蘋果樹腐爛病菌活性物質的提取分離及結構鑒定

甄 偉,袁艮霞,王 惠,黃麗麗

(1.西北農林科技大學 理學院， 陜西楊凌 712100; 2.西北農林科技大學 植物保護學院，陜西楊凌 712100;3.西北農林科技大學 旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌 712100)

蘋果樹腐爛病菌活性物質的提取分離及結構鑒定

甄 偉1,3,袁艮霞1,3,王 惠1,黃麗麗2,3

(1.西北農林科技大學 理學院， 陜西楊凌 712100; 2.西北農林科技大學 植物保護學院，陜西楊凌 712100;3.西北農林科技大學 旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌 712100)

為探索蘋果樹腐爛病菌(Valsamali) 野生型菌株03-8產生的活性物質及其與致病性的關系，在以蔗糖為碳源的MS液體培養基中25 ℃靜置培養20 d，利用大孔樹脂吸附、二氯甲烷萃取、薄層層析和高效液相色譜等手段分離純化，1H-NMR、13C-NMR、DEPT135、HMQC譜對純化合物進行結構鑒定，并測定其生物活性。最終分離得到一個化合物D-2；結構鑒定為1-(3′-乙烯基-苯基)-1,2-乙二醇；該化合物1 mg/mL的丙酮水[V(丙酮)∶V(水)=1∶4]溶液不能在煙草和蘋果葉片上引起壞死斑，但對枯草芽孢桿菌有抑制作用。

蘋果樹腐爛病菌；提取分離；鑒定；抑菌活性

蘋果樹腐爛病(Apple valsa canker)是由蘋果黑腐皮殼屬真菌Valsamali引起的蘋果病害[1-2]。目前，控制蘋果腐爛病害主要是采用刮除受感染樹皮和涂抹殺菌劑的方法[3-4]。但是，效果不佳，主要原因是目前對該病菌的致病機理了解甚少。因此，探究蘋果樹腐爛病菌生長過程中產生的活性物質及其與致病性的關系具有重要意義。

關于蘋果樹腐爛病菌活性代謝產物的研究主要集中在果膠酶方面[5-8]。關于小分子的活性物質，目前只有Okuno等從該病菌的MS培養發酵液中提取分離出五種異香豆素物質[9]。關于其他結構類型的小分子物質當前尚未見報道。本研究采用蔗糖為碳源的液體培養基對野生型蘋果樹腐爛病菌03-8的發酵濾液進行提取分離和純化，對純物質進行結構鑒定，并對其生物活性進行測定，旨在獲得新的活性相關物質，為進一步了解蘋果樹腐爛病菌提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養基

供試菌種：蘋果樹腐爛病菌(Valsamali)野生型菌株03-8和枯草芽孢桿菌(EDR4)，均由西北農林科技大學植物病害綜合治理實驗室提供，4 ℃保存。

液體培養基：參照Okuno等[9]的MS培養基的配制方法，以蔗糖(質量濃度5 g/L)代替其中的淀粉(質量濃度10 g/L)，其他成分不變。

1.2 試劑與儀器

儀器：WD-9403A型熒光-紫外分析儀，北京市六一儀器廠； AVANCE III型核磁共振儀(500 MHz)，瑞士Bruker BioSpin 公司；高效液相色譜儀(JYD07J308)，日本島津公司；柱色譜層析硅膠，青島海洋化工有限公司；硅膠G，青島海洋化工有限公司；XAD-2型大孔吸附樹脂，美國Sigma Aldrich公司。

試劑：氯仿、甲醇、乙酸乙酯、石油醚等均購自天津市富宇精細化工有限公司，均為分析純；氘代氯仿購自美國Sigma Aldrich公司。

1.3 發酵濾液制備

將蘋果樹腐爛病菌野生型菌株03-8接種于PDA平板培養基上，在25 ℃培養3 d，于菌落邊緣的幼嫩菌絲處打菌餅(6 mm)，將菌餅接種于配好的液體培養基中，每330 mL培養液放置15個菌餅。接種后將三角瓶置于25 ℃恒溫室靜置培養20 d，每隔12 h手動搖動1次。將培養好的菌液進行離心，上清依次用濾紙、0.45微米濾膜、0.22微米濾膜抽濾去除菌體，所得濾液即為發酵濾液。

1.4 提取分離

將預處理的大孔樹脂XAD-2與發酵濾液混合，體積比為1∶3，在20 ℃、120 r/min搖床振搖10 h，使發酵濾液充分吸附于樹脂上。將上述吸附后的大孔樹脂裝柱，依次以V(水)∶V(甲醇)(100∶0、75∶25、50∶50、25∶75、0∶100)為洗脫劑洗脫，洗脫劑體積用量為樹脂體積的3倍，流速約1 mL/min，得5個餾分段(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)，通過稱量確定各餾分段的含量，以含量較高的餾分段進行進一步分離純化。

對餾分Ⅳ的水溶液用二氯甲烷進行萃取，濃縮得到二氯甲烷相，對二氯甲烷相進行硅膠制備薄層層析分離，展開劑為氯仿+甲醇[V(氯仿)∶V(甲醇)=9∶1]，得到10個組分(A、B、C、D、E、F、G、H、I、J)；D組分進一步用制備液相色譜分離，得到物質D-2。

1.5 生物活性測定

1.5.1 致病活性測定 分別在煙草葉片和蘋果葉片上對化合物D-2進行致病活性檢測。在煙草葉片上采用注射接種法。將1 mg/mL的D-2丙酮水[V(丙酮)∶V(水)=1∶4]溶液20 μL從煙草葉片背面注入，放置 2 d 后觀察致病情況。每處理重復3次，設置丙酮水[V(丙酮)∶V(水)=1∶4]對照。在蘋果葉片上采用針刺法。選取枝條前端完全展開的葉片，用無菌水沖洗晾干，用滅菌脫脂棉包裹葉柄基部，脫脂棉上滴加無菌水保濕，接種針刺傷，傷口處滴加1 mg/mL的D-2丙酮水[V(丙酮)∶V(水)=1∶4]溶液20 μL，保鮮膜密封保濕，放置 2 d 后觀察致病情況。每處理重復3次，設置丙酮水[V(丙酮)∶V(水)=1∶4]對照。

1.5.2 抑菌活性測定 以枯草芽孢桿菌EDR4為指示菌對化合物D-2進行抑菌活性檢測。取1 mg/mL 的D-2丙酮溶液20 μL加入50 mL的LB培養基中，以丙酮作對照；在5 mL的LB培養基中加入50 μL的枯草芽孢桿菌EDR4種子液，28 ℃、180 r/min搖培，4、8和12 h后分別檢測其OD值，并利用統計軟件Spass進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 化合物D-2的結構鑒定

化合物D-2：紫外254 nm下有熒光吸收。1H-NMR(500 MHz，CDCl3-d6) δ:3.73 (1H,dd,J = 11.2,8.2 Hz)，3.83 (1H,dd,J = 11.2,3.5Hz)， 4.89 (1H,dd,J = 8.2,3.7 Hz)，5.32 (1H,d,J = 10.7 Hz)，5.82 (1H,d,J = 17.6 Hz)，6.77 (1H,dd,J = 17.5,11.0 Hz)，7.25(1H,d,7.4)，7.38 (1H,d,J = 7.4,7.6 Hz),7.40(1H,d,J = 7.6 Hz),7.47 (1H,s);13C-NMR(500 MHz，CDCl3-d6)δ：68.09 (C-1*),74.63(C-2*),114.32 (C-8),123.91 (C-2),125.50 (C-4),125.89 (C-6),128.76 (C-5),136.61 (C-7),137.98 (C-3),140.84 (C-1); Dept135 δ：正峰：74.63,123.91,125.50,125.89,128.76,136.61；負峰：68.09,114.32。

對上述數據進行分析可知，化學位移在114.32,123.91,125.50,125.89,128.76,136.61,137.98,140.84的碳原子，表明該化合物含有苯環結構以及1個碳碳雙鍵；7.25(1H,d,7.4)，7.38 (1H,d,J = 7.4,7.6 Hz),7.40(1H,d,J=7.6 Hz),7.47 (1H,s)表明苯環為1,3雙取代，5.32 (1H,d,J = 10.7 Hz)，5.82 (1H,d,J=17.6 Hz)，6.77 (1H,dd,J = 17.5,11.0 Hz)表明存在1個-CH=CH2。根據Dept135及13C-NMR可知化學位移74.63,123.91,125.50,125.89,128.76,136.61為伯碳和叔碳，68.09,114.32 為仲碳，137.98,140.84碳為季碳。綜上所述化合物D-2為1-(3′-乙烯基-苯基)-1,2-乙二醇(圖1)。

圖1 1-(3′-乙烯基-苯基)-1,2-乙二醇Fig.1 1-(3′-ethenylphenyl)-1,2-ethanediol

2.2 化合物D-2的生物活性

2.2.1 化合物D-2的致病活性 對化合物D-2在煙草葉片上進行的生物活性測定試驗發現，樣品組和對照組無明顯差異。表明化合物D-2對煙草葉片沒有明顯致病活性；采用針刺法檢測化合物D-2對蘋果葉片的致病活性試驗中，樣品組和對照組的個別處理雖然表現出微小差異，但統計分析結果差異不顯著，表明化合物D-2對蘋果葉片沒有致病活性。分析認為雖然化合物D-2分離自蘋果樹腐爛病菌的發酵液中，但并非是該病菌的直接致病活性物質。

2.2.2 化合物D-2的抑菌活性 以丙酮為對照，將化合物D-2加入接有枯草芽孢桿菌的培養液中，對化合物D-2進行抑菌活性檢測的結果見圖2。由圖2可見，化合物D-2在與枯草芽孢桿菌接觸4 h時與對照組現象一樣，枯草芽孢桿菌均未生長。而在接觸8 h后，對照發酵液的OD值明顯高于加有D-2發酵液的OD值，12 h兩者的區別更加明顯，表明化合物D-2對枯草芽孢桿菌有抑制作用?？莶菅挎邨U菌是對蘋果樹腐爛病菌有抑制作用的生防菌，本試驗分離到的D-2源于野生型蘋果樹腐爛病菌的發酵液，對其生防菌有抑制作用，推測這是蘋果樹腐爛病菌在生長過程中代謝產生的抵抗逆境的防御性活性物質。

誤差線為標準偏差，不同小寫字母表示差異顯著性(P<0.05)。

Error bars represent SD,and different letters indicate significant difference (P<0.05).

圖2 D-2對枯草芽胞桿菌的活性曲線
Fig.2 Antibacterial activities of D-2 to Bacillus subtilis

3 討 論

本研究首次在蘋果樹腐爛病菌的發酵液中分離得到化合物D-2，結構分析確定為1(3′-乙烯基-苯基)-1,2-乙二醇。查閱資料發現，以前在樹木病害的致病菌中尚未見報道。該化合物存在1個手性碳原子，試驗中尚未確定該手性碳原子的構型。

關于1-(3′-乙烯基-苯基)-1,2-乙二醇曾有文獻報道在擔子菌中存在。 (1S)-(3-乙烯基-苯基)-1,2-乙二醇于2007年在牛肝菌發酵液中發現[10]；(1R)-(3-乙烯基-苯基)-1,2-乙二醇于2013年在木蹄菌的子實體中發現[11]，但對其生物學功能并不清楚。

研究發現1-(3′-乙烯基-苯基)-1,2-乙二醇對煙草葉片和蘋果葉片沒有致病活性，表明其不是該病菌的直接致病活性物質，但其對枯草芽胞桿菌EDR4有抑制作用，文獻[11]也報道(1R)-(3-乙烯基-苯基)-1,2-乙二醇對枯草芽胞桿菌(ATCC 6633)有抑制作用。

枯草芽孢桿菌是對蘋果樹腐爛病菌有抑制作用的生防菌[12-13]，從蘋果樹腐爛病菌發酵液中分離得到的乙二醇對其有一定抑制作用，推測可能是蘋果樹腐爛病菌在進化過程中，為適應環境，保護自身生存，與其他生物競爭而產生的物質。這種物質的存在可能是蘋果樹腐爛病菌能順利侵染寄主而致病的原因。因此可以推測，在蘋果樹腐爛病的防治中如果增加抑制該物質產生的途徑，應該能增強枯草芽孢桿菌的防治效果。

由于試驗分離得到的活性物質量的限制，尚未對該化合物進行其他生物活性檢測，該化合物是否在蘋果樹腐爛病菌代謝過程中還有其他作用有待進一步研究。

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(責任編輯：郭柏壽 Responsible editor:GUO Baishou)

Isolation and Structural Identification of Pathogenic Substance fromValsamali

ZHEN Wei1,3,YUAN Genxia1,3,WANG Hui1and HUANG Lili2,3

(1.College of Science,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi 712100,China; 2.College of Plant Protection,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi 712100,China; 3.State Key Laboratory of Crop Stress Biology in Arid Areas,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi 712100,China)

In order to explore the bioactive substances of the wide typeValsamali03-8 and its effects in pathogenic process,the pathogen was fermented in sucrose-carbon-source liquid media for 20 days at 25 ℃. Cultural filtrate obtained by filtration was adsorbed to the macroporous resin and eluted by different ratio of methanol and water. Then,the fractions were extracted by dichloromethane. The dichloromethane phase was separated and purified by thin layer chromatography and HPLC. The structure was elucidated by1H-NMR,13C-NMR,DEPT135 and HMQC spectra. Its biological activities were tested. Finally,a compound D-2 identified as 1-(3′-ethenylphenyl)-1,2-ethanediol was obtained.1 mg/mL of this compound in acetone water solution [V(acetone)∶V(water)=1∶4]showed antibacterial activities to Bacillus subtilis,but had no bioactivity to tobacco leaves and apple leaves.

Valsamali；Extraction and separation；Identification；Antimicrobial activity

2016-04-25 Returned 2016-06-30

National Special Fund for Agro-scientific Research in the Publich Interests(No.201203034).

ZHEN Wei,male,master student.Research area:natural products.E-mail:zhenweiwy@163.com

WANG Hui,female,professor,master supervisor.Research area:natural products.E-mail:wanghuiab@sina.com

日期：2017-06-05

2016-04-25

2016-06-30

國家公益性行業(農業)科研專項(201203034)。 第一作者：甄 偉，男，在讀碩士，從事天然產物的研究。E-mail：zhenweiwy@163.com 通信作者：王 惠，女，教授，碩士生導師，主要從事天然產物研究。E-mail：wanghuiab@sina.com

S436.611.1+1

A

1004-1389(2017)06-0946-04

網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170605.1728.038.html