NELL1和 FMO3基因mRNA在綿羊肝臟與脂肪組織中的表達

田崇奇，周世衛，王小芳，田春麗，代麗霞，曾 潔，王小龍，楊雨鑫，張恩平，陳玉林，寇啟芳

(西北農林科技大學 動物科技學院，陜西楊凌 712100)

NELL1和 FMO3基因mRNA在綿羊肝臟與脂肪組織中的表達

田崇奇，周世衛，王小芳，田春麗，代麗霞，曾 潔，王小龍，楊雨鑫，張恩平，陳玉林，寇啟芳

(西北農林科技大學 動物科技學院，陜西楊凌 712100)

旨在探究不同營養水平及不同生長階段脂尾型綿羊 NELL1和 FMO3基因mRNA的組織特異性表達模式。選擇健康、體質量相近的9月齡灘羊、同羊、哈薩克羊和西藏羊(羯羊)各3只，活體采集尾部脂肪樣品。選擇健康4月齡灘羊112只隨機分為4組，公母各半，每組 4 個重復，每個重復7只羊。根據體質量增加目標分為3個階段：22～28 kg，28～35 kg，35～40 kg，每個階段各組分別飼喂不同營養水平的日糧。每個生長階段結束時采集肝臟、腎周脂肪、尾脂、皮下脂肪的組織樣品，提取樣品總RNA，采用實時熒光定量PCR的方法分析 NELL1和 FMO3mRNA的表達差異。結果表明， FMO3 mRNA在哈薩克羊尾脂中的表達量最高，在同羊、灘羊、西藏羊尾脂中依次下降，且差異顯著； NELL1 mRNA在西藏羊尾脂中的表達量最高，在灘羊、同羊、哈薩克羊中的表達量依次下降；營養水平和月齡對尾脂和肝臟中 NELL1和 FMO3mRNA的表達水平有顯著影響，而對皮下脂肪和腎周脂肪中 NELL1和 FMO3mRNA的表達影響不顯著。表明 FMO3 mRNA的表達水平與脂肪沉積呈正相關，而 NELL1 mRNA的表達水平與脂肪沉積呈負相關； NELL1與 FMO3對綿羊尾脂和肝臟中的脂肪沉積起調控作用，為進一步揭示脂尾型綿羊體內脂肪沉積的調控機制提供理論基礎。

綿羊； NELL1； FMO3；基因表達；營養水平 ；生長階段

家畜的生長和發育是肉類生產的基礎，而胴體脂肪的分布和含量是決定肉品質的重要因素。脂尾型綿羊約占世界綿羊品種的25%[1]，脂尾型綿羊將大量脂肪儲存于尾部，在一定程度上影響體內其他部位脂肪的沉積，進而影響其肉品質。因此，揭示功能基因、日糧及生長階段對不同脂尾型綿羊脂肪沉積的影響，對改良脂尾型綿羊肉品質具有重要意義。在轉錄組測序研究中發現，不同脂尾型綿羊尾脂中表達顯著上調和下調的基因分別是 NELL1與 FMO3 基因[2]，而這 2 個基因與脂肪代謝相關，說明 NELL1與 FMO3基因可調控綿羊尾部脂肪沉積。 NELL1基因最早從人類胎兒腦cDNA文庫中分離出來，其重要的功能是在骨組織發育過程中促進成骨分化和骨再生[3]。近年來研究表明[4-7]， NELL1能夠促進成骨組織生長，而成骨與成脂是兩個相反的過程，所以 NELL1可能抑制脂肪的生成。萬林子等[8]研究發現， NELL1對脂肪干細胞成骨有一定的促進作用。SONIC Hedgehog信號通路與 NELL1基因對人類脂肪間充質干細胞成骨和成脂分化的加性效應研究發現， NELL1基因和SONIC Hedgehog信號通路能夠促進人體干細胞向成骨分化而抑制其向成脂分化，并且 NELL1能夠加強SONIC Hedgehog通路的作用[9]。 FMO3(黃素單氧化酶3)是一種重要的肝微粒體酶，是FMOs家族中的重要成員。該基因的主要功能是參與體內大量藥物、外源性物質及其他一些化學物質的氧化代謝[10-11]。對 FMO3基因的突變、 FMO3基因與家禽肉品質相關性研究[12]發現， FMO3基因可以改善禽蛋、肉類品質[10-11,13]，并在藥物代謝和毒性中發揮作用[14]。 FMO3基因在不同脂尾綿羊品種中表達差異最顯著[2]，但 FMO3基因在脂肪沉積方面的研究較少，因此有必要進一步研究其在脂尾型綿羊脂肪沉積過程中的作用。

本試驗旨在研究 NELL1與 FMO3基因在不同品種綿羊的尾脂與灘羊不同營養水平和不同階段肝臟、尾脂、皮下脂肪及腎周脂肪的表達差異，為進一步研究 NELL1和 FMO3基因的功能與脂肪沉積機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 不同品種綿羊尾脂樣品采集

不同品種綿羊尾脂樣品分別來源于寧夏農墾灘羊繁育中心(灘羊、哈薩克羊和西藏羊)、陜西省白水縣同羊原種場(同羊)，供試羊群均為舍飼飼養，采樣時間均在10月。采樣時，隨機選擇健康、體質量相近的9月齡灘羊、同羊、哈薩克羊和西藏羊(羯羊)各3只，用手術法活體采取綿羊個體尾部脂肪組織約3 cm3，樣品在DEPC水中剪碎，立即轉入RNAlater中，帶回實驗室于-80 ℃保存，備用。

1.2 試驗動物與日糧

1.2.1 試驗灘羊 選擇健康、體質量相近的4月齡灘羊112只，公母各半，隨機分配到4個處理組，每個處理組4個重復(公母各半)，每個重復7只羊。試驗羊初始體質量差異不顯著。

1.2.2 試驗日糧 根據體質量增加目標分為3個階段：22～28 kg、28～35 kg、35～40 kg。每階段日糧營養水平參考肉羊飼養標準(NY/T816-2004)，按體質量22 kg、日增質量200 g育肥羔羊營養需要為標準(DE：12.30 MJ/kg，CP：15.37%)，設置0.84×標準、0.96×標準、1.08×標準和1.20×標準 4 個營養水平，分別記為T1組、T2組、T3組和T4組，保持能量∶蛋白質為0.8，其他營養水平保持一致,第1階段T1、T2、T3、T4組能量水平分別為7.92、9.05、10.19和11.32 MJ/kg，蛋白水平分別為9.90%、11.32%、12.73%、14.15%。第2階段T1、T2、T3、T4組能量水平分別為7.20、 8.15、8.96和10.65 MJ/kg，蛋白水平分別為9.00%、10.18%、11.20%和13.61%。第3階段T1、T2、T3、T4組能量水平分別為7.08、7.51、9.53和10.21 MJ/kg，蛋白水平分別為8.85%、9.39%、11.91%和12.75%。

1.2.3 試驗灘羊樣品采集 在每個體質量增加階段的最后 1 d，每組從每個重復選取1只與該重復平均體質量最接近的試驗羊，共16只進行屠宰。宰前16 h斷料、2 h斷水。頸動脈放血至死，采集肝臟、腎周脂肪、尾脂、皮下脂肪組織，用PBS緩沖液沖洗干凈，濾紙吸干，迅速用錫箔紙包好并標記清楚，置液氮速凍，-80 ℃冷凍保存，備用。

1.3 試驗試劑

超純RNA提取試劑盒Ultrapure RNA Kit、2×TaqPCR Master Mix購自康為世紀公司，反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT Master Mix、熒光染料SYBR○RPremix ExTaqTMⅡ、pMD19-T Vector(simple)購自大連寶生物公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 總RNA提取、鑒定及cDNA合成 采用超純RNA提取試劑盒Ultrapure RNA Kit，按照試劑盒所提供的方法提取所有樣品組織總RNA。用核酸質量濃度測定儀測定RNA質量濃度及純度，用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質量，-80 ℃保存，備用。

1.4.2 cDNA的合成 取500 ng經檢測質量良好的各組織總RNA，按照試劑盒所提供的方法進行反轉錄反應，產物于-20 ℃保存，備用。

1.4.3 引物設計與合成 根據GenBank提供的綿羊(Ovisaries) FMO3基因(登陸號：NM_174057)、 NELL1基因(登陸號：NM_031069)序列，使用Primer Premier 5軟件分別設計特異性引物，引物信息見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4.4 熒光定量PCR反應 以綿羊β-actin基因為內參基因，采用熒光染料SYBR○RPremix ExTaqTMⅡ測定各組織樣品中 NELL1基因和 FMO3基因mRNA的相對表達量，每個樣品3個重復。PCR反應體系為25 μL：2×SYBR○RPremix ExTaqⅡ(內含TaKaRa ExTaqHS、dNTP Mixture、Mg2+、TliRNaseH、SYBR○RGreen Ⅰ)12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，cDNA模板2 μL，雙蒸水8.5 μL。實時熒光定量PCR反應采用3 步法，反應條件：95 ℃預變性1 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s，循環數45；每個循環結束后采集熒光。全部反應結束后進行熔解曲線分析，根據溶解曲線判斷PCR反應的特異性。反應條件：55～95 ℃，每30 s升溫0.5 ℃，循環數81。

1.4.5 數據統計分析 所有樣品采用內參基因β-actin進行標準化校正處理，采用2-△△Ct法計算 NELL1和 FMO3的相對表達量。數據以“平均值±標準誤”表示，n=3，試驗數據用Excel 2013初步整理和計算后，用SPSS 22.0統計軟件進行單因子方差分析(one-way ANOVA)，以Duncan’s進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同尾型綿羊尾脂中 NELL1mRNA和 FMO3mRNA的表達差異

由圖1可知， NELL1基因在西藏羊尾脂中的表達量最高(P<0.05)；在灘羊和同羊中的表達量依次下降(P<0.05)；而在哈薩克羊中的表達量最低(P<0.05)。圖2顯示 FMO3 mRNA在哈薩克羊尾脂中的表達量最高(P<0.05)；在同羊、灘羊和西藏羊尾脂中的表達量較低。

KZ.哈薩克羊(肥臀型) Kazakh sheep(Hip fat-tail);TS.同羊(短脂尾) Tong sheep(short fat-tail);TAN.灘羊(短脂尾) Tan sheep(short fat-tail);TB.西藏羊(短瘦尾) Tibetan sheep(short thin-tail).圖上標注不同字母表示差異顯著(P<0.05) Without the same letters indicate significant difference between different tissues atP<0.05. 下同 The same as below

圖1 NELL1mRNA在4個品種綿羊尾部脂肪組織中的表達量
Fig.1 NELL1 mRNA expression in tail fat of four sheep breeds

圖2 FMO3mRNA在4個品種綿羊尾部脂肪組織中的表達量Fig.2 FMO3mRNA expression in tail fat of four sheep breeds

2.2 NELL1和 FMO3的轉錄表達規律

2.2.1 NELL1 mRNA的表達規律 由圖3可知， NELL1mRNA在灘羊尾部脂肪、皮下脂肪、腎周脂肪和肝臟的表達發育模式不同。

在第1階段(22～28 kg)， NELL1 mRNA在尾脂中的表達量以T4組為最高(P<0.05)，T1、T2、T3組間差異不顯著；在皮下脂肪、腎周脂肪和肝臟中，T1、T2、T3、T4組間差異不顯著(P>0.05)。在空間上， NELL1基因的表達量均為肝>皮下脂肪>尾脂(腎周脂)。

在第2階段(28～35 kg)， NELL1 mRNA在尾脂中的表達量以T4組為最高(P<0.05)，T1、T2、T3組間差異不顯著；在肝臟中的表達量以T4組為最高(P<0.05)，依次為T3、T1、T2組；而在腎周脂肪和皮下脂肪中營養水平對其表達量影響不顯著(P>0.05)。在空間上， NELL1mRNA的表達量均為肝>腎周脂肪>尾脂(皮下脂肪)。

在第3階段(35～40 kg)， NELL1 mRNA在尾脂中的表達量以T4組為最高(P<0.05)，依次為T2、T3、T1組；在皮下脂肪中的表達量以T4組為最高(P<0.05)，依次為T2、T3、T1組；在肝臟中的表達量以T1組為最高(P<0.05)，依次為T2、T3、T4組；在腎周脂肪中各組的表達量無顯著差異(P>0.05)。在空間上， NELL1 mRNA的表達量在肝臟中最高。

以T2組(因為T2組最接近標準)為例來討論同等營養水平下， NELL1mRNA階段性表達的差異。在尾脂中， NELL1 mRNA的表達量在第2階段最低(P<0.05)，3個階段呈先降低再升高趨勢，隨著生長階段的不同也會有變化；在皮下脂肪中， NELL1mRNA在第1階段的表達量最高(P<0.05)，第2階段和第3階段依次降低； NELL1 mRNA在肝臟和腎周脂肪組織中的表達量均在第3階段最高(P<0.05)，第2階段和第1階段依次降低。在肝臟中隨著營養水平的升高， NELL1mRNA表達量升高的幅度會降低，而在腎周脂肪中平穩增加，說明在肝臟中 NELL1mRNA的表達量是由月齡和營養水平共同決定的。

顏色由藍到紅深淺表示表達量由低到高 The color from blue to red means expression quantity from low to high;尾脂-1表示第一階段尾脂的表達量，依次類推 Fat Tail-1 said the first phase expression quantity of fat tail,and so forth;Ⅰ～Ⅳ.由低到高4個營養水平 Four nutrient levels from low to high.下圖同 The same as next figure

圖3 NELL1 mRNA在灘羊組織中的表達量
Fig.3 NELL1mRNA expression in tissues of Tan sheep

2.2.2 FMO3mRNA的表達規律 由圖 4可知， FMO3mRNA在灘羊尾部脂肪、皮下脂肪、腎周脂肪和肝臟的表達發育模式不同。在相同生長階段，尾部脂肪組織 FMO3 mRNA的最高表達量均在T2組，皮下脂肪在T3組，腎周脂肪最高表達量在T1組，肝臟的最高表達量在T4組，最高表達組與相同階段時的最低表達組相比差異顯著(P<0.05)。在空間上， FMO3 mRNA在肝臟組織的表達量最高，在尾脂、皮下脂和腎周脂中的表達量并無太大差異。

在同等營養水平下，尾部脂肪組織中 FMO3 mRNA在第2階段的表達量最低，與最高表達階段(第3階段)差異顯著(P<0.05)；皮下脂和肝臟中 FMO3mRNA在第3階段的表達量最低(P<0.05)；在腎周脂肪組織中，第1階段的表達量最高(P<0.05)?？偠灾?，在同等營養水平下 FMO3mRNA的表達量在尾部脂肪是第3階段>第1階段>第2階段，而在皮下脂肪、肝臟和腎周脂肪中都是第1階段>第2階段>第3階段。

3 討 論

本試驗結果表明， NELL1基因在西藏羊尾脂中的表達量最高；在同羊、灘羊、哈薩克羊尾脂中的表達量依次下降；表明其在短瘦尾、短脂尾、肥臀型的表達量依次降低；哈薩克羊屬肥臀型羊，尾部脂肪沉積最多， NELL1的表達量最低，而短脂尾、短瘦尾型羊尾部脂肪沉積依次減少， NELL1的表達量依次增加，結果提示 NELL1基因的表達量與脂肪的沉積呈負相關。James 等[15]通過攜帶 NELL1基因的腺病毒表達載體轉染脂肪細胞抑制脂肪的生成，并且初步驗證通過影響PPARγ、LPL、AP2相關基因來影響脂肪合成，本研究與其研究結果一致。Shen等[16]研究發現， NELL1提高BMP2誘導成骨，抑制BMP2誘導成脂作用，并且 NELL1這一作用需要通過Wnt信號途徑來實現，也與本試驗研究結果相一致。

圖4 FMO3 mRNA在灘羊組織中的表達量Fig.4 FMO3 mRNA expression in different tissues of Tan-sheep

尾部脂肪中 NELL1mRNA的表達量在 3 個生長階段中都是T4組最高。說明 NELL1基因的表達會隨著營養水平的提高而增加。一方面，本試驗第1階段與第2階段灘羊分別處于4～5、6～7月齡，4月齡后由于受到斷奶應激的影響，灘羊采食量較少，體質量增長也相對較慢，至6月齡時，灘羊處于育成前期，準備進入性成熟階段(7～8月齡)[17]，脂肪沉積緩慢。另一方面，眾所周知，高營養水平有助于脂肪的沉積，苗海明[18]在不同營養水平對蒙古綿羊肌內脂肪沉積相關基因mRNA表達量的影響中發現，營養限制組粗脂肪、肌內脂肪沉積會下降，因此 NELL1基因的mRNA表達量在此階段隨營養水平升高而升高，可能是機體為抵抗脂肪沉積而產生的自平衡機制；而在第1階段與第2階段時，腎周脂肪與皮下脂肪中 NELL1基因的表達量在各營養水平差異并不顯著，這可能由灘羊本身品種特性決定，脂尾型綿羊(灘羊)脂肪沉積以尾部為主，而尾部脂肪的沉積在一定程度上影響全身脂肪的分布。這與Kashan等[19]的研究結果相一致，脂尾型的Chaal和Zandi品種小鼠與雜交小尾品種Zel相比，由于脂肪大量沉積于尾部，皮下脂肪相對較少。對灘羊生長發育規律的研究發現[17,20]，9月齡時，灘羊進入育成后期(本試驗的第3個階段)，體質量快速增加，脂肪沉積速度加快，而在此階段，在尾脂和皮下脂肪中都是T4組表達最高，而實際結果是不同營養水平下，灘羊尾部從表型上看并無太大差異，其原因可能是機體為抵抗脂肪沉積而產生的平衡機制。在肝臟中，T1組的表達量最高(P<0.05)，而T1組是營養水平最低組，結合3個階段 NELL1在空間表達情況來看，都是肝臟中最高；眾所周知，肝臟是脂肪合成的主要器官，低營養水平時，肝組織中以高表達 NELL1來抑制脂肪的合成，相反在高營養水平時，則表達較低。

在相同營養水平下，不同階段灘羊各組中的 NELL1基因mRNA也出現差異性表達。尾脂中 NELL1的表達量在低能量組時，第1階段表達量最高；而隨著能量水平的逐漸增加，表達量最高的階段依次出現在第2階段和第1階段。第3階段是脂肪沉積階段，表達量應該會低，但由于能量不足，機體可能會表達較高的 NELL1來抑制脂肪形成，來滿足機體自身生長的能量需求。而肝臟及腎周脂表達最高出現在第3階段，第3階段灘羊正處在脂肪沉積的高峰，需要較高水平的NELL來調節沉積方式。

本研究結果表明，西藏羊尾脂中 FMO3基因的表達水平只有哈薩克羊的1/5左右。 FMO3基因與 NELL1基因相反，其表達水平在尾型大的品種中的表達量高。阿勒泰羊在體成熟后，其尾部脂肪的生成主要表現在脂肪細胞體積的增大[21]。由此猜想， FMO3在脂尾型綿羊中的表達量高，此基因可能是影響脂肪沉積的功能基因，推測其對綿羊尾部脂肪的沉積具有一定的促進作用。 FMO3基因在各組織中的表達模式不同，營養水平對其影響存在一定的規律性，例如，相同階段下，尾脂、皮下脂肪、腎周脂肪、肝臟中其表達量最高依次出現在T2、T3、T1、T4組。

4 結 論

綿羊 NELL1和 FMO3基因的表達與綿羊脂肪沉積具有相關性。不同尾型綿羊尾的大小與脂肪沉積多少直接相關，而尾部脂肪的沉積與 NELL1和 FMO3基因的表達有相關性，并且 NELL1基因的表達與脂肪沉積呈負相關， FMO3基因的表達與脂肪的沉積呈正相關。而且 NELL1和 FMO3基因的表達也受營養水平和所處生長階段影響，具有不同的發育性表達規律。

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(責任編輯：顧玉蘭 Responsible editor:GU Yulan)

mRNA Expression of NELL1 and FMO3 in Liver and Adipose Tissue of Sheep

TIAN Chongqi,ZHOU Shiwei,WANG Xiaofang,TIAN Chunli,DAI Lixia,ZENG Jie,WANG Xiaolong,YANG Yuxin,ZHANG Enping ,CHEN Yulin and KOU Qifang

(College of Animal Science and Technology,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi 712100,China)

This experiment was to explore the tissue specific expession of NELL1 and FMO3 in fat-tailed sheep under different nutrition levels and in different growth periods. Firstly,nine-month-aged Tan sheep,Tong sheep,Kazakh and Tibetan sheep which had the similar body mass were selected for adipose tissue collection,three individuals were used for each breed. In total,112 healthy Tan sheep were randomly divided into four groups (according to a completely random experiment design) with four replicates per group (two males and two females),each replicate comprises seven animals. This experiment was divided into three periods according to mass gain target:22-28 kg,28-35 kg,35-40 kg. At the end of each stage,the liver fat,perineal fat,tail fat and subcutaneous fat were collected. The total RNA was extracted from adipose tissues,and the expression level of FMO3 and NELL1 were analyzed by quantitative PCR. The results showed as that: the highest expression level of FMO3 was in the Kazakh breed (fat-tailed),followed by Tong,Tan,and Tibetan sheep (short-tail). In addition, NELL1 is highly expressed in the tails of Tibetan sheep,declined in turn with Tan sheep,Tong sheep,and Kazakh breed. The expression of FMO3 and NELL1 in liver and tail fat were significantly affected by nutrition levels and ages,while there was no detectable influence in perineal and subcutaneous fat. In conclusion,fat deposition had a positive correlation to FMO3 expression and negatively correlated to NELL1 expression in sheep. The effects of FMO3 and NELL1 on fat deposition may be regulated through their expression difference in liver and tail fat. Our results provide molecular basis to illustrate the mechanism of fat deposition in fat-tailed sheep breeds.

Sheep; NELL1; FMO3; Gene expression; Nutrition levels; Growth periods

2016-03-24 Returned 2016-06-24

The National Hair Sheep Industry Technology System(No.CARS-40-13);the Public Service Sectors (agriculture) Research Projects(No.201303059);the Science and Technology Research and Development Program of Shaanxi(No.2014K01-17-03);the Agricultural Science and Technology Research Projects of Shaanxi (No.2014K01-17-04).

TIAN Chongqi,male,master student.Research area:animal nutrition and feed science.E-mail:tianchongqi@126.com

ZHANG Enping,male,professor,master supervisor.Research area: animal nutrition and feed science.E-mail:zhangenping@nwafu.edu.cn

日期：2017-06-05

2016-03-24

2016-06-24

國家絨毛用羊產業技術體系(CARS-40-13)；公益性行業(農業)科研專項(201303059)；陜西省科學技術研究發展計劃(2014K01-17-03)；陜西省農業科技攻關(2014K01-17-04)。

田崇奇，男，碩士研究生，研究方向為動物營養與飼料科學。E-mail: tianchongqi@126.com

張恩平，男，教授，碩士生導師，研究方向為動物營養與飼料科學。E-mail：zhangenping@nwafu.edu.cn 陳玉林，男，教授，博士生導師，研究方向為動物營養與飼料科學。E-mail：chenyulin@nwafu.edu.cn

S826.8

A

1004-1389(2017)06-0805-07

CHEN Yulin,male,professor,doctoral supervisor.Research area: animal nutrition and feed science.E-mail:chenyulin@nwafu.edu.cn

網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170605.1714.002.html