β-arrestin1在非小細胞肺癌中的表達及其對肺癌細胞增殖的影響

劉 曉 胡 崗 陳一凡 廖俊喆 徐 敏 劉 波

(成都市第五人民醫院呼吸科，四川 成都 611130)

β-arrestin1在非小細胞肺癌中的表達及其對肺癌細胞增殖的影響

劉 曉 胡 崗 陳一凡 廖俊喆 徐 敏 劉 波

(成都市第五人民醫院呼吸科，四川 成都 611130)

目的 探討非小細胞肺癌(NSCLC)細胞系和組織中β-arrestin1的表達及β-arrestin1對肺癌細胞增殖能力的影響。方法 收集該院經手術治療的30例NSCLC患者的癌組織標本(NSCLC組)和肺良性病變邊緣正常肺組織標本(對照組)，培養NSCLC細胞系(SPC-A-1、H460、H520、H1975)和人正常肺上皮細胞系16HBE，分別提取NSCLC組、對照組及細胞系總RNA，逆轉錄后，實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)用于檢測β-arrestin1 mRNA的表達，蛋白印跡法(Western印跡)和免疫組化(IHC)分別檢測細胞系和組織中的β-arrestin1蛋白的表達水平。MTT實驗檢測分別轉染sh-β-arrestin1質粒和對照質粒sh-control到SPC-A-1細胞后對NSCLC細胞SPC-A-1增殖能力的影響。結果 β-arrestin1 mRNA和蛋白表達水平在NSCLC組織和細胞系中分別高于對照組和16HBE細胞(P<0.05)。轉染sh-β-arrestin1質粒后，β-arrestin1 mRNA和蛋白表達水平均顯著下調，且在MTT實驗中可顯著抑制ASPC-A-1的增殖能力(P<0.05)。結論 β-arrestin1在NSCLC組織和細胞系中呈高表達，且可以抑制肺癌細胞的增殖。

非小細胞肺癌；β-arrestin1

非小細胞肺癌(NSCLC)占肺癌的85%。發生轉移的晚期NSCLC患者在得不到有效治療時的中位數生存期僅為4～5個月，1年生存率<10%〔1〕。臨床上NSCLC的主要治療形式包括手術治療、放射治療、化學治療、綜合治療、靶向治療及中藥治療等，而不同NSCLC患者對不同治療方案的敏感性不同，腫瘤自身及機體特異性也會限制治療方式〔2〕。腫瘤的發生是一個多基因參與的復雜過程，β-arrestin1是Arrestin蛋白家族的成員之一，具有多種功能的信號蛋白，β-arrestin1在腫瘤的增殖、侵襲和轉移等過程中發揮重要作用〔3〕，且β-arrestin1可通過與磷酸化的G蛋白耦聯受體(GPCR)結合形成β-arrestin1的受體復合物，并以銜接蛋白的形式激活絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)級聯反應，導致蛋白激酶B(AKT)和磷酯酰肌醇-3激酶(PI3K)等多種信號通路的激活，促進腫瘤的發生和發展〔4〕。已有研究證實β-arrestin1可促進卵巢癌〔5〕和前列腺癌〔6〕的侵襲或轉移，但關于β-arrestin1在NSCLC中的表達及作用的研究極少且不明確，僅有β-arrestin1可促進尼古丁誘導的NSCLC轉移〔7〕，β-arrestin1的表達缺失與NSCLC患者的較差預后密切相關〔8〕。本研究旨在探究β-arrestin1對NSCLC細胞增殖能力的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器 兔抗人β-arrestin1單抗和兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多抗(CST，USA)，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(博士德，湖北武漢)，β-arrestin1的抑制性慢病毒載體質粒sh-β-arrestin1及對照空載體質粒sh-control(GeneCopoeia構建，USA)，Lipofectamine2000轉染試劑、Trizol(Invitrogen，USA)，TaqMan逆轉錄試劑盒(Life Technologies，USA)，qSYBR-Green-containing PCR kit試劑盒(GeneCopoeia，USA)，蛋白提取試劑盒、增強化學發光法(ECL)試劑盒和二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量檢測試劑盒(Thermo，USA)，兩步法免疫檢測試劑盒(Dako，USA)，噻唑藍(MTT)細胞生長增殖/毒性檢測試劑盒(Sigma，USA)，BioRad IQTM5 Multicolor實時熒光定量系統(BioRad，USA)，奧林巴斯正置顯微鏡 OLYMPUS BX51(Olympus，日本，配合UIS2光學成像系統使用)，ChemiDocTM觸摸成像系統(Bio-Rad，USA，配合Image LabTMTouch軟件Version 1.0使用)，Multiskan MK 3酶標儀(Thermo，USA)，紫外可見分光光度儀(Thermo，USA，Nanodrop 2000)。

1.2 臨床樣本 本研究中所有組織樣本均來源于成都市第五人民醫院2014年1月至2015年12月經手術治療的30例NSCLC患者(NSCLC組)，標本均經本院病理科證實。NSCLC患者術前均未接受過任何化療及放療，其中男和女各15例，年齡25～80歲，平均(56.9±2.3) 歲，分別取30例NSCLC患者的癌病變切除組織和肺良性病變邊緣5 cm以上的正常肺組織(對照組)。取術中切除的新鮮組織，立即置于RNAlater中，于-80℃保存，用于后續實驗。30例患者的石蠟標本均由本院病理科提供，4 μm厚連續切片10張。該實驗的所有過程均遵從赫爾辛基宣言的標準，且該研究得到本院倫理委員會的批準，且患者簽署了知情同意書。

1.3 細胞系和細胞培養 NSCLC細胞系(SPC-A-1)細胞，H460，H520，H1975和人正常肺上皮細胞系(16HBE，中國科學院上海生命科學院生化細胞所)均培養于含10%胎牛血清(BSA)的RPMI-1640培養基(Gibco，USA)中，細胞置于37℃，飽和濕度，含5% CO2的細胞培養箱內孵育。

1.4 質粒轉染 在SPC-A-1細胞生長匯合度達到80%～90%時收集細胞，用含10% BSA的RPMI-1640培養基稀釋至濃度為5×104個/ml的細胞懸液，按2 ml每孔加入6孔板，細胞匯合度約為60%～80%時準備轉染。使用無菌EP管配制Lipofectamin 2000和轉染試劑(sh-β-arrestin1或sh-control)，兩者輕輕混勻，室溫放置20 min。將上述混合物與不含抗生素的無血清培養基輕輕混勻，加入到待轉染的6孔板中，培養箱中培養6 h后換為常規培養基。48 h后，收集細胞，提取蛋白或RNA，或用于后續實驗。

1.5 RNA提取和qRT-PCR檢測 取術中新鮮獲得的NSCLC組織和正常組織各100 mg，分別加入700 μl TRIzol試劑，充分研磨，(細胞系總RNA提取時每個六孔板中加入100 μl TRIzol試劑，其余試劑均按組織RNA提取時用量的1/7加入)。室溫放置5 min后加入氯仿140 ml，劇烈震蕩15 s后室溫放置5 min，隨后4℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上層液體到另一干凈的EP管，按照每1 ml Trizol中加入0.5 ml異丙醇的比例加入異丙醇，混勻，室溫放置10 min，離心去上清。1 ml 75%乙醇洗滌沉淀，4℃ 7 500 r/min離心5 min，棄上清，室溫干燥，加入30 μl無酶水溶解，取1 μl測RNA濃度及純度，其余-20℃保存備用。

以從組織或細胞系中提取的總RNA為模板，按照TaqMan逆轉錄試劑盒的說明書進行操作，逆轉錄生成cDNA后，以cDNA為模板，按照實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)的說明書進行操作，進行CT值的測定。其中GAPDH為內參，2-ΔΔCT用于計算β-arrestin1基因的相對表達量，ΔΔCT =(CT gene-CTGAPDH)target-(CT gene-CTGAPDH)對照，反應體系為20 μl，每組實驗設置3個復孔。

1.6 蛋白提取和Western印跡檢測 按照蛋白提取試劑盒、ECL試劑盒和BCA蛋白定量檢測試劑盒的說明書進行操作，分別提取細胞總蛋白并測定蛋白濃度。分別取30 μg樣本，進行10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳實驗。將蛋白轉移至聚偏氟丙烯(PVDF)膜上，5%的BSA室溫封閉1～2 h，加入1∶5 000的兔抗人β-arrestin1抗體和1∶10 000兔抗人GAPDH抗體4℃過夜。Tirs鹽酸緩沖液(TBST)洗膜3次，10 min/次，加入1∶800的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，10 min/次，加入ECL發光劑并曝光，采用ChemiDocTM觸摸成像系統掃描并保存蛋白條帶的圖片。Quantity One軟件分析，以目的蛋白β-arrestin1和內參GAPDH的蛋白條帶的灰度值比值來確定目的蛋白的相對表達水平，每組實驗設置3個復孔。

1.7 MTT法檢測β-arrestin1對SPC-A-1細胞增殖能力的影響 將實驗分成sh-control組和sh-β-arrestin1組。將sh-control和sh-β-arrestin1分別轉染到SPC-A-1細胞中，細胞培養于96孔板中，每組設置6個復孔，在未接種細胞的孔中加入DMEM為調零孔，轉染后的細胞在培養箱中培養48 h。隨后每孔加入30 μl的MTT試劑，37℃孵育2 h后，每孔中加入150 μl DMSO，低速振蕩10 min至使結晶物充分融解。酶標儀測定492 nm波長處的OD492值并記錄，每組實驗設置3個復孔，對照組為sh-control組。

1.8 免疫組化(IHC) 將切片依次放入二甲苯-二甲苯-100%無水乙醇-95%無水乙醇-80%無水乙醇-70%無水乙醇中脫蠟，各5 min。隨后高壓鍋內進行抗原修復(玻片置于檸檬酸緩沖液中)，在高壓蒸汽鍋冒氣后，煮5 min，使抗原位點暴露，玻片置于室溫冷卻，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，共3次，5 min/次，輕輕擦干組織周圍PBS，37℃血清封閉30 min，吸水紙擦干組織周圍血清，滴加β-arrestin1抗體，按1∶500稀釋，4℃孵育過夜。第2天進行PBS沖洗，共3次，5 min/次，擦干組織旁PBS，孵育二抗，37℃孵育60 min。

PBS沖洗共3次，5 min/次，加顯色劑(按照Dako兩步法免疫組化試劑盒的說明書進行操作，B溶液和C溶液按50∶1混合)，清水沖洗10 min后，蘇木精復染，水中沖洗干凈切片，依次放入70%無水乙醇-80%無水乙醇-95%無水乙醇-100%無水乙醇-二甲苯-二甲苯。各2 min，將切片置于通風櫥中，中性樹膠封片晾干，顯微鏡下采集200倍的圖像，β-arrestin1蛋白表達的定性研究采用直接觀察是否在胞質中表達，根據陽性細胞在全部組織細胞中所占比例和陽性細胞染色強度判定實驗結果，A：按顯色細胞數計分，陽性細胞數<1/3為1分，1/3～2/3為2分，>2/3為3分。B：按細胞顯色深淺計分，無陽性反應細胞為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。積分數=A×B。A×B=0判斷為(-)，A×B=1～2判斷為(+)，A×B=3～4為()，A×B=5～9為()，β-arrestin1蛋白表達的半定量評分由本院三位病理科技術人員共同閱片打分，取平均值。

1.9 統計學方法 應用SPSS17.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析+LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1 β-arrestin1在SPC-A-1、H460、H520、H1975細胞系和正常肺16HBE的表達 16HBE相比，β-arrestin1 mRNA和蛋白表達水平在NSCLC細胞系中均表達上調(P<0.05)。見圖1。

2.2 β-arrestin1在NSCLC組和對照組中的表達 與對照組比較，β-arrestin1 mRNA和蛋白表達水平在NSCLC組織中均表達上調(P<0.05)。β-arrestin1定位于細胞質，細胞質呈棕黃色或棕褐色者為陽性染色。β-arrestin1在對照組中96.7%(29/30)染色弱陽性，為低表達，在NSCLC組中80.0%(24/30)染色強陽性，為高表達。見圖2。

2.3 β-arrestin1對NSCLC細胞SPC-A-1增殖能力的影響 見圖3。轉染sh-β-arrestin1組的β-arrestin1蛋白和mRNA表達水平顯著低于sh-control組，即轉染成功。轉染48 h后，與sh-control組相比，sh-β-arrestin1組的細胞增殖能力被顯著抑制(P<0.05)。兩組MTT OD平均值為0.91，0.33。

圖1 β-arrestin1在NSCLC細胞系和16HBE中的表達

圖2 β-arrestin1在NSCLC癌組織和癌旁組織中的表達(DAB，×200)

圖3 β-arrestin1對NSCLC細胞SPC-A-1增殖能力的影響

3 討 論

NSCLC患者的生存期和生活質量的改善狀況仍不理想〔9〕。NSCLC的治療方案常根據疾病的分期、組織類型、并發癥或體力狀況來決定，不同的病人所采用的治療方案各不相同，其生存期的延長也不同〔10〕。因此發現NSCLC中異常表達的基因，尋找治療NSCLC的特異性靶點，將大大提升臨床上NSCLC患者的治療效果。β-arrestin1是一類重要的多功能支架蛋白和信號調控因子，是Arrestin家族(S-arrestin、X-arrestin、β-arrestin1和β-arrestin2)成員之一，其廣泛存在人體的各種組織細胞中，可通過促進GPCR的脫敏、內化或信號傳導，從而激活多種受GPCR調控的信號通路，促進細胞的增殖分化活動〔4〕。另外β-arrestin1還參與了多種腫瘤的發生和發展過程，參與多種腫瘤相關的信號通路的調控，β-arrestin1的異常表達和功能異常在多種疾病的進展中發揮了重要作用，如β-arrestin1可促進腎臟、心血管、膽囊和肺的纖維化〔11〕。通過敲除小鼠的β-arrestin1基因，小鼠的存活率得到了明顯提升，且敲除β-arrestin1的小鼠原始肺成纖維細胞表現出更弱的遷徙能力〔12〕。鑒于β-arrestin1在疾病發展中的重要作用，推測β-arrestin1在NSCLC中也發揮了重要的作用，可能是肺癌治療的新靶點。

目前關于β-arrestin1在NSCLC組織和細胞系中的表達及其對肺癌細胞增殖影響的研究較少〔7,8〕，本研究從細胞系的角度表明了β-arrestin1的高表達與NSCLC疾病的發生有關，該結果與白血病細胞系中β-arrestin1高表達相一致〔13〕。本研究從病人組織標本的角度表明了β-arrestin1的高表達與NSCLC疾病的發生有關。其與β-arrestin1在肺腺癌組織中高表達并與血管內皮生長因子相關的研究一致〔14〕。細胞增殖實驗結果顯示β-arrestin1能顯著抑制肺癌細胞SPC-A-1的增殖能力，與已有研究結果相一致〔13〕。本研究說明β-arrestin1有潛力成為NSCLC治療的新靶點，通過β-arrestin1抑制劑干預NSCLC患者中β-arrestin1的表達，將可能延長NSCLC腫瘤患者的生存期，并最終改善患者的生存質量。

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〔2017-04-12修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

四川省醫學科研青年創新課題(No.Q16008)

劉 波(1973-)，男，副主任醫師，主要從事呼吸系統疾病的診斷及治療研究。

劉 曉(1982-)，女，碩士，主治醫師，主要從事肺癌的早期診斷與治療研究。

R73

A

1005-9202(2017)13-3137-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.007