CD36在氧化低密度脂蛋白降低鼠源細胞錳超氧化物歧化酶活性中的作用

王 釗

(邢臺市人民醫院普外科，河北 邢臺 054000)

CD36在氧化低密度脂蛋白降低鼠源細胞錳超氧化物歧化酶活性中的作用

王 釗

(邢臺市人民醫院普外科，河北 邢臺 054000)

目的 探討CD36在氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)降低大鼠錳(Mn)超氧化物歧化酶(SOD)活性中的作用。方法 將鼠源RAW264.7巨噬細胞按照處理方式分為ox-LDL處理組和抗CD36拮抗組；ox-LDL處理組在培養液中加入100 mg/L ox-LDL，抗CD36拮抗組在培養液中先加入2 mg/L抗CD36 mAb預處理1 h，再加入100 mg/L ox-LDL。實驗結束后比較兩組細胞凋亡率和Mn-SOD活性。結果 ox-LDL處理組24、48 h的細胞凋亡率〔分別為(10.8±2.91)%與(29.88±4.47)%〕明顯高于抗CD36拮抗組〔(5.83±1.18)%與(7.63±1.64)%〕(均P<0.05)。兩組0 h時Mn-SOD活性無顯著差異(P>0.05)；ox-LDL處理組24、48 h的Mn-SOD活性〔分別為(17.17±2.90)%與(16.73±2.87)%〕明顯低于抗CD36拮抗組〔(29.34±4.72)%與(22.83±3.72)%〕(均P<0.05)。結論 CD36在ox-LDL所介導的脂質轉運和代謝過程中具有重要作用。

CD36；氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)；錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)

研究表明低密度脂蛋白(LDL)氧化是動脈粥樣硬化(AS)的重要特征，氧化(ox)-LDL是LDL經氧化修飾后形成的，此反應與體內的氧化應激有關〔1〕。作為一種脂蛋白氧化產物，在腦梗死的發生、發展過程中發揮重要作用。研究證明脂質豐富的斑塊往往結合更多的ox-LDL抗體，因此ox-LDL的含量高低與斑塊的不穩定性密切相關〔2，3〕。抗氧化酶類是體內最重要的對抗自由基氧化損傷的防御系統，其中超氧化物歧化酶(SOD)是體內對抗自由基的第一道防線，其廣泛存在于自然界的動物、植物及一些微生物體內，能夠清除生物體內的氧自由基，是最重要的抗氧化酶〔4，5〕。CD36是一種多功能的清道夫受體，可介導細胞ox-LDL的內吞和降解。本研究通過分析CD36在ox-LDL降低大鼠錳(Mn)-SOD活性中的所發揮的作用，以探討LDL的降脂作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養與實驗分組 鼠源RAW264.7巨噬細胞購自中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所細胞庫，用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的杜爾伯科改良伊格爾培養基(DMEM)培養于37℃、5%CO2的培養箱中。采用抗CD36單克隆抗體封閉受體(2.5 mg/L)，將細胞分為ox-LDL處理組和抗CD36拮抗組；ox-LDL處理組在培養液中加入100 mg/L ox-LDL，抗CD36拮抗組在培養液中先加入2 mg/L抗CD36 mAb預處理1 h，再加入100 mg/L ox-LDL。

1.2 主要試劑與儀器 DMEM(Hyclone)，ox-LDL(北京協生生物科技有限公司)，SOD及分型SOD檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)，抗CD36單克隆抗體，AnnexinⅤ-FITC 試劑，流式細胞儀(Beckman Coutler Epics XL)，超聲細胞破碎儀(Cole-Parmer CPX400)。

1.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 收集細胞，用0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化細胞，制備細胞懸液，離心棄上清液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，收集細胞，用Annexin V-FITC試劑盒中結合緩沖液懸浮細胞，調節濃度為1×106/ml，取100 μl按試劑盒說明上機檢測。

1.4 黃嘌呤氧化酶法測定Mn-SOD的活性 用超聲細胞破碎儀將細胞破碎，按照試劑盒說明檢測總SOD和銅/鋅(Cu/Zn)SOD的活性，Mn-SOD活性=總SOD活性-Cu/Zn SOD活性。

1.5 統計學方法 采用SPSS20.0統計軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1 兩組細胞凋亡率比較 ox-LDL處理組24、48 h細胞凋亡率〔分別為(10.8±2.91)%與(29.88±4.47)%〕明顯高于抗CD36拮抗組〔(5.83±1.18)%與(7.63±1.64)%〕(t=4.928,t=11.390；均P<0.001)。

2.2 兩組Mn-SOD活性比較 兩組0 h時Mn-SOD活性無顯著差異(P>0.05)；抗CD36拮抗組處理24、48 h明顯高于ox-LDL處理組(P<0.001)。見表1。

表1 兩組處理后各時點Mn-SOD活性比較

3 討 論

ox-LDL是造成內皮損傷的重要因素，可通過多種機制損傷內皮細胞，在AS等疾病的發生與發展中起著重要作用〔6〕。與ox-LDL的相關受體很多，其中CD36和凝集素樣氧化型LDL受體(LOX)-1在近年來備受關注〔7，8〕。LOX-1是ox-LDL的特異性受體，與血管內皮細胞攝取和代謝ox-LDL密切相關；ox-LDL可導致CD36上調，引起內皮細胞損傷，促進AS斑塊形成。SOD 是生物體內各個組織中唯一能夠特異性清除氧自由基的抗氧化酶，能平衡生物體的氧自由基，使機體免受到氧自由基的危害。其中以線粒體中的Mn-SOD的作用最為重要，在體內活性氧系統和氧化還原有關的平衡體系中發揮著關鍵作用〔9〕。根據活性中心所含金屬離子的不同，SOD主要可分為Mn-SOD、鐵(Fe)-SOD及Cu/Zn-SOD。Mn-SOD存在于所有真核及原核生物的線粒體中，后者又是細胞產生能量和進行有氧代謝的重要場所，因此也是自由基產生的場所，故要防止自由基對線粒體的損傷，Mn-SOD作用具有重要地位〔10〕。CD36具有介導細胞黏附、細胞分化、細胞信號傳遞、參與長鏈脂肪酸的轉運等作用。CD36是巨噬細胞表面主要識別、攝取ox-LD的B類清道夫受體，其結合和攝取的ox-LDL占到巨噬細胞結合和攝取修飾脂質總量的50%以上，且不受細胞內膽固醇含量的負反饋調節。研究發現，抑制CD36表達則可減緩AS進展；CD36缺乏患者的單核細胞與ox-LDL的最大結合率比正常人要低40%〔7〕。本研究提示預先用抗CD36的單克隆抗體封閉細胞，減少細胞對ox-LDL的吞噬作用，因此抑制ox-LDL所產生的細胞凋亡作用。Mn-SOD主要位于線粒體，多為誘導表達型。而線粒體在新陳代謝過程中產生的氧自由基及細胞因子如腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β、干擾素(IFN)-γ等都會對Mn-SOD的表達產生誘導作用。當細胞被抗CD36的單克隆抗體封閉后，細胞相關的代謝與降解受到抑制，細胞內脂質過氧化反應的代謝終產物明顯降低，Mn-SOD消耗減少，活性增高。而ox-LDL處理組由于脂質代謝產物的增加，細胞內的氧自由基堆積，消耗了大量的Mn-SOD，因此Mn-SOD活性下降。

綜上，CD36在ox-LDL所介導的脂質轉運和代謝過程中具有重要作用，在研究調血脂及防治動脈粥樣硬化藥物，防治心腦血管疾病中具有重要意義。

1 葉南慧，林艷云，劉樹滔，等.口服PTD-SOD對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用〔J〕.中國現代應用藥學，2011；28(7)：602-6.

2 Niizuma K，Yoshioka H，Chen H，etal.Mitochondrial and apoptotic neuronal death signaling pathways in cerebral ischemia〔J〕.Biochim Biophys Acta,2010；1802(1)：92-9.

3 苗 成，李金國，苗 芳，等.槲皮素對ox-LDL所致的小鼠巨噬細胞脂質蓄積和過氧化的影響〔J〕.中國病理生理雜志，2013；29(8)：1370-4.

4 Sakata H，Niizuma K，Wakai T，etal.Neural stem cells genetically modified to overexpress Cu/Zn-superoxide dismutase enhance amelioration of ischemic stroke in mice〔J〕.Stroke，2012；43(9)：2423-9.

5 趙 莉，姚樹桐，陳 軍，等.載脂蛋白A-I模擬肽D-4F對巨噬細胞源性泡沫細胞清道夫受體 A1 的抑制作用〔J〕.中國病理生理雜志，2014；30(10)：1742-7.

6 Fukui M，Zhu BT.Mitochondrial superoxide dismutase SOD2，but not cytosolic SOD1，plays a critical role in protection against glutamate-induced oxidase stress and cell death in HT22 neuronal cells〔J〕.Free Radic Biol Med，2010；48(6)：821-30.

7 姚樹桐，桑 慧，楊娜娜，等.氧化低密度脂蛋白誘導巨噬細胞內質網應激及CD36的可能作用〔J〕.生理學報，2010；62(5)：433-40.

8 Liao X，Sluimer JC，Wang Y，etal.Macrophage autophagy plays a protective role in advanced atherosclerosis〔J〕.Cell Metab，2012；15(4)：545-53.

9 Velikkakath AK，Nishimura T，Oita E，etal.Mammalian Atg 2 proteins are essential for autophagosome formation and important for regulation of size and distribution of lipid droplets〔J〕.Mol Biol Cell，2012；23(5)：896-909.

10 Yao S，Miao C，Tian H，etal.Endoplasmic reticulum stress promotes macrophage-derived foam cell formation by up-regulating cluster of differentiation 36(CD36) expression〔J〕.J Biol Chem，2014；289(7)：4032-42.

〔2016-03-27修回〕

(編輯 苑云杰)

王 釗(1982-)，男，碩士，主治醫師，主要從事普通外科疾病研究。

R363.2

A

1005-9202(2017)13-3190-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.029