肝細胞癌患者CNTN1檢測的臨床意義

趙冀，周超，李宏敏

（四川省人民醫院 1.器官移植中心，2.消化內科，3.腫瘤科，四川 成都 610072）

肝細胞癌患者CNTN1檢測的臨床意義

趙冀1，周超2，李宏敏3

（四川省人民醫院 1.器官移植中心，2.消化內科，3.腫瘤科，四川 成都 610072）

目的 檢測肝細胞癌（HCC）患者腫瘤組織中接觸蛋白1（CNTN1）的表達水平，及其對患者疾病預后價值的分析。方法采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）和Western blot檢測25例新鮮HCC樣本，以及鄰近非腫瘤組織中CNTN1 mRNA和蛋白的表達，同時采用免疫組織化學法檢測135例石蠟包埋HCC樣本與鄰近非腫瘤組織中CNTN1的蛋白表達，統計分析其表達與HCC患者臨床病理特征的關系，采用RNAi技術干擾肝癌細胞系HepG2 CNTN1的表達，對其進行腫瘤細胞侵襲和轉移能力檢測。結果25例新鮮HCC樣本qRT-PCR和Western blot檢測結果表明，與鄰近非腫瘤組織相比，HCC組織中CNTN1 mRNA和蛋白表達均上調（P＜0.05）。免疫組織化學法結果證實62.22%（84/135）HCC樣本為CNTN1陽性，高于鄰近非腫瘤組織17.78%（24/135）（P＜0.05）。Kaplan–Meier生存分析表明，CNTN1陽性HCC患者無疾病生存率和總生存率低于陰性患者。CNTN1表達與HCC患者腫瘤轉移、乙型肝炎病毒感染、淋巴結腫瘤轉移分期及腫瘤直徑相關（P＜0.05）。RNAi實驗表明，干擾CNTN1表達后HepG2細胞活力下降（P＜0.05）。多重變量分析表明，CNTN1表達是HCC患者無疾病生存期和總生存期的獨立標志物（P＜0.05）。結論HCC患者腫瘤組織中CNTN1蛋白表達上調，且其表達與腫瘤惡性狀態密切相關，參與肝細胞癌的侵襲和轉移，可以作為HCC患者疾病預后的獨立標志物。

接觸蛋白1；肝細胞癌；預后；生物標志物

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）在全球常發惡性腫瘤中排第5位，在腫瘤病死率排第3位[1]。我國乙肝患者數量較多，導致肝細胞癌高發[2]。術后復發和腫瘤轉移是導致HCC患者疾病預后不良的主要因素[3]。接觸蛋白 1（contactin 1，CNTN1）是免疫球蛋白超家族成員，屬于糖基磷脂酰肌醇錨定的神經細胞黏附分子。報道表明，CNTN1在胃癌、肺癌等惡性腫瘤中表達上調，且與上述腫瘤患者疾病發展、侵襲及轉移密切相關[4-6]。目前CNTN1在肝細胞癌中研究報道較少，本研究旨在檢測HCC組織中CNTN1的表達水平及其對患者疾病預后價值的分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年1月-2012年12月四川省人民醫院收治的135例肝細胞癌患者，取其石蠟樣本及相應的臨近非腫瘤組織樣本（距離腫瘤組織＞2 cm）。25例新鮮樣本采集后液氮浸泡，分別用于提取總RNA和蛋白。本研究納入患者均通過病理檢查確診，臨床樣本采集及后續研究均獲得患者同意和本院醫學倫理審查。通過病歷獲取患者一般資料。

1.2 細胞及RNAi實驗

人肝癌細胞（human hepatocellular carcinoma cell，HepG2）購自美國模式培養物保藏所，常規方法培養[7]。分為正常組與RNAi組，RNAi組干擾前將HepG2按2×105個/孔，鋪6孔板，換無血清改良培養基，細胞匯合度達40%時進行干擾。根據Lipofectamine說明書將siRNA duplex-Lipofectamine RNAi MAX加入培養基。孵育4 h后，換成含10%胎牛血清培養基，干擾后測定細胞活力。CNTN1靶標siRNA和陰性對照siRNA購自上海基因治療有限公司。siRNA正向引物：5'-GAUGGAAAGUGAGGAAGACAGUAAU-3'，反向引物：5'-AUUACUGUCU UCCUCACUUUCCAUC-3'；陰性對照RNA正向引物：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'， 反 向引物：5'-AUUACUGUCUUCCUCACUUUCCAUC-3'。

1.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應

采用Trizol方法提取組織總RNA，紫外分光光度計測定RNA純度和濃度后，取2 μg進行逆轉錄，生成cDNA。采用SYBR green染料法進行實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR） 檢測，CNTN1 正向引物：5'-CCTAGTTCGTCATGGGTGTGAACCA-3'，反向引物：5'-GCCAGTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3'。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因為內參，GAPDH 正向引物：5'-CCTAGTTCGTCATGGGTGTGAACCA-3'，反向引 物 ：5'-GCCAGTAGA GGCAGGGATGATGTTC-3'。擴增條件及計算方法參考文獻[8]。

1.4 Western blot檢測

常規方法提取組織總蛋白，二喹啉甲酸方法測定蛋白質含量后，進行凝膠電泳，上樣20μg/孔，電轉至聚偏氟乙烯薄膜上后，3%脫脂奶封閉2 h，分布孵育抗人CNTN1和GAPDH一抗，4℃孵育過夜，三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液（tris buffered saline and tween 20，TBST）洗膜，孵育二抗后顯影。采用Quantity one軟件對條帶亮度進行分析。

1.5 免疫組織化學法

采用常規方法制備5 μm厚的石蠟切片，進行免疫組織化學法染色，在10 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）熱激30 min介導抗原復性，采用抗CNTN1單克隆抗體孵育，4℃過夜。洗滌后孵育二抗，加顯色液后進行曝光。根據染色強度進行判定，總分0～3分，0分為無染色，1分為弱染色，2分為中度染色，3分為強染色。

1.6 細胞活力檢測

取1.2中干擾后的HepG2細胞和HepG2細胞，按1×103個/孔接種于96孔板，培養至細胞密度為60%時，換為無血清的達爾伯克必需基本培養基（dulbecco's minimum essential medium，DMEM），分別培養8、24、48和 72 h后，按照 Presto blue cell viability rgnt試劑盒（南京科佰生物科技有限公司）加入Presto Blue試劑，二氧化碳CO2培養箱37℃孵育10 min，取出96孔板酶標儀進行檢測。

1.7 統計學方法

數據分析采用SPSS 22.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，用獨立t檢驗或重復測量設計的方差分析；計數資料以率表示，用χ2檢驗；總生產率與無疾病生存率的評估用Kaplan-Meier檢驗，兩組生存曲線的比較用Log-rank檢驗，多重變量分析用Cox比例危險模型進行，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 正常組與RNAi組不同時間細胞活力的比較

正常組與RNAi組在8、24、48和72 h細胞活力比較，采用重復測量數據的方差分析，結果：①不同時間細胞活力比較，差異有統計學意義（F=17.841，P=0.000）；②正常組與RNAi組細胞活力比較，差異有統計學意義（除8 h時間）（F=91.561，P=0.000）。③正常組和RNAi組細胞活力變化趨勢有差異（F=15.215，P=0.000）。見表 1 和圖 1。

2.2 CNTN1 mRNA和蛋白的比較

圖1 HepG2細胞活力

采用qRT-PCR檢測25對肝細胞癌樣本和臨近非腫瘤組織樣本，肝細胞癌CNTN1 mRNA表達量為（7.22±1.85），與非腫瘤組織（2.81±1.42）比較，差異有統計學意義 （t=0.236，P=0.003）；Western blot檢測結果表明，肝細胞癌CNTN1蛋白表達量為（1.32±0.61），與非腫瘤組織（0.83±0.50）比較，差異有統計學意義（t=0.416，P=0.003），肝細胞癌高于與非腫瘤組織。見圖2、3。

表1 兩組不同時間細胞活力比較 （±s）

表1 兩組不同時間細胞活力比較 （±s）

注：?與正常組比較，P＜0.05

組別72 h正常組 470.00±13.64 820.00±23.64 1320.00±39.69 2120.00±43.64 RNAi組 468.00±13.89 482.00±25.67? 760.00±30.64? 96.00±33.56?8 h 24 h 48 h

圖2 CNTN1 mRNA和蛋白的表達

2.3 CNTN1表達與HCC患者臨床病理特征的關系

采用免疫組織化學法檢測135例HCC樣本CNTN1蛋白的表達，62.22%（84/135）HCC 樣本為CNTN1陽性，高于臨近非腫瘤組織的17.78%（24/135）（χ2=55.556，P=0.005）。CNTN1 表達與 HCC 患者腫瘤轉移、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染、腫瘤淋巴結轉移（tumor node metastasis，TNM）分期及腫瘤直徑相關（P＜0.05）。見表2和圖4。

2.4 CNTN1表達與HCC患者疾病預后的關系

圖3 CNTN1蛋白的表達

表2 患者臨床病理特征與HCC樣本CNTN1表達的關系

圖4 HCC樣本中CNTN1的表達（免疫組織化學法×400）

為進一步探討HCC樣本中CNTN1表達與患者疾病預后的關系，采用Kaplan-Meier生存曲線分析其表達與患者隨訪總生存率及無疾病生存期的關系。CNTN1陽性HCC患者的總生存期（19.96±9.39）個月低于陰性患者[（31.27±11.45）個月]（P=0.006）。此外CNTN1陽性HCC患者的無疾病生存期（13.61±8.63）個月低于陰性患者[（24.51±10.41）個月]（P=0.003）。多重變量分析表明，CNTN1表達是HCC 患者總生存期[HR=2.383（95%CI：1.262，4.503）P=0.003]和無疾病生存期[HR=2.356（95%CI：1.370，4.049）P=0.003]的獨立預后因素。見圖5。

圖5 HCC患者CNTN1表達的Kaplan-Meier生存曲線分析

3 討論

CNTN1與多種細胞表面蛋白相互作用，可能參與多種細胞表面信號轉導[9]，其作為神經系統黏附分子，也參與腫瘤細胞的血管內皮生長因子C/血管內皮生長因子受體3信號通路。研究表明，CNTN1參與多種腫瘤細胞的侵襲和轉移調節，CNTN1基因敲除后能導致肺腺癌細胞轉移抑制，增加負瘤小鼠的存活率[10]。CNTN1的腫瘤調節作用在多數人類惡性腫瘤中均有報道，而其在肝細胞癌發生、發展中的作用研究較少。

本研究表明，HCC樣本中CNTN1 mRNA和蛋白表達均上調。RNAi實驗表明，HepG2細胞在干擾CNTN1表達后，細胞活力下降。本實驗結果表明，CNTN1表達上調與HCC患者腫瘤轉移、HBV感染、TNM分期及腫瘤直徑相關。此外，免疫組織化學法染色證實CNTN1陽性患者的總生存率和無疾病生存率低于CNTN1陰性患者，CNTN1表達是HCC患者疾病預后不良獨立標志物。

盡管文獻和本研究數據均證實CNTN1能促進腫瘤細胞侵襲和轉移，但是其中的調節機制目前尚不清楚，筆者推測CNTN1可能通過激活Akt途徑促進HCC發展。YAN等[6]采用A549細胞證實，CNTN1能使E-鈣黏著糖蛋白表達下調，且Akt激活在CNTN1下調E-鈣黏著糖蛋白表達過程中發揮重要作用。現有研究表明，HCC腫瘤中PI3K-Akt-mTOR信號途徑異常[11-13]。ZHOU等[14]研究表明，上述通路異常常導致HCC患者疾病預后不良。

本研究結果證實，HCC患者腫瘤組織中CNTN1蛋白表達上調，且其表達與腫瘤惡性狀態相關，參與肝細胞癌的侵襲和轉移，可以作為HCC患者疾病預后的獨立標志物。

[1]代佑果,李為明,唐輝蓉,等.生理性深層海水聯合熱療治療肝細胞癌的體外抑瘤研究[J].重慶醫學,2016,7:899-902.

[2]高會霞,王彬,周希山.VEGF-C、VEGFR-3及CNTN-1的表達與胃癌淋巴結轉移的關系[J].中國實用醫藥,2013,34:123-124.

[3]亢艦,丁千山,戴金芬,等.干擾AGXT2L1表達對肝細胞癌細胞運動、遷移和侵襲能力的影響[J].武漢大學學報（醫學版）,2016,3:414-417.

[4]YU J W,WU S H,LU R Q,et al.Expression and significances of contactin-1 in human gastriccancer[J].GastroenterolRes Pract,2013,DOI:10.1155/2013/210205.

[5]LIU Y C,ZHAO J,HU C E,et al.Comprehensive analysis of vascular endothelial growth factor-C related factors in stomach cancer[J].Asian Pac J Cancer Prev,2014,15:1925-1929.

[6]YAN J,WONG N,HUNG C,et al.Contactin-1 reduces E-cadherin expression via activating AKT in lung cancer[J].PLoS One,2013,8,DOI:10.1371/journal.pone.0065463.

[7]李先建,何劍波,陳闖,等.水蛭素對肝細胞癌HepG2細胞抑制作用機制探討[J].中國癌癥防治雜志,2016,1:7-11.

[8]吳生華,俞繼衛,鄭林海,等.CNTN-1、VEGF-C和VEGFR-3在胃癌組織中的表達及其臨床意義[J].中國普外基礎與臨床雜志,2011,2:142-148.

[9]李光耀,莢衛東,程亞,等.CNTN-1表達在肝癌術后早期復發中的預測價值[J].安徽醫科大學學報,2016,4:587-591.

[10]EDGE S B,BYRD D R,COMPTON C C,et al.The American joint committee on cancer:the 7th edition of the AJCC cancer staging manual and the future of TNM[J].Ann Surg Oncol,2010,17:1471-1474.

[11]張萌,彭利,喬治斌,等.pAkt、Skp2和P27kip1蛋白在肝細胞癌中的表達及意義[J].腫瘤防治研究,2011,11:1283-1287.

[12]許秋然,鄭鑫,昝獻峰,等.膠質瘤相關癌基因1在肝細胞癌中的表達及其與Shh、Vimentin、E-cad-herin蛋白的相關性研究[J].細胞與分子免疫學雜志,2012,5:536-539.

[13]張萌,彭利,喬治斌,等.PTEN、Akt和pAkt蛋白在肝細胞癌組織中的表達及其與預后的關系[J].世界華人消化雜志,2011,18:1904-1910.

[14]ZHOU L D,HUANG Y,LI J D,et al.The mTOR pathway is associated with the poor prognosis of human hepatocellular carcinoma[J].Med Oncol,2010,27:255-261.

（童穎丹 編輯）

Feasibility of contactin 1 as a novel prognostic marker for hepatocellular carcinoma

Ji Zhao1,Chao Zhou2,Hong-min Li3
(1.Organ Transplantion Center;2.Department of Gastroenterology;3.Department of Oncology,Sichuan Provincial People's Hospital,Chengdu,Sichuan 610072,China)

ObjectiveTo evaluate the feasibility of contactin 1 (CNTN1)as a novel prognostic marker for epithelial hepatocellular carcinoma.MethodsqRT-PCR and Western blot were performed to assess the mRNA and protein levels of CNTN1 in 25 matched fresh HCC specimens.The clinical and prognostic significance of CNTN1 in 135 cases of HCC was determined by immunohistochemistry.The correlations between CNTN1 expression and clinicopathological characteristics were analyzed.The expression of CNTN1 in HepG2 cells was interfered by RNAi technique,then the invasive and metastatic abilities of the HepG2 cells were determined.ResultsCNTN1 expression in the fresh HCC tissues was higher than that in the paracancerous tissues at both mRNA and protein levels(P＜0.05).Notably,immunohistochemical results revealed that CNTN1 expression significantly increased in the HCC compared to the adjacent tissues (62.22%vs 17.78%,P＜0.05).The vitality of HepG2 cells was significantly decreased after RNA interference (P＜0.05).Furthermore,positive CNTN1 expression was associated with tumor size,HBV infection,metastasis,and tumor-node-metastasis stage (P＜0.05).Kaplan-Meier survival analysis showed that high CNTN1 was correlated with reduced overall survival(OS)rate(P＜0.05)and disease-free survival(DFS)rate(P＜0.05).Multivariate analysis identified CNTN1 as an independent poor prognostic factor of OS and DFS in HCC patients (P＜0.05).ConclusionsOur resultssuggest that CNTN1 expression is up-regulated in HCC and closely correlated with the invasion and metastasis of HCC.It can be served as an independent unfavorable prognostic marker for HCC.

contactin 1;hepatocellular carcinoma;prognosis,biomarker

R735.7

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.12.010

1005-8982（2017）12-0050-05

2016-06-29