血管緊張素轉化酶基因多態性與妊娠糖尿病的關系

林玉玲

（河南省南陽市中心醫院 內分泌科，河南 南陽 473000）

血管緊張素轉化酶基因多態性與妊娠糖尿病的關系

林玉玲

（河南省南陽市中心醫院 內分泌科，河南 南陽 473000）

目的 探討血管緊張素轉化酶基因多態性與妊娠糖尿病（GDM）及妊娠結局的關系。方法采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性（PCR-RFLP）技術對136例GDM孕婦（GDM組），118例糖耐量異常孕婦（GIGT組）及106例糖耐量正常孕婦（GNGT組）血管緊張素轉化酶插入（I）/缺失（D）多態性位點進行分析，隨訪分析血管緊張素轉化酶（ACE）（I/D）基因單核苷酸多態性與相應妊娠結局的關系。結果GDM組DD型頻率及D等位基因頻率高于GNGT組，而I I型低于GNGT組（P＜0.05）。GDM組中ID、DD基因型FPG、Fins、ACE及HOMA-IR均高于I I型（P＜0.05）。GDM組ID、DD型妊娠結局中胎膜早破、早產兒、新生兒呼吸窘迫綜合征、新生兒低血糖及新生兒高膽紅素血癥例數均高于II型（P＜0.05）。DD基因型，D等位基因頻率為GDM的危險因素。DD基因型為妊娠不良結局的危險因素。結論ACE（I/D）基因單核苷酸DD型是GDM和妊娠不良結局的獨立危險因素。

妊娠糖尿病；妊娠結局；血管緊張素轉化酶；基因多態性

妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）是指妊娠期孕婦首次發生不同程度的糖代謝異常，嚴重危及母兒健康，與多種不良妊娠結局有關，如妊娠高血壓巨大兒、早產兒及新生兒低血糖等密切相關[1]。血管緊張素轉化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）與妊娠期高血壓，以及不良妊娠結局密切相關[2]。ACE基因的第16內含子中含有1個287 bp的DNA片段存在插入（Insertion，I）或缺失（Deletion，D）多態性[3]。已經有報道證實[4]，ACE（I/D）多態性與2型糖尿病、糖尿病腎病密切相關，同時與GDM妊娠中晚期血脂水平有一定關系。本研究旨在探討ACE（I/D）多態性與GDM，以及不良妊娠結局的關系，以期為早期預防GDM及不良妊娠結局的發生提供依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2014年4月-2015年6月在河南省南陽市中心醫院接受常規產前檢查的孕24～28周妊娠婦女，行 50 g糖篩查（glucose screening，GCT），1 h血糖在≥7.8mmol/L行100g糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT），檢測空腹血糖（fasting blood glucose，FPG）、1、2 及 3 h 血糖（blood glucose，PG）含量，參照樂杰主編的《婦產科學》（第7版）和2011年ADA有關于GDM的診斷標準：①FPG≥5.3 mmol/L；②1 h PG≥10.0 mmol/L；③2 h PG≥8.6 mmol/L；④3 h PG≥7.8 mmol/L，當滿足≥2項者則診斷為GDM，不滿足要求者則為非GDM孕婦。其中，診斷為GDM患者136例（GDM組）。年齡25～38歲，平均（27.69±4.02）歲；分娩孕周 39～42 周，平均（38.87±2.21）周。妊娠期糖耐量異常（gestational impaired glucose tolerance，GIGT）患者118例（GIGT組）。年齡26～37歲，平均（26.83±3.61）歲；分娩孕周 39～43周，平均（39.01±1.95）周。糖耐量正常孕婦組（gestational non glucose tolerance，GNGT）患者106例（GNGT組）。年齡25～38歲，平均（27.96±3.99）歲；分娩孕周 39～43周，平均（39.39±2.07）周。所有受試對象均已經排除其他妊娠合并癥以及心、腦、肝、腎及肺等慢性病史患者，簽訂知情同意書。所有研究對象行常規產檢至到分娩，由專人隨訪記錄相應妊娠結局。

1.2 方法

1.2.1 一般臨床資料及生化指標收集 由產科醫師詳細詢問并記錄受試對象的年齡、身高、體重、血壓及體重指數（body mass index，BMI）等。產檢時抽取外周靜脈血，測定生化指標，主要有總膽固醇（total cholesterol，TC）及三酰甘油（triglyceride，TG）（氧化酶法）、FPG（日本日立株式會社日立76002全自動生化指標分析儀），空腹胰島素（fasting insulin，Fins）、穩態胰島素評價指數（homeostasis model assessment-insulin resistance index，HOMA-IR）及穩態 β細胞功能評價指數（homeostasis model assessment-β cell function，HOMA-IR），血管緊張素轉化酶（比色法）。

1.2.2 脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取 取血樣標本2 ml，采用基因組DNA快速提純試劑盒（美國Promega生物試劑公司）提取DNA，紫外分光光度計檢測DNA的濃度和純度，純度要求A260/A280≥1.8，置入-40℃冰箱冷凍保存備用。

1.2.3 引物合成 按照相關文獻設計引物，由上海英駿生物科技工程有限公司合成。采用Light Scanner Primer Design軟件設計ACE（I/D）基因相應位點引物，均采用小片段擴增引物。聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）正向引物：5'-CTGAGCA TGCGTAACTACGCTCGTGCATACGGTC-3'；反向引物：5'-TCGTACTAAACGCAGCACCGATCA-3'。

1.2.4 目的基因擴增 PCR擴增體系為25 L，其中含有5μl PCR Mix，2u taq酶，正、反向引物各0.5μl，1μl LC Green和1μl DNA模板，剩余加入雙蒸水。ACE（I/D）基因的擴增反應條件為：95℃預變性2 min，95℃變性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，94℃變性30 s，30℃退火30 s，共40個循環，完成后采用73℃延伸5 min，限制性內切酶為BshFI。取PCR產物10 μl，在含有2%瓊脂糖凝膠上電泳，溴化乙錠染色，紫外線透射儀觀察PCR擴增是否成功，鑒定其特異性。電泳中僅見490bp片段為II型（野生型），僅見190bp為DD型（純合型）。雜合子ID型中I等位基因不易被探知，易導致DD型基因頻率過高，因此以內含子特異性引物再做一次PCR，正向引物：5'-CTGAGCATGCGTAACTACGCTCGTGCATACGGTC-3'；反向引物：5'-TCGTACTAAACGCAGCACCGATC A-3'。全部測序均由ABI 3100測序分析儀（美國ABI公司）完成。為進一步準確測定基因分型結果，隨機選取10%樣本采用直接測序法進行驗證。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，用方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗，計數資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗。群體基因型用Hardy-Weinberg平衡檢驗。影響因素的分析采用非條件的Logistic回歸分析，并經多重檢驗P值的Bonferroni進行校正，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基因型及擴增結果

ACE（I/D）位點酶切中呈現1條亮的且長度為490 bp的條帶為II型；出現190和490 bp 2條亮帶的為ID型，出現190 bp 1條亮帶為DD型。隨機選取ACE（I/D）的PCR擴增產物行基因測序，結果顯示堿基的改變與酶切結果一致。見附圖。

附圖 ACE（I/D）不同基因型電泳圖

2.2 3組臨床資料及生化指標的比較

研究結果顯示，各組 FPG、TC、TG、Fins、ACE、HOMA-IR及HOMA-β水平，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=4.983、4.724、5.013、4.694、8.893、8.174 和 6.591，P=0.037、0.038、0.029、0.038、0.013、0.013 和 0.020）；GDM 組 FPG、TC、TG、Fins、ACE、HOMA-IR及HOMA-β水平水平與GNGT組比較，差異有統計學意義 （t=3.452、3.901、5.117、3.895、7.207、7.119 和 6.229，P=0.027、0.027、0.019、0.026、0.000、0.000 和 0.008）；GDM 組 TG、ACE、HOMA-IR、HOMA-β與GIGT組比較，差異有統計學意義（t=2.993、2.978、6.112 和 5.993，P=0.038、0.039、0.007 和0.009）。見表 1。

2.3 不同組別患者ACE（I/D）基因頻率與等位基因頻率分布

3組患者基因型構成比較，差異有統計學意義（χ2=8.96，P=0.013），GDM 組 DD 型頻率為 49.26%（67/136）及D等位基因頻率為65.07%（177/242），GNGT組DD型頻率為9.43%（10/106）及D等位基因頻率為17.45%（37/212），經χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=11.57和 10.82，P=0.000和 0.004）；GDM 組I I型頻率為19.12%（26/136）及I等位基因頻率為34.93%（95/242），GNGT組 II型頻率為 74.53%（79/106）及I等位基因頻率為 82.55%（175/212）（χ2=11.043 和 9.872，P=0.000 和 0.009）。見表 2。

2.4 GDM組ACE（I/D）不同基因型臨床指標的比較

GDM 組中 ACE（I/D）3 種不同基因型 FPG、Fins、ACE、HOMA-IR水平的比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=5.243、5.986、6.044和 5.372，P=0.028、0.027、0.023 和 0.029）；DD 基 因 型 組 FPG、Fins、ACE及HOMA-IR水平與II基因型組比較，差異有統計學意義（t=4.469、5.391、6.231和 4.632，P=0.021、0.019、0.008、0.021）；ID 基因型 FPG、Fins、ACE及HOMA-IR水平與II基因型組比較，差異有統計學意義（t=3.542、4.021、4.762 和 3.113，P=0.027、0.022、0.021和0.021）。見表 3。

表1 3組臨床資料及生化指標比較 （±s）

表1 3組臨床資料及生化指標比較 （±s）

注：1）與 GNGT 組比較，P ＜0.05；2）與 GIGT 組比較，P ＜0.05

組別BMI/（kg/m2）FPG/（mmol/L）TC/（mmol/L）TG/（mmol/L）Fins/（mU/L）ACE/（u/L）HOMA-IR HOMA-β GNGT組（n=106） 25.11±1.76 4.45±0.42 4.76±0.69 1.39±0.20 10.09±0.73 22.84±9.36 2.90±0.23 332.69±39.54 GIGT組（n=118） 25.84±1.96 5.76±0.521） 5.82±0.711） 1.59±0.34 13.97±1.291） 34.23±10.351） 3.01±0.29 310.26±36.88 GDM組（n=136） 26.41±1.89 6.10±0.571） 5.93±0.831） 1.97±0.371）2） 14.36±1.301） 43.69±11.041）2） 3.89±0.431）2）115.51±28.041）2）F/H值 0.891 4.983 4.724 5.013 4.694 8.983 8.174 6.591P值 0.134 0.037 0.038 0.029 0.038 0.013 0.013 0.020

2.5 GDM組ACE（I/D）基因多態性與妊娠結局的關系

GDM組3種不同基因型胎膜早破、產后出血、早產兒、新生兒呼吸窘迫綜合征、新生兒低血糖及新生兒高膽紅素血癥比較，經χ2檢驗分析，差異有統計學意義（χ2=6.887、7.032、8.112 和 9.397，P=0.022、0.019、0.013和0.009）；GDM組ID型、DD型中胎膜早破、早產兒、新生兒呼吸窘迫綜合征、新生兒低血糖及新生兒高膽紅素血癥發生率與I I型比較，差異有統 計學 意 義（χ2=4.762、5.993、5.152、6.779、6.331、7.491、7.636 和 8.779，P=0.039、0.021、0.019、0.014、0.015、0.013、0.0011 和 0.008）。見表 4。

2.6 GDM的危險因素分析

將3組比較有統計學意義的因素進行多變量的Logistic回歸分析，以GDM為因變量，FPG（賦值：≥5.7 mmol/L 為 1，＜5.7 mmol/L 為 1）、Fins（賦值：≥15.34 mmol/L 為 1，＜15.34 mmol/L 為 1）、TC（賦值：≥5.7 mmol/L 為 1，＜5.7 mmol/L 為 1）、TG（賦值：≥5.18 mmol/L為1，＜5.18 mmol/L為0）、HOMA-IR（賦值：≥3.01 mmol/L 為 1，＜3.01 mmol/L 為 1）、HOMA-β（賦值：≥259.44mmol/L為0，＜259.44 mmol/L為1）、基因型（I I型為0，ID型為1，DD型為2）及等位基因頻率（I等位基因頻率為0，D等位基因頻率為1）為自變量。結果顯示，1.682，6.489），P=0.004]、DD 基因型1.839，7.267），P=0.001]、D 等位基因頻率（95%CI：1.296，5.359），P=0.033）]為 GDM 的危險因素，TG

表2 3組患者ACE（I/D）基因頻率與等位基因頻率分布 例（%）

表3 GDM組ACE（I/D）不同基因型臨床指標比較 （±s）

表3 GDM組ACE（I/D）不同基因型臨床指標比較 （±s）

注：?與I I基因型組比較，P＜0.05

?

表4 GDM組ACE（I/D）基因多態性與妊娠結局的關系 例（%）

2.7 妊娠不良結局的危險因素分析

將3種基因型比較有統計學意義的因素進行多變量的Logistic回歸分析，以妊娠不良結局為因變量，以FPG、Fins、HOMA-IR、DD基因型為自變量。結果為妊娠不良結局的危險因素。

3 討論

ACE是腎素-血管緊張素系統（rennin angiotensin system，RAS）的關鍵酶，能夠催化血管緊張素Ⅰ（AngiotensinⅠ，AngⅠ）轉化為血管緊張素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ），其中編碼ACE蛋白的基因位于染色體17q23，包含26個外顯子和25個內含子，總長度為21 kb，基礎實驗中根據第16內含子中287 bp的Alu片段I/D存在與否表現出插入或缺失多態性，即缺失純合子DD型，插入純合子I I型和雜合子ID型。ACE的DD基因型個體的AngⅠ更容易轉化成AngⅡ，健康人員DD基因型個體對外源性AngⅠ能產生顯著的升壓效應，且血清中AngⅡ也顯著升高[5-6]。

多數學者認為2型糖尿病的發生發展與遺傳、環境因素等密切相關。目前，臨床已有報道ACE（I/D）基因多態性與2型糖尿病、糖尿病腎病密切相關，DD基因型患者ACE水平最高，而I I型患者最低[7]。本研究顯示，GDM患者DD基因型ACE水平高于I I型、ID型。聶敏等[8]證實ACE（I/D）基因多態性對GDM妊娠中晚期血脂水平有影響，本研究發現，GDM患者TC、TG含量最高，而Ⅱ型最低，這也印證以往的研究報道。ACE最直接的作用是促進AngⅡ生成及表達，而AngⅡ是全身和腎血管壁最強烈的縮血管物質，引起妊娠高血壓綜合征，此外DD基因型患者血脂水平高于I I型、ID型，而血脂代謝與GDM及不良妊娠結局顯著相關[9]。本研究發現，GDM患者DD基因型頻率高于I I型，Logistic回歸分析顯示，FPG、Fins、TC、ACE、HOMA-IR、DD 基因型及 D 等位基因頻率為GDM的獨立危險因素，這與部分研究報道基本一致。

近年來研究表明，GDM對孕產婦和圍產兒的不良影響與妊娠期血糖控制水平密切相關，有研究報道指出，血糖水平控制不佳可以導致羊水過多，巨大兒、新生兒低血糖、新生兒呼吸窘迫綜合征甚至死亡等，根據IADPSG最新診斷標準顯示，GDM的發病率在全球范圍內達到17.8%[10]。目前，對于GDM的發病機制尚不明確，多數認為與胰島素抵抗及胰島素分泌不足有關。GDM易合并母兒并發癥，常見有妊娠期高血壓、早產兒、新生兒低血糖幾新生兒高膽紅素血癥等，其中妊娠期高血壓的風險是正常孕婦的2～3倍[11]。這也是本研究選擇ACE基因多態性的原因之一。多項研究均證實，D等位基因患者，ACE水平較高，而ACE水平與早產兒、新生兒高膽紅素血癥及胎膜早破等相關。本研究證實，DD基因型患者不良妊娠結局高于Ⅱ型，進一步采用Logistic回歸分析顯示，DD基因型與不良妊娠結局相關，提示D等位基因與GDM不良妊娠結局有關。

綜上所述，筆者推測ACE（I/D）基因多態性可能是GDM的1個易感位點，其中DD型是GDM和妊娠不良結局的獨立危險因素，監測孕婦該基因位點，可以用于GDM風險的預測，從而進行早期干預，減少遠期并發癥以及不良妊娠結局。

[1]DERYABINA E G,YAKORNOVA G V,PESTRYAEVA L A,et al.Perinatal outcome in pregnancies complicated with gestational diabetes mellitus and very preterm birth:case-control study[J].Gynecol Endocrinol,2016,32(2):52-55.

[2]LI D K,YANG C,ANDRADE S,et al.Maternal exposure to angiotensin converting enzyme inhibitors in the first trimester and risk of malformations in offspring:a retrospective cohort study[J].BMJ,2011,343:DOI:10.1136/bmj.d5931.

[3]AGGARWAL P,AGARWAL N,DAS N,et al.Association of polymorphisms in angiotensin-converting enzyme gene with gestational diabetes mellitus in Indian women[J].International Journal of Applied&Basic Medical Research,2016,6(1):31-37.

[4]浦劍虹,錢惠英,陳鈺.血管緊張素轉化酶基因多態性與老年高血壓及合并糖尿病的相關性研究[J].中國血液流變學雜志,2012,22(2):202-204.

[5]KHAN I A,JAHAN P,HASAN Q,et al.Angiotensin-converting enzyme gene insertion/deletion polymorphism studies in Asian Indian pregnant women biochemically identifies gestational diabetes mellitus[J].Journal of the Renin-angiotensin-aldosterone System,2014,15(4):566-571.

[6]DOSTáLOVá Z,BIENERTOVá-VASK? A J,VASK? A,et al.Insertion-deletion polymorphism in the gene for angiotensin-converning enzyme (I/D ACE)in pregnant women with gestational diabetes[J].Ceska Gynekol,2006,71(5):369-373.

[7]張穎,張瑞生,何邦順,等.血管緊張素轉化酶基因多態性與2型糖尿病的相關性研究[J].醫學研究生學報,2010,23(10):1062-1065.

[8]聶敏,洪靜,李偉,等.血管緊張素轉換酶和血管緊張素轉換酶基因多態性與妊娠糖尿病孕婦及正常孕婦血脂水平的相關性研究[J].生殖醫學雜志,2009,18(6):501-507.

[9]HINDMARSH P C,RODECK C H,HUMPHRIES S E.Polymorphisms in the angiotensin converting enzyme gene and growth in the first year of life[J].Ann Hum Genet,2007,71(2):176-184.

[10]SACKS D A,HADDEN D R,MARESH M,et al.Frequency of gestational diabetes mellitus at collaborating centers based on IADPSG consensus panel-recommended criteria:the Hyperglycemia and Adverse Pregnancy Outcome(HAPO)study[J].Diabetes Care,2012,35(3):526-528.

[11]梁艷,徐先明.妊娠期糖尿病與妊娠期高血壓疾病相關性的研究進展[J].現代婦產科進展,2007,16(12):366-369.

（李科 編輯）

Correlations ofACEgene polymorphism with gestational diabetes mellitus and pregnancy outcome

Yu-ling Lin
(Department of Endocrinology,Central Hospital of Nanyang,Nanyang,Henan 473000,China)

ObjectiveTo investigate the relationships of angiotensin converting enzyme (ACE)gene polymorphisms with gestational diabetes mellitus(GDM)and pregnancy outcome.MethodsPolymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP)technique was used to analyzeACEinsertion (I I)and deletion(D)polymorphism loci in 136 cases of pregnant women with GDM(GDM group),118 cases of pregnant women with abnormal glucose tolerance(GIGT group)and 106 pregnant women with normal glucose tolerance(GNGT group).Then the women were followed up,and the correlations between the SNPs ofACEgene and the pregnant outcome were analyzed.ResultsThe frequency of DD genotype and D allele in the GDM group was higher than that in the GNGT group,while the frequency of II genotype was lower than that in the GNGT group (P＜0.05).The FPG,Fins,ACE and HOMA-IR in the GDM patients with ID or DD genotype were significantly higher than those in the GDM patients with II genotype (P＜0.05).The incidences of premature rupture of membranes,premature birth,neonatal respiratory distress syndrome,neonatal hypoglycemia and neonatal hyperbilirubinemia in the GDM women with ID or DD genotype were significantly higher than those in the GDM women with I I genotype (P＜0.05).DD genotype and the D allele frequency were the risk factors for GDM (P＜0.05).DD genotype was the risk factor for adverse pregnancy outcome (P＜0.05).ConclusionsDD genotype of single nucleotide polymorphism ofACE (I/D)gene is the independent risk factor for GDMand adverse pregnancy outcome.

gestationaldiabetesmellitus;pregnancyoutcome;angiotensin converting enzyme;gene polymorphism

R587.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.12.013

1005-8982（2017）12-0065-06

2016-11-15