丁烯二酸單酯化-β-環糊精修飾的磁性納米顆粒制備及性能研究

陳鵬飛，宋 航，李福林，唐夢雨，周 魯

（四川大學化學工程學院制藥與生物工程系，四川 成都 610065）

丁烯二酸單酯化-β-環糊精修飾的磁性納米顆粒制備及性能研究

陳鵬飛，宋 航，李福林，唐夢雨，周 魯

（四川大學化學工程學院制藥與生物工程系，四川 成都 610065）

以可聚合的β-環糊精衍生物丁烯二酸單酯化-β-環糊精為功能單體，在一定的條件下，與采用含有乙烯基的偶聯劑進行表面改性的Fe3O4納米顆粒，通過自由基共聚法，制備一種帶有環糊精基團的磁性納米顆粒。通過掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡表征其形貌；紅外光譜和X-射線衍射表征結構；振動樣品磁強計表征其磁性；熱重分析儀表征熱穩定性。隨后對其在不同表面活性劑中的分散穩定性進行測定，并通過細胞毒性試驗對含有表面活性劑的分散體系的生物相容性進行研究。在此基礎上，以抗癌藥物卡莫氟為模型藥物考察載體的載藥性能。實驗結果表明該磁性納米顆粒有望作為藥物載體應用在抗腫瘤藥物靶向給藥領域。

磁性納米顆粒；β-環糊精；靶向載體；載藥性能

0 引 言

癌癥是嚴重威脅人類健康的疾病之一，目前主要的治療方法是化學藥物治療法。然而許多抗癌藥物和抗癌劑的組織特異性差、水溶性不高，導致生物利用率低，毒副作用大，嚴重限制其在臨床中應用[1]。近年來，隨著納米醫學的不斷發展，抗腫瘤藥物的靶向控制釋放治療受到了研究者們的廣泛關注[1-2]。通過靶向載體可將抗癌藥物有選擇性地集中釋放在病灶部位，從而提高藥物治療效果和減少藥物對正常組織的毒副作用。磁性靶向給藥系統是近年來國內外研究較多的一種新型靶向給藥載體。其中，超順磁Fe3O4納米顆粒具有制備方便、超順磁性、生物相容性較好的特點，在磁靶向載體中應用廣泛[3-4]。理想的磁靶向給藥載體不但要求納米顆粒具有高磁飽和度，而且其表面要有可以負載藥物的功能性基團以及良好的水介質分散穩定性。但是未經修飾改性的Fe3O4納米顆粒不但由于粒子間存在的偶極-偶極吸引作用、范德華作用力而易相互聚集，而且載藥量難以滿足需求，因此需要對其進行表面改性。

β-環糊精以天然高分子物質為來源，不但具有來源廣泛、價格低廉、無毒且可生物降解的優點，而且具有外緣親水而內腔疏水的獨特空腔結構，可以根據疏水作用力、范德華力及主客體分子間的匹配等作用與多種藥物分子形成主-客體包合物[5]。β-環糊精及其衍生物通過與藥物分子形成包合物，不但能將藥物增溶于水，而且可以提高藥物的穩定性和生物利用度。基于此，本文以水溶性β-環糊精衍生物丁烯二酸單酯化-β-環糊精（MA-CD）為功能單體，對Fe3O4納米顆粒表面進行修飾改性，得到一種帶有環糊精基團的磁性納米顆粒，并對其性能進行了一系列的研究，以期用作磁靶向給藥載體。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

β-環糊精（質量分數 98%）、3-（異丁烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷 （KH-570，97%）、偶氮二異丁腈、順丁烯二酸酐均購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。噻唑蘭（MTT）和二甲亞砜購于美國Sigma公司。氯化亞鐵、氯化鐵、二甲基甲酰胺、丙酮等常用試劑均購于成都科龍化工試劑廠。

所制備磁性納米顆粒的形貌采用Merlin compact-61-78型掃描電子顯微鏡 （德國蔡司集團）和JEM2100型透射電子顯微鏡（日本電子株式會社）進行表征；磁性性能采用Versalab型振動樣品磁強計（美國量子設計公司）進行表征；結構采用Spectrum Two L1600300型紅外光譜儀（美國珀金埃爾默股份有限公司）和D8型X-射線衍射儀（德國布魯克科技有限公司）進行表征；熱穩定性采用TG209F1型熱重分析儀（德國耐馳儀器制造有限公司）進行表征。納米顆粒在表面活性劑中的透過率和卡莫氟溶液的吸光值分別通過TU-1810型紫外分光光度計進行測定（北京普析通用儀器有限責任公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 KH-570修飾的Fe3O4納米顆粒的制備

[6]報道的方法，采用化學共沉淀法制備Fe3O4納米顆粒，將得到的磁流體分散于120 mL乙醇和30mL水的混合溶液中，攪拌10min后依次加入3 mL氨水和2 mL正硅酸乙酯，常溫攪拌24 h后，在外加磁場的作用下分離出硅化后的磁性納米顆粒（SMNPs），洗滌后真空干燥得到產物。

準確稱取1g干燥后的SMNPs，超聲分散在100mL二甲基甲酰胺中，攪拌10min后，在氮氣的保護下，逐滴加入5 mL KH-570，100℃反應12 h，磁性分離出產物，洗滌后真空干燥得到偶聯劑修飾的磁性納米顆粒（SMNPs-KH570）。

1.2.2 MA-CD-MNPs的制備

首先根據文獻[7]方法制備了丁烯二酸單酯化-β-環糊精，以偶氮二異丁氰作為聚合反應的引發劑。準確稱取0.5g SMNPs-KH570，超聲分散在50mL二甲基甲酰胺中，機械攪拌10min后，加入0.25g丁烯二酸單酯化-β-環糊精，通氮氣30min后升溫至70℃，逐滴加入含有0.05g偶氮二異丁氰的二甲基甲酰胺溶液10mL，氮氣保護下反應4h。磁性分離出產物，洗滌后真空干燥得到丁烯二酸單酯化-β-環糊精修飾的磁性納米顆粒（MA-CD-MNPs）。

1.2.3 MA-CD-MNPs分散穩定性的測定

按實驗設計稱取不同類型和用量的表面活性劑，分散在50mL模擬體液中以配制不同的分散溶液，準確稱取10 mg MA-CD-MNPs超聲分散在分散溶液中配成質量濃度為0.2g/L的懸浮液，取3mL于比色皿內，采用紫外分光光度計，在設定的時間點記錄其在500nm下透過率[8]。隨著納米顆粒的團聚，其在重力的作用下會逐漸沉降，透過率增大，因此可以通過透過率的變化來衡量表面活性劑的分散能力。

1.2.4 細胞毒性實驗

本部分選用人體肝癌細胞HEPG-2，采用MTT法進行生物相容性表征[9]。具體步驟如下：配置一定濃度采用表面活性劑分散的藥物載體懸浮液，待用。細胞株以每孔2×104～4×104個細胞的密度接種到96孔培養板上，在含有5%CO2的濕潤空氣氛圍下培養24h后更換新鮮的培養基，再分別加入預定濃度的懸浮液，平行操作3份。繼續將96孔板培養72h后，吸去孔內的上清液，用新鮮PBS緩沖溶液洗滌后在每孔中加入20μL MTT液體（5mg/mL），37℃繼續培養4h，終止培養。棄去上清液，每孔加150μL二甲亞砜，避光振蕩10min使結晶物充分溶解。使用自動酶標儀檢測570nm波長處的吸光度值。細胞存活

其中Asample、Acontrol和Ablank分別代表樣品孔、對照孔和空白孔在570nm處的吸光度值。樣品孔為加入待測樣品的細胞和培養液，對照孔為未加待測樣品的細胞和培養液，空白孔為未加細胞的培養液。

1.2.5 MA-CD-MNPs載藥性能的考察

本部分選擇常用的廣譜抗癌藥物卡莫氟（HCFU）為模型藥物考察載體的載藥性能。具體操作如下：取一定體積和濃度的卡莫氟溶液于100 mL具塞錐形瓶中，加入15 mg左右的MA-CD-MNPs，超聲分散后將錐形瓶密閉，置于一定溫度的氣浴振蕩器中，設定搖床轉速為150r/min。震蕩一段時間后，在外加磁場的作用下，分離磁性納米顆粒與溶液，取適當清液稀釋至一定濃度，于260 nm處測定吸光值，根據標準曲線（y=0.045 6x（mg/L）+0.004，r2=0.999 8），計算出溶液中剩余卡莫氟的質量濃度。根據下式計算出藥物載體的載藥量：率按下式計算：

式中：Q——靶向載體對卡莫氟的載藥量，mg/g；

V——卡莫氟溶液的體積，mL；

M0——靶向載體的質量，g；

C0——卡莫氟溶液的初始質量濃度，mg/L；

Ct——載藥后卡莫氟溶液的質量濃度，mg/L。

2 結果與討論

2.1 磁性納米顆粒的表征

所制備的MA-CD-MNPs的掃描電鏡和透射電鏡結果分別如圖1（a）和圖1（b）所示，從圖中可以看出，MA-CD-MNPs主要成球形且具有典型的核殼型結構，即Fe3O4納米顆粒為核，所接枝的聚合物為殼。根據統計的結果，微球的平均粒徑為（90±3）nm。研究表明，粒徑在10～200nm且表面附有親水基團的粒子能夠避免巨噬細胞的識別，可以作為藥物載體[3]。但從圖中可以發現，表面改性的磁性納米顆粒之間仍出現了一定程度的團聚現象。為了使其能用于靶向給藥，還需對其分散穩定性進行改進。

用XRD和FT-IR對所制備的磁性納米顆粒的結構進行表征。 圖 2（a）和圖 2（b）分別是 SMNPs和MA-CD-MNPs的X-射線衍射譜圖。從圖2（a）中可以觀察到6個明顯的特征衍射峰，和粉末衍射標準聯合委員會（JCPDS）粉末衍射標準卡（JCPDS No.85～1 436）上的特征峰值 2θ=30.1（220），35.5（311），43.1（400），53.4（422），57.0（511）和 62.6（440）進行比對可知，本文制備的氧化鐵納米顆粒為純凈的Fe3O4單相立方晶顆粒。在圖2（b）中依然可以觀察到這6個特征峰，表明制備MA-CD-MNPs的過程并未改變Fe3O4納米顆粒的晶型和結構。但由于接枝了環糊精基團，對應特征吸收峰處的衍射強度有所降低。

圖1 MA-CD-MNPs的掃描電鏡圖和透射電鏡圖

FT-IR結果如圖3所示，所有紅外曲線均在580cm-1左右出現了Fe3O4的Fe-O特征伸縮峰[4，6]。為了賦予Fe3O4納米顆粒更好的反應活性，首先對其表面進行了硅化，其紅外圖譜如圖3（a）所示，在1093 cm-1和800 cm-1左右分別是 Si-O（Si-O-Si）的反對稱振動吸收峰和對稱振動吸收峰，在3444cm-1左右出現了-OH的伸縮振動吸收峰[5]。在接枝帶有雙鍵的偶聯劑KH-570后，在1 720 cm-1和1 648 cm-1處分別出現了C=O和C=C的伸縮振動峰，在2928cm-1和2 848 cm-1處分別出現了-CH3和-CH2的特征吸收峰（見圖3（b））。在與丁烯二酸單酯化-β-環糊精發生聚合反應后，C=C的特征吸收峰由于共軛作用而發生紅移，向低波數移動，而且在1 528 cm-1處出現了C=C鍵反對稱伸縮振動峰。除此之外，由于環糊精基團的引入，在1000～1200cm-1附近的吸收變強，在 3400cm-1附近的吸收峰變寬（見圖 3（c））[7]。

圖2 SMNPs和MA-CD-MNPs的X-射線衍射譜圖

圖3 SMNPs，SMNPs-KH-570和MA-CD-MNPs的紅外光譜圖

圖4 是SMNPs和MA-CD-MNPs在300K下測得的磁滯回線圖。從圖中可以看出，SMNPs和MACD-MNPs的磁滯回線均呈S形，質量比剩余磁化強度和矯頑力均極小，顯示出典型的超順磁特性，其飽和磁化強度分別為49.98 emu/g和29.80 emu/g。MA-CD-MNPs的磁飽和度比SMNPs要低，源于修飾顆粒中含有一定量的非磁性物質，即接枝上去的環糊精衍生物，從而導致單位質量的飽和磁化強度有所降低，但仍然能夠在外加磁場的作用定向移動，可以用作磁靶藥物向載體。

圖4 SMNPs和MA-CD-MNPs在300K溫度下的磁滯回線圖

上述表征均說明了丁烯二酸單酯化-β-環糊精成功接枝在Fe3O4納米顆粒表面，為了研究所制備的磁性納米顆粒的熱穩定性和定量分析環糊精衍生物的接枝量，采用熱重分析進行了表征，結果如圖5所示。從圖中可以看出MA-CD-MNPs的熱失重可分為兩個階段，第1個階段是從室溫下開始加熱到100℃左右，出現了約2%的熱失重，這應歸因于顆粒所吸附水分的蒸發。第2階段是從220℃到675℃出現了約10.55%的失重量，這部分失重應該是所接枝上的有機組分。SMNPs-KH-570的失重溫度和范圍與MA-CD-MNPs基本一致。綜合以上數據進行分析可以推算出，接枝在Fe3O4納米顆粒表面的丁烯二酸單酯化-β-環糊精占顆粒總重的8.03%。

2.2 MA-CD-MNPs分散穩定性研究

圖5 SMNPs-KH-570和MA-CD-MNPs的熱重分析曲線

通過前期的文獻調研和預實驗的結果發現對同一種表面活性劑來說，影響MA-CD-MNPs在模擬體液中分散性能的主要因素是表面活性劑的濃度，這是因為納米顆粒表面可供吸附的面積有限，當表面活性劑在顆粒表面達到飽和吸附后，多余未吸附的分子鏈便會通過橋連作用使原本分散的顆粒再次團聚，導致其分散性變差[10]。因此首先對不同類型的表面活性劑最佳濃度進行了優化，然后再比較不同種類表面活性劑對納米顆粒分散性的影響。實驗共選擇了6種表面活性劑，其中兩種非離子型表面活性劑：聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮；3種陰離子型表面活性劑：十二烷基硫酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉、羧甲基纖維素鈉；一種氨基酸類表面活性劑：N-月桂酰肌氨酸鈉。實驗結果如圖6所示，隨著時間的增加，分散系統的透過率逐漸增加，其中透過率變化最小，即分散效果最好的表面活性劑是質量分數0.5%的羧甲基纖維素鈉，說明該分散劑與MA-CD-MNPs間的相互作用最強，容易吸附在顆粒表面形成雙電層或空間位阻結構，從而顯著改善其分散穩定性。

2.3 細胞毒性研究

理想的磁靶向給藥系統不僅要具備一定的磁響應性，還要有良好的生物相容性。因此有必要對上述優選出的含有0.5%的羧甲基纖維素鈉的MA-CDMNPs懸浮液的細胞毒性進行研究。實驗結果如圖7所示，該懸浮液在所測試的濃度范圍內對細胞的活力基本沒有影響，具有良好的生物相容性。

根據報道[11]，單獨裸露的Fe3O4納米顆粒在質量濃度為50μg/mL時，就會導致細胞活力下降20%，這主要是由細胞間內吞作用導致。研究表明，在Fe3O4納米顆粒表面偶聯親水性材料進行修飾，可形成一層動態的親水性物，有效降低細胞毒性[12]。因此，將β-環糊精的親水性衍生物丁烯二酸單酯化-β-環糊精接枝在Fe3O4納米顆粒有助于提高納米顆粒的生物相容性。除此之外，羧甲基纖維素鈉作為一種陰離子型表面活性劑，相較于陽離子型來說，不易與帶負電的細胞表面相互作用，因此細胞毒性較小。因此整個分散體系具有良好的生物相容性。

圖6 MA-CD-MNPs在不同表面活性劑中透過率隨時間變化圖

圖7 含有羧甲基纖維素鈉的MA-CD-MNPs懸浮液對HEPG-2細胞的細胞毒性

2.4 靶向載體載藥性能的考察

以廣譜抗癌藥物卡莫氟為模型藥物對納米顆粒的載藥性能進行考察，通過單因素實驗對載藥條件進行了優化，由圖8可知該納米顆粒對卡莫氟的最佳載藥條件為：卡莫氟溶液的質量濃度為50 mg/L（圖8（a））；載藥作用時間為3 h（圖 8（b））；載體與溶液的質量體積比為 15 mg∶40 mL（圖 8（c））；載藥溫度為 35 ℃（圖8（d））。在此條件下，得到對卡莫氟的最大載藥量為（12.36±0.72）mg/g。 實驗結果表明，該磁性納米顆粒具備良好的載藥性能，可以用作磁靶向給藥載體。

3 結束語

本文采用自由基聚合法，將β-環糊精的水溶性衍生物丁烯二酸單酯化-β-環糊精（MA-CD）成功接枝在Fe3O4納米顆粒的表面。所制備的磁性納米顆粒主要呈球型且是典型的核殼型結構，平均粒徑為（90±3）nm。VSM曲線表明該磁性納米顆粒具備良好的順磁性，在外加磁場的作用下可以實現定向移動。通過對納米顆粒的熱穩定性研究得到接枝在Fe3O4納米顆粒表面的MA-CD占顆粒總重的8.03%。為了進一步改善磁性納米顆粒在水介質中的分散穩定性，對其在6種不同類型的表面活性劑中分散性能進行了研究，結果表明質量分數為0.5%的羧甲基纖維素鈉的分散性能最好。細胞毒性研究結果證明了含有0.5%的羧甲基纖維素鈉的MA-CD-MNPs懸浮液具有良好的生物相容性。以抗癌藥物卡莫氟為模型藥物的載藥實驗結果表明了該磁性納米顆粒具有良好的載藥性能，對卡莫氟的最大載藥量達到（12.36±0.72）mg/g。 綜上可知，本實驗所制備的磁性納米顆粒有望用于磁靶向給藥領域。

圖8 MA-CD-MNPs對卡莫氟載藥性能的單因素考察結果

參考文獻

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（編輯：莫婕）

Preparation and characterization of magnetic nanoparticles based on maleated-β-cyclodextrin

CHEN Pengfei，SONG Hang，LI Fulin，TANG Mengyu，ZHOU Lu
（Department of Pharmaceutical Engineering and Biological Engineering，School of Chemical Engineering，Sichuan University，Chengdu 610065，China）

Maleated-β-cyclodextrin was first synthesized and then its functionalized Fe3O4magnetic nanoparticles MA-CD-MNPs were prepared via free radical copolymerization of maleated-βcyclodextrin on the surface of Fe3O4magnetic nanoparticles（MNPs） modified by 3-methacryl oxypropylt rimethoxy silane which has reactive double carbon bonds.The morphology，structure，magnetic property，and component of MA-CD-MNPs were characterized by SEM，TEM，FT-IR，XRD，VSM and TGA.The colloidal stabilities of MA-CD-MNPs in kinds of surfactant were investigated.Furthermore，the cell cytotoxicity of nanosystem containing the surfactant was assessed by MTT assay.And then，carmofur was selected as model drug to investigate the loading capacity of the MA-CD-MNPs.The MA-CD-MNPs were anticipated to act as a promising candidate of targeted nanocarrier for anti-cancer drugs.

magnetic nanoparticles；β-cyclodextrin；targeted nanocarrier；loading capacity

A

1674-5124（2017）04-0038-06

10.11857/j.issn.1674-5124.2017.04.009

2016-11-10；

2016-12-25

陳鵬飛（1989-），男，博士，研究方向為磁性聚合物功能材料。

周 魯（1954-），男，教授，博導，主要從事藥物定量構效關系和定量構動關系研究。