蜂毒肽對大鼠退行性骨關節病軟骨細胞NF-κB信號通路的影響

湯發強 吳 宏 鄭建章 胡世平 郭徽靈 顏來鵬 許春財 林蘊碩

(福建省立醫院骨科，福建 福州 350001)

蜂毒肽對大鼠退行性骨關節病軟骨細胞NF-κB信號通路的影響

湯發強 吳 宏 鄭建章 胡世平 郭徽靈 顏來鵬 許春財 林蘊碩

(福建省立醫院骨科，福建 福州 350001)

目的 探究蜂毒肽對大鼠退行性骨關節病軟骨細胞核因子(NF)-κB信號通路的影響。方法 成功建立大鼠骨關節炎模型，分別于關節腔注射蜂毒肽，并體外分離慢性骨關節炎軟骨細胞，采用體外增殖CCK8實驗及實時定量聚合酶鏈反應(PCR)，觀察蜂毒肽對軟骨細胞的保護作用；采用Western印跡法分別檢測了不同劑量下蜂毒肽影響白細胞介素(IL)-1誘導NF-κB信號通路的激活情況。結果 成功建立大鼠膝關節來源的體外軟骨細胞培養體系后，經細胞增殖CCK8實驗結果發現，與慢性骨關節炎組相比，慢性骨關節炎+蜂毒肽組膝關節軟骨細胞的增殖能力最強；經實時定量PCR檢測成骨關鍵分子〔成骨特異轉錄因子核心結合因子(Runx)2,堿性磷酸酶(ALP),成骨相關轉錄因子(Osterox)〕的表達結果顯示，相比于慢性骨關節炎組，慢性骨關節炎+蜂毒肽組早期胚胎發育相關基因(Sox)9、CCAAT增強子結合蛋白(CEBP)2、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)因子表達均上調。經Western 印跡檢測發現，隨蜂毒肽濃度的逐漸增高，IL-1β誘導核因子(NF)-κB及I-κB的表達條帶顏色逐漸遞減，且隨時間延長，降低程度逐漸明顯。結論 蜂毒肽通過抑制NF-κB信號轉導途徑的激活以起到骨關節炎患者關節軟骨保護。

蜂毒肽；慢性骨關節炎；核因子(NF)-κB

長期慢性炎癥刺激所致關節軟骨及滑膜損害、增生、融合是引起后續關節僵硬的重要因素〔1,2〕。蜂毒肽可促進腎上腺皮質激素及促進腎上腺皮質激素的釋放，進而起到抵抗自身免疫等作用〔3〕。蜂毒肽癥明顯減輕兔的滑膜炎〔4〕。相比于吲哚美辛，蜂毒肽對前列腺素合成酶的抑制作用更強，約70倍，同時也具有良好的鎮痛作用〔5〕。骨關節炎的發生發展是包括多種炎性介質、細胞因子、機械性應力等因素共同作用的結果。而各因素均通過刺激關節內細胞進而引起相應的病理效應〔6〕。刺激因素引起的病理效應，需要將信號經細胞傳遞至細胞內部。正是由于這些信號的密切配合，最后引起基因轉錄調控的變化。核因子(NF)-κB是參與炎癥及免疫反應的一種中心轉錄因子，它可被包括：腫瘤壞死因子(TNF)-α，白細胞介素(IL)-1β等多細胞因子激活，進而快速誘導免疫炎癥反應內多基因的表達，包括炎性酶、細胞因子及基質金屬蛋白酶等〔7〕。同時在大鼠骨性關節炎模型中研究表明，軟骨細胞中NF-κB信號轉導途徑被激活〔8〕。本研究旨在探討NF-κB信號轉導途徑在蜂毒肽影響大鼠骨關節炎關節軟骨細胞中的具體作用機制。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 健康SD大鼠60只，常規飼料喂養。隨機分為三組，每組20只，20只大鼠不做任何處理，作為對照組。其余大鼠切斷膝關節內側副韌帶以建立關節炎模型，其中20只大鼠關節腔不注射任何藥物為慢性骨關節炎組，余20只術后5 w后關節腔內開始注射3%蜂毒肽0.15 mg/kg為慢性骨關節炎+蜂毒肽組，每周重復注射1次，3組均于術后11 w處死。

1.2 實驗試劑 蜂毒肽、IL-1β(南京肽業生物科技有限公司)，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量試劑盒，超敏電化學發光(ECL)發光液；TRIZOL；逆轉錄試劑盒，聚合酶鏈反應(PCR)Taq酶Mix，PCR Marker；一氧化氮合酶多克隆抗體；β-actin多克隆抗體；鏈霉素和素-生物素復合物(SABC)試劑；辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒等；I-κB、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、NF-κB引物及多克隆抗體。

1.3 軟骨細胞原代培養 無菌條件下取5～7日齡SD大鼠雙側膝關節面軟骨。切下的組織立即置于含雙抗的磷酸鹽緩沖液(PBS)中清洗，并剪成約1 mm3后胰酶消化30 min后，濾網過濾收集細胞，1 000 r/min離心10 min去上清，20%胎牛血清的DMEM-F12培養基37℃、飽和濕度、CO2濃度5%培養。

1.4 蛋白質免疫印跡分析 原代軟骨細胞培養于6孔板，Western印跡分別檢測不同劑量下蜂毒肽影響IL-1誘導NF-κB信號通路的激活情況；1:(空白對照組)不加任何處理因素; 2:10 ng/L IL-1β;3:10 ng/L IL-1β+100 μg/ml蜂毒肽;4:10 ng/L IL-1β+200 μg/ml蜂毒肽;5:10 ng/L IL-1β+300 μg/ml蜂毒肽。每組設4個復孔，連續培養24 h進行檢測，以加入IL-1β后檢測的時間點30、60、120 min三個時間點，檢測NF-κB的核轉位及I-κB的降解。一抗(NF-κB濃度1∶500，I-κB濃度1∶400，iNOS濃度1∶250)，二抗稀釋濃度1∶10 000，β-actin為內參。

1.5 總RNA的提取和實時定量PCR(qPCR) 細胞分組及處理方式同Western印跡法。提取總RNA反轉錄成cDNA，進行熒光定量PCR反應。反應條件：95℃預變性10 min(95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s)×40循環，72℃末次延伸5 min。采用2-ΔCT法進行相對定量分析。

1.6 統計學方法 采用GRAPH PAD6.0統計軟件進行t、χ2、F檢驗。

2 結 果

2.1 大鼠膝關節軟骨細胞的分離與鑒定 原代培養首次換液后，貼壁細胞多為單個長梭形細胞，偶爾可見幾個細胞的克隆，細胞在傳代3次后，形態均一，呈長梭形，融合時呈漩渦狀生長。阿爾辛藍染色，細胞分泌的多聚糖染為藍色，見圖1。表明已成功建立大鼠膝關節來源的體外軟骨細胞培養體系。

圖1 成功分離并鑒定大鼠膝關節軟骨細胞(×400)

2.2 Western印跡法檢測不同劑量蜂毒肽影響IL-1誘導NF-κB信號通路的結果 隨著蜂毒肽濃度的逐漸增高，IL-1β誘導NF-κB及I-κB的表達條帶顏色逐漸遞減，同時隨時間的延長，降低程度逐漸明顯(圖2)。以上結果提示：蜂毒肽通過抑制NF-κB信號轉導途徑的激活以起到對骨關節炎關節軟骨細胞的保護作用。

1:空白對照組；2：10 ng/L IL-1β；3：10 ng/L IL-1β+100 μg/ml 蜂毒肽；4：10 ng/L IL-1β+200 μg/ml蜂毒肽；5：10 ng/L IL-1β+300 μg/ml蜂毒肽圖2 蜂毒肽通過抑制NF-κB信號轉導途徑的激活保護骨關節炎關節軟骨細胞

2.3 細胞增殖CCK8實驗法和實時定量PCR法檢測結果 細胞增殖CCK8實驗顯示，與慢性骨關節炎組相比，慢性骨關節炎+蜂毒肽組膝關節軟骨細胞的增殖能力明顯增高(P<0.05),見表1。實時定量PCR檢測成骨關鍵分子〔成骨特異轉錄因子核心結合因子(Runx)2、堿性磷酸酶(ALP)、成骨相關轉錄因子(Osterox)〕表達，相比于慢性骨關節炎組，慢性骨關節炎+蜂毒肽組早期胚胎發育相關基因(Sox)9上調(2.4±0.7)倍，CCAAT增強結合蛋白(CEBP)2上調(1.5±0.4)倍，聚集蛋白聚糖(Aggrecan)上調(1.9±0.2)倍，均差異顯著(P<0.05)，見表2。蜂毒肽可通過提高慢性骨關節炎軟骨細胞的增殖及軟骨特性維持，以起到對大鼠膝關節軟骨細胞的保護作用。

表1 CCK8實驗檢測各組培養24、48、72 h軟骨細胞增殖率(n=20，%)

1)慢性骨關節炎+蜂毒肽組與慢性骨關節炎組比較；表2同

表2 實時定量PCR檢測各組軟骨細胞特異性轉錄分子的表達

3 討 論

蜂毒肽也稱蜂毒溶血肽或蜂毒素。蜂毒肽具有良好的藥物活性，研究提示蜂毒肽有較好的溶血和抗菌作用。其次，還可通過選擇性抑制N-膽堿受體，以阻滯神經沖動的傳導〔9〕。炎癥反應是骨關節炎發生與發展的基礎病理因素，其發生發展是多刺激因素共同作用的結果。而各因素均通過刺激關節內細胞進而引起相應的病理效應的。NF-κB作為免疫炎癥反應的重要轉錄因子之一，在骨關節炎的發病中起極其重要的作用。因此，通過抑制NF-κB途徑以阻抗骨關節炎的發展，是目前干預骨關節炎的新方向〔10〕。NF-κB作為免疫炎癥反應中的一重要轉錄因子，可多種基因的啟動子或增強子結合，從而促進基因轉錄。NF-κB存在于所有哺乳動物細胞內。研究顯示，作為NF-κB一重要成員，在骨關節炎滑膜炎(OA)和類風濕關節炎(RA)中，NF-κBp50和p65表達均增加〔11〕。并且RA比OA中NF-κB的激活更高。在脊柱關節病(SPA)及RA患者滑膜組織的研究中表明，NF-κB高表達于軟骨-血管翳交界處〔12〕。此外，正常大鼠關節內轉入IKKβ基因可引起關節炎，表現關節嚴重腫脹，炎性病理變化及IKK的活性增加，NF-κB的DNA結合活性增強。提示NF-κB在慢性骨關節炎的發病過程中扮演了重要的角色。

NF-κB可影響軟骨細胞功能。在關節軟骨細胞中研究發現，IL-1β和TNF-α均可引起NF-κB的活化，而TNF-α和IL-1β聯合刺激關節軟骨細胞對NF-κB的活化起到協同作用〔13〕。用各種特定的抑制劑抑制NF-κB途徑，進一步延緩及扼制炎癥反應的發展，可能是一個潛在的治療策略。本文結果顯示蜂毒肽可通過提高慢性骨關節炎軟骨細胞的增殖及軟骨特性維持，以起到對大鼠膝關節軟骨細胞的保護作用。蜂毒肽通過抑制NF-κB信號轉導途徑的激活以起到骨關節炎關節軟骨細胞的保護作用。

1 楊文超，吳珍紅，繆曉青.蜂毒肽和神蜂精體外抗HSV-1病毒作用研究〔J〕.中國蜂業，2010；61(4)：14-5.

2 嚴序炳.蜂毒注射液治療風濕性及類風濕性關節炎86例〔J〕.中國中西醫結合雜志，1995；15(6)：370.

3 陳素霞，孫學軍，李順子，等.蜂毒肽C末端片段的反序肽的抗菌活性和溶血活性〔J〕.高等學校化學學報，2005；26(12)：2233-6.

4 李亞非，時述山，李 欣.純化蜂毒肽對兔免疫性關節炎的抑制作用〔J〕.中華風濕病學雜志,2000;4(5):293-5.

5 Parasadam I,van Gennip S,Friis T,etal.ERK-1/2 and p38 in the regulation of hypertrophic changes of normal articular cartilage chondrocytes induced by osteoarthritics subehondral osteoblasts〔J〕.Arthr Rheum，2010；62(5)：1349-60.

6 Rasheed Z，Akhtar N，Haqqi TM.Pomegranate extract inhibits the interleukin-l beta-induced actiwation of MKK-3，p38 alpha-MAPK and transcuiption factor Runx-2 in human osteoarthritis chondrocytes〔J〕.Aitihr Res Therapy，2010；12(5)：195.

7 Frondoza CG，Heinecke LF，Grzanna MW，etal.Inhibition of cytokine induced prostaglandin E2 production and NF-kappa-B activation in arcticular chondrocytes by abocado/soyben unsaponiflables and glcosanmine〔J〕.Osteoarth Cartil，2010；18(2)：S206.

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9 Udalova IA，Mott R，Field D，etal.Quantitative prediction of NF-κB DNA eprotein interactions〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2002;99：8167-72.

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11 Reuter S，Prasad S，Phromnoi K，etal.Thiocolchicoside exhibits anticancer effects through downregulation of NF-κB pathway and its regulated gene products linked to inflammation and cancer〔J〕.Cancer Prev Res，2010；3(11)：1462-72.

12 Schmidt N，Pautz A，Art J，etal.Transcriptional and post-transcriptional regulation of iNOS expression in hunman chondrocytes〔J〕.Biochem Pharmacol，2010；79(5)：722-32.

13 Kim SJ，Park JH，Kim KH，etal.Effect of NF-kappa B decoy oligodeoxy-nucleotide on LPS/high-fat diet-induced atheroselerosis in an animal model〔J〕.Basic Clin Pharmacol Toxieol，2010；107(6)：925-30.

〔2016-03-19修回〕

(編輯 苑云杰)

福建省自然科學基金計劃項目(No.2015J01429)

湯發強(1972-)，男，博士在讀，副主任醫師，主要從事關節疾病研究。

R365.2

A

1005-9202(2017)13-3132-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.005