骨關節炎患者軟骨細胞Fas基因增強子區甲基化水平與Fas蛋白表達的相關性

陳 夏 彭 丹 陶 懷 沈 奕 周 政

(中南大學湘雅二醫院骨科，湖南 長沙 410011)

骨關節炎患者軟骨細胞Fas基因增強子區甲基化水平與Fas蛋白表達的相關性

陳 夏 彭 丹 陶 懷1，2沈 奕 周 政

(中南大學湘雅二醫院骨科，湖南 長沙 410011)

目的 通過觀察骨關節炎(OA)軟骨細胞中Fas基因甲基化水平與Fas蛋白表達的相關性，探討Fas基因增強子區異常甲基化在OA發生和發展中的作用。方法 采用亞硫酸氫鈉方法處理基因組DNA，甲基化特異性PCR技術和免疫組織化學法分別檢測14例健康人和35例OA患者軟骨細胞中Fas基因增強子區甲基化水平和相關蛋白表達情況。結果 OA組Fas基因增強子區低甲基化率及軟骨細胞Fas蛋白表達陽性率均明顯高于健康對照組(P<0.01)，且Fas基因低甲基化及蛋白表達與性別，年齡無明顯相關性(P>0.05)。Fas增強子低甲基化與Fas蛋白表達呈顯著正相關(P<0.01)。結論 OA患者關節軟骨細胞Fas基因增強子區呈低甲基化狀態，通過上調Fas蛋白表達參與OA的發生發展。

骨關節炎;Fas增強子;甲基化

近年研究證實軟骨細胞過度凋亡與骨關節炎(OA)發生發展密切相關〔1〕。在某些病理條件下，軟骨細胞中一系列表達調控基因被激活，通過死亡受體途徑介導凋亡的發生。Fas/FasL信號傳導通路是介導細胞凋亡的重要死亡受體途徑。已有研究表明，Fas/FasL通路介導的軟骨細胞凋亡在關節軟骨損傷機制中起著重要的作用，而Fas基因表達受甲基化調控〔2〕。Petak等〔3〕用甲基化特異性PCR檢測了結腸癌患者癌組織細胞中的Fas基因增強子甲基化情況，發現Fas基因增強子甲基化降低了Fas蛋白的表達并且抑制了Fas介導的細胞凋亡，表明甲基化在Fas蛋白表達調控上發揮著重要的作用。 de Andrés等〔4〕也報道OA的發生發展過程與軟骨細胞的DNA甲基化有一定相關性。 因此，DNA甲基化異常是影響細胞Fas表達及Fas介導OA中軟骨細胞凋亡的一個重要機制。本文采用亞硫酸氫鈉測序法檢測關節軟骨細胞中Fas基因增強子區甲基化情況，采用免疫組化法檢測關節軟骨細胞中Fas蛋白的表達情況，以探討Fas基因增強子區甲基化異常在OA發生發展中的作用及其調控機制。

1 材料與方法

1.1 一般材料 14例正常膝關節軟骨組織取自2012年9月至2014年7月因交通事故在中南大學湘雅二醫院行大腿中下段截肢的患者，男8例，女6例；年齡30～62(平均40)歲。35例OA膝關節軟骨組織取自2013年9月至2014年在中南大學湘雅二醫院就診，根據1995年美國風濕協會骨關節炎的診斷標準，診斷為OA且有關節置換手術指征的患者，男16例，女19例；年齡52～79(平均65)歲。術中無菌采集標本，每組標本分為2份∶1份放液氮內保存，進行DNA甲基化檢測；另 1份石蠟包埋，進行免疫組化分析。

1.2 亞硫酸氫鈉測序 軟骨細胞DNA提取參照TIANGEN公司的血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒具體說明進行操作：取軟骨組織50 mg，經EDTA脫鈣液脫鈣后，加入組織裂解液進行勻漿，勻漿經蛋白酶K消化后，用吸附柱法提取軟骨組織DNA,分光光度計檢測DNA純度和濃度，瓊脂糖凝膠電泳法鑒定DNA完整性，4℃保存備用。取30 μl DNA 水溶液用EZ DNA甲基化試劑盒(北京天漠公司)進行純化和DNA甲基化修飾,處理后的DNA儲存在-70℃冰箱中保存。根據文獻〔3〕報道的引物序列，由上海生工生物工程技術有限公司合成。Fas甲基化上游引物序列為5′-AGTTTCGGCGTTTTTCGGAGATTATTGC-3′，下游引物序列為5′-CACCCGCGCCGAAACGAACC-3′；Fas非甲基化上游引物序列為5′-GGTAGTTTTGGTGTTTTTTGGAGATTATTGT-3′,下游引物序列為5′-CACCCACACCAAAACAAACCTTTAAC-3′。PCR總反應體系20 μl,DNA模板2.0 μl，上游和下游引物(10 μmol/L)各0.8 μl，Taq酶10 μl，加ddH2O稀釋至總體積20 μl。取5 μl擴增產物上樣，以2 μl DNA Marker作為標準對照,2%瓊脂糖凝膠電泳，恒電壓(120 V)電泳25 min，溴乙啶染色，紫外燈下檢測擴增產物，拍照保存圖片后，含目的樣品的PCR產物置于4℃保存備用。

1.3 免疫組織化學檢測 石蠟包埋組織標本，5 μm連續切片。采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶SP法檢測，切片常規脫蠟處理后，置于抗原修復液中95℃修復10～15 min，其余步驟參照說明書進行。切片經梯度乙醇脫水、干燥、二甲苯透明，中性樹膠封固后，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件進行χ2檢驗或Fisher確切概率法檢驗和Spearman等級相關分析。

2 結 果

2.1 DNA完整性檢測 提取的基因組DNA經2%瓊脂糖凝膠電泳，DNA片段大于600 bp。DNA完整，無降解，見圖1。

2.2 OA患者和健康人軟骨細胞中Fas增強子區甲基化狀態比較 以DNA Marker作為對照，其中OA組與健康對照組軟骨細胞Fas基因增強子區低甲基化百分率分別為74.29%(26/35)和28.57%(4/14)，兩組差異有統計學意義(χ2=8.803，P=0.003)，見圖2。

1：DNA Marker;2～8：DNA樣品1～7圖1 基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳條帶

2.3 OA患者和健康人軟骨細胞中Fas蛋白表達情況 Fas 蛋白表達陽性表現為胞質或核膜出現棕黃色染色，經分析，OA組與健康對照組軟骨細胞Fas蛋白陽性率分別為77.14%(27/35)和14.29%(2/14)，兩組間差異有統計學意義(χ2=16.356，P=0.002)，見圖3。

1：DNA Marker;2:Fas增強子區甲基化引物擴增后的產物(184 bp)；3：Fas增強子區非甲基化引物擴增后的產物(187 bp)圖2 兩組Fas基因增強子區甲基化狀態

圖3 兩組軟骨細胞中Fas蛋白表達情況(DAB，×200)

2.4 Fas基因甲基化及蛋白表達與性別、年齡之間的關系 Fas基因低甲基化及Fas蛋白表達與性別、年齡無明顯相關性(P>0.05)，見表1。

表1 所有研究對象Fas基因低甲基化及蛋白表達與性別、年齡的關系(n)

2.5 OA患者軟骨細胞中Fas增強子區低甲基化狀態與蛋白表達的關系 26例Fas增強子低甲基化的OA患者中，有24例蛋白表達陽性；而27例Fas蛋白表達陽性的OA患者中，有24例Fas增強子低甲基化，Fas增強子低甲基化與蛋白表達呈顯著正相關(r=0.614,P<0.01)。

3 討 論

OA是一種以關節軟骨退行性病變和關節周圍骨質增生為病理特征的慢性退行性疾病，其發病率隨年齡增長逐漸增加。軟骨細胞作為成熟軟骨組織內唯一細胞類型，在軟骨損傷及重塑過程中維持軟骨組織內環境穩定，特別是軟骨細胞凋亡對OA 軟骨破壞起著關鍵性作用。已有研究表明，軟骨細胞凋亡參與了OA 的發生和發展〔5,6〕。Fas 蛋白是一種含有319個氨基酸的Ⅰ 型跨膜蛋白，可與細胞因子FasL結合傳導由FasL引起的細胞凋亡程序。Fas蛋白在正常軟骨細胞內有一定水平的表達，介導軟骨細胞處于凋亡與增殖的動態平衡之中。Kim等〔7〕研究報道鳥苷代謝物通過增強Fas-FasL相互作用誘導軟骨細胞凋亡，表明軟骨細胞中Fas/FasL信號傳導通路異常可能通過介導軟骨細胞凋亡參與OA發生和發展過程。Tu 等〔8〕報道也證實OA 軟骨細胞中Fas蛋白較正常軟骨組織細胞高表達。本研究也發現與正常人相比，OA患者骨關節軟骨組織中Fas蛋白明顯高表達。因此，本文推測Fas蛋白表達增加可能是OA的發病機制之一。

在某些病理情況下，基因增強子區域CpG島的甲基化干擾一些轉錄因子與基因調控區的結合或直接抑制RNA聚合酶活性而抑制基因的表達。Petak等〔3〕發現結腸癌患者癌組織細胞中Fas基因增強子區域DNA甲基化降低了Fas蛋白的表達并且抑制了Fas介導的細胞凋亡。Thaler等〔9〕發現小鼠原成骨細胞中Fas蛋白的表達下降與Fas基因的異常甲基化有密切關系。Jones等〔10〕發現Sezary綜合征中Fas基因的蛋白表達下降與Fas基因的高甲基化有關。因此，本文推測OA患者骨關節組織中Fas蛋白高表達可能與Fas基因增強子區甲基化異常有關。

Fas基因低甲基化改變后，轉錄因子與低甲基化的增強子區域的DNA的結合，促進Fas基因的轉錄和表達，導致Fas基因蛋白表達增加，而Fas蛋白的異常高表達，增加了Fas/FasL介導的細胞凋亡，使軟骨細胞凋亡增加，最終參與了骨關節炎的發生和發展。

1 Wang F,Wu L,Li L,etal.Monotropein exerts protective effects against IL-1β induced apoptosis and catabolic responses on osteoarthritis chondrocytes〔J〕.Int Immunopharmacol,2014;23(2):575-80.

2 Hoa T,Hasunma T,Aono H,etal.Novel mechanisms of selective apoptosis in synovial T cells of with rheumatoid arthritis〔J〕.J Rheumatol,1996;23(7):1331-6.

3 Petak I,Danam RP,Tillman DM,etal.Hypermethylation of the gene promoter and enhancer region can regulate Fas expression and sensitivity in colon carcinoma〔J〕.Cell Death Differ,2003;10(2):211-7.

4 de Andrés MC,Imagawa K,Hashimoto K,etal.Loss of methylation in CpG sites in the NF-κB enhancer elements of inducible nitric oxide synthase is responsible for gene induction in human articular chondrocytes〔J〕.Arthritis Rheum,2013;65(3):732-42.

5 Zamli Z,Robson Brown K,Tarlton JF,etal.Subchondral bone plate thickening precedes chondrocyte apoptosis and cartilage degradation in spontaneous animal models of osteoarthritis〔J〕.Biomed Res Int,2014;2014：1-10.

6 Zamli Z,Adams MA,Tarlton JF,etal.Increased chondrocyte apoptosis is associated with progression of osteoarthritis in spontaneous Guinea pig models of the disease〔J〕.Int J Mol Sci,2013;14(9):17729-43.

7 Kim DJ,Chung JH,Ryu EK,etal.Metabolic loading of guanosine induces chondrocyte apoptosis via the Fas pathway〔J〕.Exp Mol Med,2006;38(4):401-7.

8 Tu Y,Xue H,Francis W,etal.Lactoferrin inhibits dexamethasone-induced chondrocyte impairment from osteoarthritic cartilage through up-regulation of extracellular signal-regulated kinase 1/2 and suppression of FASL,FAS,and Caspase 3〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2013;441(1):249-55.

9 Thaler R,Karlic H,Spitzer S,etal.Extra-cellular matrix suppresses expression of the apoptosis mediator Fas by epigenetic DNA methylation〔J〕.Apoptosis,2010;15(6):728-37.

10 Jones CL,Wain EM,Chu CC,etal.Downregulation of Fas gene expression in Sézary syndrome is associated with promoter hypermethylation〔J〕.Invest Dermatol,2010;130(4):1116-2.

〔2016-01-30修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

彭 丹(1966-)，男，博士，教授，博士生導師，主要從事骨性疾病發生機制研究。

陳 夏(1984-)，男，博士，主治醫師，主要從事骨性疾病發生機制研究。

R684.3

A

1005-9202(2017)13-3188-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.028

1 湖南中醫藥大學醫學院生物化學與分子生物學教研室

2 湖南中醫藥大學干細胞調控與應用實驗室