血必凈治療腹腔感染的實驗研究*

張瑋，朱艷娜，劉守信

（大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 藥學(xué)部，遼寧 大連 116011）

血必凈治療腹腔感染的實驗研究*

張瑋，朱艷娜，劉守信

（大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 藥學(xué)部，遼寧 大連 116011）

目的 研究血必凈對大鼠腹腔感染急性胰腺炎的作用及其機(jī)制。方法SD大鼠30只，隨機(jī)分為3組，包括假手術(shù)組、胰腺炎組及血必凈組。假手術(shù)組僅行開關(guān)腹手術(shù)，胰腺炎組以3.5%牛磺膽酸鈉復(fù)制模型，血必凈組注射血必凈治療。光鏡觀察胰腺組織病理改變，酶聯(lián)免疫吸附法測定血清淀粉酶、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及白介素6（IL-6），同時分離中性粒細(xì)胞（PMN），進(jìn)行PMN凋亡檢測。結(jié)果血必凈組胰腺組織病理變化與胰腺炎組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），血清淀粉酶、TNF-α及IL-6均低于胰腺炎組，血必凈組PMN凋亡率與胰腺炎組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論血必凈可能通過抑制TNF-α、IL-6的產(chǎn)生，發(fā)揮治療作用，其是否通過誘導(dǎo)PMN的凋亡，減輕炎癥反應(yīng)有待進(jìn)一步研究。

血必凈；急性胰腺炎；腫瘤壞死因子；中性粒細(xì)胞；凋亡

急性胰腺炎是臨床上常見的急腹癥，發(fā)病率逐年增加，常伴有全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）繼而發(fā)展為多器官障礙綜合征，是患者病死率升高的主要原因[1-2]。淀粉酶是臨床上反映急性胰腺炎發(fā)作的一個經(jīng)典指標(biāo)。在胰腺組織尚未出現(xiàn)壞死前，可以通過檢測淀粉酶來反映胰腺炎的嚴(yán)重程度[3]。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α） 和白介素 6（In terleukin-6，IL-6）是引起組織細(xì)胞損傷的重要細(xì)胞因子，兩者參與急性胰腺炎的病理過程。中性粒細(xì)胞（Neutrophil，PMN）是正常免疫系統(tǒng)必要的組成部分，在炎癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中起重要作用。研究認(rèn)為，PMN的凋亡延遲會增加白細(xì)胞的數(shù)量，并導(dǎo)致疾病進(jìn)一步惡化[4]。血必凈是根據(jù)中西醫(yī)結(jié)合“菌、毒、炎并治”理論研究的復(fù)方中藥制劑，臨床研究表明，血必凈有抗炎、改善微循環(huán)的作用[5]。本實驗在急性胰腺炎大鼠模型中給予血必凈進(jìn)行干預(yù)，觀察胰腺組織病理改變，測定血清淀粉酶、TNF-α及IL-6，并分離PMN進(jìn)行凋亡檢測，探討血必凈治療大鼠急性胰腺炎的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

健康SD大鼠30只，體重220～250 g，大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。隨機(jī)分為3組，每組10只大鼠，包括假手術(shù)組、胰腺炎組及血必凈組。假手術(shù)組僅行開關(guān)腹手術(shù)，胰腺炎組3%戊巴比妥腹腔注射麻醉，經(jīng)十二指腸乳頭逆行胰膽管緩慢注射3.5%牛磺膽酸鈉，復(fù)制大鼠胰腺炎模型組[6-7]，血必凈組在模型復(fù)制成功后腹腔注射血必凈4 ml/kg，隔6 h后再給藥1次，其余兩組腹腔注射等劑量的生理鹽水（ml/kg）。模型復(fù)制成功24 h后，切取大鼠胰腺標(biāo)本。

1.2 主要試劑與設(shè)備

臺式高速低溫離心機(jī)（5840R）（德國Eppendorf公司），超凈工作臺（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），流式細(xì)胞儀（美國BD公司）。牛磺膽酸鈉（美國Sigma公司），血必凈注射液（天津紅日藥業(yè)股份有限公司），酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked im munosorbent assay，ELISA）試劑盒（美國Sigma公司），磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）（北京中衫金橋公司）。

1.3 組織病理學(xué)檢查

切取胰腺標(biāo)本，制成石蠟切片后行蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，光鏡下觀察胰腺組織病理學(xué)改變。

1.4 ELISA檢測

測定血清淀粉酶、TNF-α及IL-6含量，按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 PMN分離和凋亡檢測

PMN分離采用自然沉降法結(jié)合密度梯度離心法。取下腔靜脈血2.5 ml，37℃孵育12 h，加1 ml PMN分離液于20 ml離心管中，取標(biāo)本上層血漿層細(xì)胞加于分離液上，700 r/min離心8 min，可見離心管中液體由上到下分為血漿、血小板及粒細(xì)胞層核底層紅細(xì)胞層。加入2 ml分離液于離心管中備用。取已分離的中間細(xì)胞層加入備用離心管中，沿壁緩慢滴入，將離心管700 r/min離心2 min，沉淀細(xì)胞用1640液3 ml洗滌3次，1 200 r/min離心3 min，棄上清液，加入1640液沖洗，計數(shù)板調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/ml。用4℃ PBS洗滌分離的PMN 2次，以250μl結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×106/ml，取100μl細(xì)胞懸液于5ml流式管中，加入5μl Annexin V/異硫氰酸熒光素、20μl/ml碘化丙啶液10μl，室溫避光孵育15 min，在反應(yīng)管中加入400μl PBS，流式細(xì)胞儀檢測PMN凋亡指數(shù)[8]。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用方差分析，方差齊則兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織病理學(xué)結(jié)果

假手術(shù)組的大鼠胰腺組織切片結(jié)果顯示，胰腺小葉結(jié)構(gòu)清晰，其間質(zhì)無紅細(xì)胞、炎癥細(xì)胞；胰腺炎組胰腺腺泡結(jié)構(gòu)消失，腺泡細(xì)胞萎縮,胞核溶解消失，胰腺組織大片壞死；血必凈組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)破壞程度輕，而且破壞范圍小，鏡下可以觀察到胰腺腺泡水腫，實質(zhì)及間質(zhì)內(nèi)PMN核淋巴細(xì)胞浸潤。見圖1。

2.2 血清淀粉酶、TNF-Α及IL-6含量

血清淀粉酶含量在假手術(shù)組、胰腺炎組及血必凈組比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；胰腺炎組和血必凈組分別與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.121和2.821，P=0.013和0.020），血清淀粉酶含量胰腺炎組和血必凈組高于假手術(shù)組，分別增加5.56和4.25倍。同時，胰腺炎組與血必凈組的淀粉酶含量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.486，P=0.038），血必凈組的淀粉酶含量降低，下降22.23%。模型復(fù)制成功24h后，胰腺炎組TNF-α和IL-6含量與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.690和3.426，P=0.005和0.008）；血必凈組TNF-α和IL-6含量與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.728和2.616，P=0.025和0.031），表明模型復(fù)制成功。另一方面，胰腺炎組TNF-α和IL-6含量與血必凈組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.653和2.467，P=0.029和0.039），相比于胰腺炎組，血必凈組TNF-α和IL-6含量降低。見附表。

圖1 大鼠胰腺組織切片結(jié)果 （HE×200）

2.3 PMN凋亡率的變化

模型復(fù)制成功后，血必凈組PMN凋亡率與胰腺炎組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。胰腺炎組的PMN凋亡率與假手術(shù)組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖 2。

附表 各組血清淀粉酶、TNF-α及IL-6的變化 （±s）

附表 各組血清淀粉酶、TNF-α及IL-6的變化 （±s）

組別IL-6/（ng/L）假手術(shù)組 768.53±107.30 86.32±8.11 105.64±17.44胰腺炎組 4298.23±756.89 302.01±24.28 367.02±21.01血必凈組 3342.87±423.33 263.69±25.20 253.62±16.26 F值 5.621 4.452 4.027P值 0.008 0.021 0.034血清淀粉酶/（u/L）TNF-α/（ng/L）

圖2 各組大鼠外周血PMN凋亡率的變化

3 討論

逆行性胰膽管注射法復(fù)制急性胰腺炎模型已被廣泛應(yīng)用于胰腺炎發(fā)病機(jī)制、病理生理變化及防治效果的研究。本實驗對大鼠進(jìn)行逆行性胰膽管注射3.5%牛磺膽酸鈉，從而誘發(fā)大鼠急性胰腺炎，大鼠腹腔內(nèi)出現(xiàn)大量腹水，組織切片中可見胰腺組織大片壞死，大量炎癥細(xì)胞浸潤，血管破裂出血，符合急性胰腺炎標(biāo)準(zhǔn)。同時，血清淀粉酶結(jié)果表明，胰腺炎組淀粉酶含量與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。本模型復(fù)制成功，為后續(xù)的炎癥因子的測定和藥物治療提供可靠基礎(chǔ)。

細(xì)胞因子作為一種重要的炎癥介質(zhì)，對于維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起重要的作用。TNF-α和IL-6是機(jī)體的促炎細(xì)胞因子，在急性胰腺炎的發(fā)病，以及全身并發(fā)癥的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，是判斷急性胰腺炎嚴(yán)重程度的早期指標(biāo)。TNF-α和IL-6促進(jìn)PMN釋放，誘導(dǎo)單核細(xì)胞核和多核粒細(xì)胞趨化浸潤到炎癥局部，并進(jìn)一步促進(jìn)兩者的釋放，而形成一種惡性循環(huán)[9-10]。其中IL-6是炎癥初期最重要的促炎細(xì)胞因子。IL-6主要是由單核細(xì)胞產(chǎn)生，其升高程度、持續(xù)水平與胰腺炎的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[11]。本實驗結(jié)果說明，IL-6可以作為急性胰腺炎嚴(yán)重程度的指標(biāo)，應(yīng)用血必凈治療后，血必凈組血清中IL-6水平與胰腺炎組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示血必凈降低IL-6水平，減輕胰腺炎的炎癥反應(yīng)。同時血必凈組與胰腺炎組TNF-α水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

PMN是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，是白細(xì)胞中功能最活躍的部分。在炎癥的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮重要作用。目前研究表明，PMN凋亡延遲或凋亡障礙是造成急性胰腺炎發(fā)生SIRS的重要機(jī)制之一，循環(huán)中炎癥因子和細(xì)胞間信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)與PMN的凋亡相關(guān)。有研究表明，低濃度的TNF-α能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同時，在損傷因子的作用下，激活單核/巨噬細(xì)胞，從而釋放出多種細(xì)胞因子，如TNF-α、白細(xì)胞介素等，進(jìn)而引起PMN和內(nèi)皮細(xì)胞的過度激活，釋放大量炎癥介質(zhì)，加重胰腺損傷，還可以引起胰腺外其他重要臟器的功能障礙[12-13]。血必凈具有強(qiáng)有效的抗內(nèi)毒素作用，可以拮抗內(nèi)毒素誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)源性炎癥介質(zhì)失控性釋放，臨床上常用于治療急性危重病，如細(xì)菌感染引起SIRS，療效滿意[14]。同時，臨床上血必凈治療胰腺炎所引起的SIRS療效確切，但是發(fā)揮治療作用的藥理機(jī)制尚未明確。基于該點，本研究表明，血必凈可以通過降低血清中TNF-α和IL-6水平，來減輕胰腺炎的炎癥反應(yīng)，同時TNF-α和IL-6又促進(jìn)PMN的釋放，血必凈是否會引起PMN釋放減少，是否會通過誘導(dǎo)PMN的凋亡來進(jìn)一步減輕炎癥反應(yīng)。關(guān)于PMN凋亡檢測的數(shù)據(jù)有一定變化，但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義，只能說目前提供一個方向，筆者會繼續(xù)重復(fù)實驗，進(jìn)一步研究，以解決問題，從而為急性胰腺炎和急性重癥胰腺炎所致SIRS治療提供思路及理論支持。

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（童穎丹 編輯）

Therapeutic effect and mechanism of Xuebijing on intra-abdominal infection of rats*

Wei Zhang,Yan-na Zhu,Shou-xin Liu
(Department of Pharmacy,the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University,Dalian,Liaoning 116011,China)

ObjectiveTo investigate the protective effect of Xuebijing(XBJ)on the acute pancreatitis in rats and its possible mechanism.MethodsThirty SD rats were randomized into sham group,pancreatitis group and XBJ group.The rats in the sham group only underwent opening and closure of the abdomen;the rats in the pancreatitis group

Taurocholate sodium administration to establish animal model and the treatment group was intervened by XBJ.The pathological changes of pancreatic tissues were observed under optic microscope.Plasma concentrations of amylase and the expressions of tumor necrosis factor (TNF)-α and interleukin(IL)-6 in pancreatic tissues were determined by ELISA.Apoptosis of isolated neutrophiles was detected.ResultsThe pathological changes of the pancreatic tissues in the XBJ group were much more relieved compared to those in the pancreatitis group;the level of blood amylase was significantly lower in the XBJ group (P＜0.05).The expressions of TNF-α and IL-6 in the XBJ group were significantly lower than those in the pancreatitis group (P＜0.05).The PMN apoptotic rate in the XBJ group was not significantly different from that in the pancreatitis group (P＞0.05).ConclusionsXBJ could relieve acute pancreatitis in rats by inhibiting the production of TNF-α and IL-6.Whether it could promote apoptosis of PMN needs further research.

Xuebijing;acute pancreatitis;tumor necrosis factor-α;neutrophile;apoptosis

R657.51

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.12.004

1005-8982（2017）12-0021-04

2016-02-26

2013年遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項目（No：L2013355）

劉守信，E-mail：18098877520@163.com；Tel：18098877520