蒸餾水定容至100 mL，分別移取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 葡萄糖液置于具塞試管中，加蒸餾水至2 mL，另取1支試管加入蒸餾水2 mL作為空白對照。分別加入蒽酮硫酸溶液6 mL搖勻，沸水浴15 min，冰水浴15 min，625 nm下測定吸光度。

1.4.2.3樣液的測定取定容后的樣液0.2 mL于具塞試管中，加蒸餾水溶解定容至2 mL，按照標準曲線制備項下的方法，自加入硫酸蒽酮溶液起，測定吸光度。

1.4.2.4多糖含量的計算同硫酸-苯酚法。

1.5回收率試驗[14]

取處理D樣液0.2 mL于具塞試管中，加入0.1 mg/mL標準葡萄糖溶液0.4 mL，蒸餾水定容至2.0 mL，按照“1.4.1”節硫酸-苯酚法和“1.4.2”節硫酸-蒽酮法的測定方法測定多糖含量，重復5次，按下述公式計算回收率：回收率=（c-a）/b×100%。式中：a為供試品所含多糖的量；b為加入對照品的量；c為實測值。

1.6穩定性試驗[7]

按照試驗設計中處理D的操作步驟，在用硫酸-苯酚法和硫酸-蒽酮法進行多糖測定時，分別延遲10、20、30、40、50、60、90、120 min后再進行吸光度測定，比較2種多糖測定方法測得的吸光度差異。

1.7數據的統計分析

采用IBM SPSS Statistics 20軟件用單因素方差分析的方法對不同處理間差異進行方差分析。

2結果與分析

2.12種測定方法的標準曲線

按照上述硫酸-苯酚法標準曲線制備方法，得到葡萄糖標準曲線（圖1）。硫酸-苯酚法濃度-吸光度線性回歸方程[JP3]為y=11.029x+0.022，相關系數r=0.996 3，吸光度在 0.132～0684（0.01～0.06 mg/mL）范圍內有良好的線性關系。

按照上述硫酸-蒽酮法標準曲線制備方法，得到葡萄糖標準曲線（圖2）。硫酸-蒽酮法濃度-吸光度線性回歸方程為y=8.051 4x-0.002 5，相關系數r=0.999 0，吸光度在 0.078～0.480（0.01～0.06 mg/mL）內有良好的線性關系。

2.2不同處理對2種方法測定結果的影響

2.2.1硫酸-苯酚法從表1可以看出，A、B、C、D處理樣品測得的蟲草多糖含量分別為5.19%、4.77%、3.35%、2.56%，其中，B、C處理測得的含量分別為A處理的 91.91%、64.54%，D處理樣品測得的精多糖含量為A處理測得的粗多糖含量的49.32%；3個處理組與對照間均差異明顯。

2.2.2硫酸-蒽酮法3個處理組樣品測得的多糖值分別為3.88%、2.99%、2.45%，3個處理均明顯小于對照，其中B、C處理測得的蟲草多糖含量分別是A處理的87.78%、67.64%，C處理對蟲草多糖含量的影響比B處理影響較大；D處理樣品測得的精多糖含量為A處理測得的粗多糖含量的55.43%（表1）。

2.32種測定方法的比較

2.3.1多糖值及其精密度

硫酸-苯酚法A、B、C 3種處理多糖含量測定值均大于硫酸-蒽酮法的測定值，前者分別比后者高出17.42%、22.94%、12.04%，但2種測定方法在D處理的測定結果接近。

硫酸-苯酚法A、B、C、D 4種處理測定結果的相對標準偏差分別為1.85%、1.19%、1.31%、1.55%；硫酸-蒽酮法對應A、B、C、D 4種處理樣的RSD值分別為1.89%、2.10%、1.46%、1.89%，硫酸-苯酚法的RSD值低于硫酸-蒽酮法，硫酸-苯酚法較硫酸-蒽酮法具有更高的精密度。

2.3.2回收率

硫酸-苯酚法與硫酸-蒽酮法回收率分別為99.04%、102.00；相對標準誤差分別為1.78%、2.55%（表2）。

2.3.3穩定性

從圖3可以看出，在0～120 min時間范圍內，硫酸-苯酚法測得的吸光度隨時間的變化幅度較小，相對標準誤差為0.83%，硫酸-蒽酮法測得的吸光度隨時間的變化較為明顯，相對標準誤差為3.93%。在0～30 min內，硫酸-苯酚法測得的吸光度基本穩定，硫酸-蒽酮法在0～30 min 的吸光度略有下降。

3討論

多糖提取脫脂、脫蛋白處理都造成測定值的差異，影響因素包括有機項干擾、多糖流失及操作條件等。脫脂操作2種比色法測定的多糖含量較粗多糖含量均有減少，乙醚回流脫脂兼有脫色作用，本試驗因由濾紙包裹回流，即使吸光度減少，屬排除有機項干擾，無多糖損失。脫蛋白操作本試驗采用的是研究中較多用到的Sevage法[10-13]，2種比色法測得的多糖含量值均大幅減少，相比粗多糖含量減少達33%以上。原因在于脫蛋白Sevage試劑萃取分相時易造成多糖的流失，萃取次數多少可能是影響的主要因素，有研究結果認為，萃取次數為4次時蛋白質脫除率高，但多糖損失率也高[15]。因此，在排除蛋白干擾的同時，可能會造成多糖流失，導致脫蛋白處理的測定值表現為較大幅度減少的現象。

與硫酸-蒽酮法相比，硫酸-苯酚法測得的4種處理的多糖值均較高，可能與顯色反應對干擾項的敏感程度有關。2種呈色強度分別與溶液中糖的濃度成正比，2種顯色反應對干擾項的敏感度可能不同。有研究結果認為，這2種比色法在測定多個不同樣品時多糖含量差別很大[16]。本試驗對去除脂類和蛋白質干擾的D處理既脫脂又脫蛋白來說，2種比色法測得的多糖含量趨于接近，干擾項的存在可能是造成差異的主要因素。

從穩定性看，在120 min內硫酸-苯酚法顯色更為穩定，而硫酸-蒽酮法測得的吸光度值隨著比色時間的延長而減小，因為多糖在硫酸-蒽酮試劑作用下形成的衍生物可能受反應時間及環境溫度變化的影響，從而造成顯色反應不穩定[1]。總體上看，硫酸-苯酚法與硫酸-蒽酮法作為操作易實現、應用性強的2種比色法，均可用于蟲草多糖的測定，硫酸-苯酚法的精密度更高、回收率和穩定性更好，及試劑配制、顯色反應步驟也更為簡易，更適于蟲草多糖的測定。

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