Cyr61、MMP—3在痛風性腎病大鼠腎臟中的表達

張寧寧　趙玉杰　牛效清

[摘要] 目的 研究富含半胱氨酸蛋白61（cysteine-rich 61，Cyr61/CCN1）、基質金屬蛋白酶-3（matrix metalloproteinases-3，MMP-3）在痛風性腎病大鼠腎臟組織的分布及表達，探討Cyr61在腎間質損傷中的作用。 方法 20只雄性Wistar大鼠隨機分為對照組和模型組。模型組大鼠給予含0.2%腺嘌呤和20%酵母浸粉的高嘌呤飼料喂飼，周期90 d。模型建立后行HE染色并用免疫組化法檢測Cyr61、MMP-3在腎組織的表達情況。 結果 光鏡下兩組MMP-3表達部位一致，主要分布于腎皮質內的小管上皮細胞胞漿中且以基底膜側表達為著，模型組陽性表達強度減弱（P<0.05）；兩組Cyr61均主要表達于近端小管上皮細胞胞漿內，模型組陽性表達增加（P<0.01）。 結論 在腎損傷末期Cyr61對MMP-3的誘導作用減弱，防護能力下降。

[關鍵詞] 富含半胱氨酸蛋白61；基質金屬蛋白酶-3；痛風性腎病；腎間質損傷

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）17-0033-03

[Abstract] Objective To investigate the distribution and expression of cysteine-rich 61 and matrix metalloproteinases-3 in renal tissue of rats with gouty nephropathy， and to explore the role of Cyr61 in renal interstitial injury. Methods Twenty male Wistar rats were randomly divided into two groups： the control group and the model group. Rats in the model group were fed with high purine diets containing 0.2% adenine and 20% yeast extract for a period of 90 days. After the model was established， HE staining was performed and the expression of Cyr61 and MMP-3 in renal tissue was detected by immunohistochemistry. Results The expressions of MMP-3 in the two groups were mainly distributed in the cytoplasm of tubular epithelial cells which in the renal cortex， and the expression of MMP-3 in the model group was decreased（P<0.05） .Two groups of Cyr61 were mainly expressed in the cytoplasm of proximal tubule epithelial cells，and the positive expression in model group was increased（P<0.01）. Conclusion At the end of renal injury， the induction of MMP-3 by Cyr61 was weakened， and the protective ability decreased.

[Key words] Cyr61； MMP-3； Gouty nephropathy； Renal interstitial injury

痛風（gout）是尿酸鹽沉積性炎性疾病，以血清尿酸水平升高伴急慢性關節炎、間質性腎炎或腎結石為主要臨床表現。基質金屬蛋白酶-3（matrix metalloproteinases-3，MMP-3）在炎癥反應中占有重要地位，可使炎癥細胞聚集浸潤，調節炎癥反應[1]，同時MMP-3還通過降解細胞外基質（extracellular matrix，ECM）參與腎臟纖維化的發生。富含半胱氨酸蛋白61（cysteine-rich 61，Cyr61/CCN1）是一種分泌型蛋白質，其表達水平及生物學功能具有組織特異性[2]。研究發現Cyr61與腎小球疾病、腎血管疾病、腎小管間質損傷和纖維化等密切相關，但其作用機制有待進一步研究[3]。本文嘗試通過對痛風性腎病大鼠腎組織中MMP-3、Cyr61分布及表達變化的研究，探討Cyr61在腎間質損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物模型的制備及分組

6～8周齡清潔級雄性Wistar大鼠20只，體重188～220 g，購于哈爾濱醫科大學實驗動物中心[SCXK（黑）2013-001]，適應性喂養1周后隨機等分為對照組和模型組。對照組給予普通飼料喂養，模型組給予含0.2%腺嘌呤和20%酵母浸粉的高嘌呤飼料喂飼，藥物劑量每只大鼠酵母浸粉20 g/（kg·d），腺嘌呤200 mg/（kg·d），依據體重限量投放飼料。兩組大鼠自由飲水，每周稱重1次，造模周期為90 d。

1.2 主要試劑

腺嘌呤產自Sigma公司；酵母浸粉產自北京奧博星生物公司；MMP-3、Cyr61多克隆抗體及即用型SABC免疫組化試劑盒均產自武漢博士德生物公司。

1.3 病理學檢測

1.3.1 蘇木素-伊紅（HE）染色 腎組織經固定、脫水、透明以及石蠟包埋后，制成3 μm厚組織切片，HE染色后光鏡下觀察組織結構變化。

1.3.2 免疫組織化學染色 將石蠟組織切片脫蠟、脫水，然后抗原修復、孵育抗體、DAB顯色，最后在LEICA DM4000B顯微鏡下觀察，每張切片隨機選取10個視野拍攝圖片，應用Image pro plus 6.0圖像分析系統對圖像進行分析，測量陽性區域的累積光密度值（IOD）。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。計量資料以中位數（M）、四分位數間距（QR）表示；對非正態分布或方差不齊的計量資料采用Mann-Whitney U檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 組織病理觀察

對照組腎單位形態規則，間質內無炎性細胞浸潤。模型組腎組織結構紊亂，腎小球萎縮；近端小管上皮細胞水腫，管腔擴張，偶見顆粒管型及蛋白管型；髓袢和集合管內可見棕黃色的沉積物；間質纖維化，可見大量淋巴細胞、單核細胞及巨噬細胞浸潤，見封三圖5。

2.2 腎組織中MMP-3的表達部位及水平

光鏡下，對照組MMP-3主要分布于腎皮質內的小管上皮細胞胞漿中且以基底膜側表達為著。模型組MMP-3的陽性部位與對照組一致，但表達強度減弱，與對照組間存在顯著性差異（P<0.05），見表1、封三圖6。

2.3 腎組織中Cyr61的表達部位及水平

光鏡下，兩組Cyr61均主要表達于近端小管上皮細胞胞漿內。由于Cyr61分泌后與硫酸乙酰肝素蛋白多糖結合，蛋白構象改變，抗原位點封閉，在ECM中不能利用免疫組化方法檢測[4]。本研究未觀察到Cyr61在小管間質表達，與以往研究一致[4，5]。模型組陽性表達增加，與對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.01），見表1、封三圖7。

3 討論

MMP-3又稱間質溶解素1（stromelysins-1），在腎臟主要由腎小管的上皮細胞以無活性的酶原形式分泌，只有被活化后才能降解基質蛋白[6]。激活后的MMP-3可降解幾乎全部腎小球基底膜和ECM的組成成分[7]，并能夠激活其他MMPs家族成員，共同參與腎間質ECM的降解和轉運。正常情況下MMP-3的表達量極少[7]，而在炎癥、胚胎發生、血管形成、腫瘤侵襲轉移時其表達量上升。研究證實，在急性痛風性關節炎患者關節滑液中，MMP-3濃度高于非炎性關節疾病[8]；在中、重度系膜增生性腎炎患者的腎小球中MMP3蛋白表達增強[9]。

紫外線、細胞因子和生長因子等可引起MMP-3發生轉錄水平的改變。白細胞介素1、神經生長因子、表皮生長因子、血小板源性生長因子（PDGF）等可誘導MMP-3表達，而轉化生長因子-β（TGF-β）、糖皮質激素則抑制MMP-3的表達[7，9]；此外，組織金屬蛋白酶抑制劑-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）通過與MMP-3的催化區域結合形成復合物，抑制MMP-3的活性[3-9]。

近年來，ECM降解機制的研究日益受到人們的重視。MMPs及TIMPs是調節ECM動態平衡的最重要的酶系之一，其活性的變化及比例的失衡是最終導致腎臟纖維化發生的主要機制。Cyr61作為整合素的配體，是抗纖維化中重要的一個環節[10]。

Cyr61是由上皮細胞、成纖維細胞、軟骨細胞、血管內皮和平滑肌細胞等多種間質細胞，在血清、PDGF、TGF-β等刺激下生成的即刻蛋白[5]。Cyr61作為一種信號分子具有多種功能，能夠趨化細胞及促進細胞增殖、粘附[2]；誘導MMP-1、MMP-3和TIMP1表達上調[11]，引起ECM重構；調節多個基因的轉錄，在細胞免疫應答、炎癥反應和腫瘤細胞惡性生物學行為等生理病理過程中發揮重要作用[12]。

本研究中我們通過喂飼大鼠含酵母及腺嘌呤飼料的方式來模擬人類痛風性腎病的發病機制，并依據臨床急慢性腎病的判定時長設定造模周期，從而引發大鼠代謝異常相關的慢性間質性腎炎。從實驗結果中我們發現，MMP-3在腎組織中的陽性表達明顯減弱，同其他腎纖維化研究的結果一致[13，14]。然而Cyr61在腎組織中的陽性表達增加，與對照組相比差異有統計學意義（P<0.01）。由于活化的MMP-3能夠降解ECM成分，故在腎纖維化進程中起保護性作用。PDGF可直接或間接通過刺激Cyr61的生成，促進MMP-3在腎臟的表達；作為致纖維化的細胞因子TGF-β一方面可以降低MMP-3的表達量，另一方面又能刺激Cyr61的產生。由此我們認為Cyr61作為機體抵抗纖維化的防御性蛋白，其表達增多是機體的一種代償機制。

有研究稱腎缺血損害后3～6 h Cyr61便可在近端腎小管直部誘導生成，并于6～9 h達峰后降低[15]。趙麗君等[13]的研究顯示，在腎損傷早期MMP-3的表達量同Cyr61一樣也呈現出先增高后逐漸降低的趨勢。推測MMP-3的早期升高可能與Cyr61的誘導作用相關。然而在本次實驗中我們發現MMP-3與Cyr61的表達水平是相悖的，這說明Cyr61在腎損傷的末期對于MMP-3的促生成作用是不足的。同時由于Cyr61對MMP3及其活性抑制劑TIMP1均具有上調表達的作用，且在腎損傷末期TIMP仍能大量表達[14]，導致MMP-3的降解活性下降ECM積聚，進一步削弱了Cyr61的抗纖維化作用。

腎損傷早期Cyr61雖通過誘導MMP-3的生成發揮抗纖維化作用，但其代償能力有限，在腎損傷末期誘導作用減弱，防護能力下降。ECM合成和降解失衡是腎間質纖維化發生與發展的重要機制之一。研究腎間質損傷中的信號轉導，對認識疾病的本質，為疾病的治療和基因靶向干預提供了依據。

[參考文獻]

[1] Merkle M，Ribeiro A，K？觟ppel S，et al. TNFα enhances TLR3-dependent effects on MMP-9 expression in human mesangial cells[J]. Cell Biology International，2012，36（12）：1155-1160.

[2] 李東，周新，鄭方，等. Cyr61的研究進展[J]. 國際檢驗醫學雜志，2005，26（7）：424-426.

[3] 田壽福，王筱霞，汪年松. CCN1與腎臟疾病的研究進展[J]. 中國中西醫結合腎病雜志，2011，12（9）：831-833.

[4] Yang，Lau. Cyr61，product of a growth factor-inducible immediate early gene， is associated with the extracellular matrix and the cell surface[J]. Cell Growth & Differentiation the Molecular Biology Journal of the American Association for Cancer Research，1991，2（7）：351-357.

[5] 徐巖. 缺血性急性腎損傷患者體液Cyr61定量檢測及其機制研究[D]. 第二軍醫大學，2008.

[6] 閆訓友，薛沖，劉志敏，等. 基質金屬蛋白酶及其組織抑制劑研究進展[J]. 生物技術通訊，2004，15（3）：302-305.

[7] 郭曉沖，李如波，梁紅霞，等. 基質金屬蛋白酶3研究進展及其法醫學意義[J]. 中國法醫學雜志，2008，23（3）：184-186.

[8] Liu R，Lioté F，Rose DM，et al. Proline-rich tyrosine kinase 2 and Src kinase signaling transduce monosodium urate crystal-induced nitric oxide production and matrix metalloproteinase 3 expression in chondrocytes[J]. Arthritis & Rheumatism，2004，50（1）：247.

[9] 黃志芳，朱妙珍，何婭妮，等. ET-1、MMP-3、TIMP-1在人腎小球中的表達及意義[J]. 第三軍醫大學學報，2003， 25（11）：1009-1012.

[10] 張承彥. CCN家族在纖維化中的研究進展[J]. 基礎醫學與臨床，2014，34（3）：410-413.

[11] Chen CC，Chen N，Lau LF. The angiogenic factors Cyr61 and connective tissue growth factor induce adhesive signaling in primary human skin fibroblasts[J]. Journal of Biological Chemistry，2001，276（13）：10443-10452.

[12] Chen CC，Lau LF. Functions and mechanisms of action of CCN matricellular proteins[J]. International Journal of Biochemistry & Cell Biology，2009，41（4）：771.

[13] 趙麗君，崔建軍，李秀花. MMP-3和TIMP-2在UUO大鼠腎間質的表達[J]. 中國中西醫結合腎病雜志，2013， 14（3）：212-214.

[14] 付平，馮梅，張翥，等. 苦參堿對腎小管間質MMP-3和TIMP-1的影響[J]. 中國中西醫結合腎病雜志，2006，7（2）：1-2.

[15] Muramatsu Y，Tsujie M，Kohda Y，et al. Early detection of cysteine rich protein 61（CYR61，CCN1）in urine following renal ischemic reperfusion injury[J]. Kidney International，2002，62（5）：1601-1610.

（收稿日期：2017-04-16）