利拉魯肽對(duì)缺氧和高糖所致心肌細(xì)胞鈣超載和細(xì)胞凋亡的影響

李銀科，史瓊枝，陳 晨，廖翔茹，謝向陽(yáng)

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利拉魯肽對(duì)缺氧和高糖所致心肌細(xì)胞鈣超載和細(xì)胞凋亡的影響

李銀科，史瓊枝，陳 晨，廖翔茹，謝向陽(yáng)

目的 研究利拉魯肽對(duì)缺氧和高糖所致心肌細(xì)胞鈣超載和細(xì)胞凋亡的影響。方法 采用原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞，建立缺氧和高糖模型。實(shí)驗(yàn)分為：正常對(duì)照組、利拉魯肽對(duì)照組、缺氧和高糖模型組、利拉魯肽處理組、胰高血糖素樣肽-1 (glucagon like peptide-1, GLP-1)受體抑制劑組、高滲對(duì)照組6組。采用熒光分光光度法檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子變化，化學(xué)熒光法檢測(cè)活性氧族(reactive oxygen species, ROS)水平、利用生化方法檢測(cè)Ca2+-ATP 和Na+-K+-ATP酶活性、RT-PCR技術(shù)檢測(cè)鈣敏感的鈣蛋白酶(μ-calpain)基因表達(dá)、流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率、ELISA法檢測(cè)細(xì)胞caspase-3活性。結(jié)果 與正常對(duì)照組相比，缺氧高糖模型組細(xì)胞內(nèi)ROS水平、μ-calpain mRNA表達(dá)量、caspase-3活性均顯著升高(P<0.01)；Ca2+-ATP 和Na+-K+-ATP酶活性顯著降低(P<0.01)；游離鈣離子濃度由(117.19±15.04)nmol/L增加至(508.53±26.11)nmol/L，細(xì)胞凋亡率由(3.95±0.12)%增加至(31.03±4.30)%(P<0.01)。利拉魯肽處理組細(xì)胞較缺氧高糖模型組上述參數(shù)均明顯改善，游離鈣離子濃度和細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.01)；GLP-1R抑制劑exendin(9-39)可拮抗利拉魯肽的上述作用(P<0.05)。結(jié)論 利拉魯肽可明顯抑制缺氧和高糖所致心肌細(xì)胞鈣超載及μ-calpain基因的上調(diào)，降低caspase-3水平，減少心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。

利拉魯肽；心肌細(xì)胞；缺氧；高糖；鈣超載；凋亡

糖尿病是心血管疾病最常見(jiàn)的易患因素之一，同時(shí)也是心肌梗死的獨(dú)立高危因素[1]，對(duì)心血管疾病的治療及預(yù)后產(chǎn)生重要的影響。高糖和缺氧也是臨床常見(jiàn)的心肌損傷因素，高糖導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡和心肌纖維化[2]，缺氧導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死[3]，最終都造成心肌細(xì)胞數(shù)量減少，心肌收縮力減弱，對(duì)心臟功能造成不可逆損傷。已有證據(jù)表明，心血管并發(fā)癥在糖尿病人群的致死率是非糖尿病人群的3～5倍[4]，缺血性心臟病在糖尿病人群的發(fā)病率是非糖尿病人群的2倍[5]。利拉魯肽是胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)的類似物，目前主要應(yīng)用于2型糖尿病的治療。最新的研究發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽在發(fā)揮降糖作用的同時(shí)還具有一定的心肌保護(hù)作用[6]，但對(duì)其藥理作用機(jī)制的研究尚不完善。本研究采用體外培養(yǎng)高糖孵育的乳鼠心肌細(xì)胞經(jīng)缺氧處理，模擬糖尿病心肌細(xì)胞缺血損傷病理過(guò)程，從抑制鈣超載和心肌細(xì)胞凋亡的角度，探討利拉魯肽對(duì)缺氧和高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試藥和儀器 利拉魯肽注射液(Novo Nordisk公司，丹麥)，二甲基亞砜( DMSO)(Amresco 公司，美國(guó))，DMEM/F-12培養(yǎng)液、胎牛血清(Gibco公司，美國(guó))，5-溴-2-脫氧尿嘧啶(Brdu)、TritonX-100、胰蛋白酶、exendin-4(9-39)(Sigma公司，美國(guó))，F(xiàn)ura-2/AM(Biotium公司，美國(guó))，D-葡萄糖(天津市福晨化學(xué)試劑廠)，ROS檢測(cè)試劑盒、Ca2+-ATP 酶、Na+-K+-ATP酶測(cè)定試劑盒、考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程研究所)，Annexin-V-FLUOS Staining KIT(BD公司，美國(guó))，caspase-3 ELISA檢測(cè)試劑盒(R&D公司，美國(guó))，μ-calpain引物(Takara公司)二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific公司，美國(guó))，醫(yī)用型超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1F，蘇州)，倒置相差顯微鏡(CK-40，日本Olympus)，數(shù)字式測(cè)氧儀(CYS-1型，北京)，酶標(biāo)儀(BIO-RAD，美國(guó))，熒光分光光度計(jì)(RF-5301PC，日本島津)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新生1～3 d的SD乳鼠，雌雄不限，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SCXK-(軍)2012-004。

1.3 方法

1.3.1 乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng) 新生l～3 d的SD乳鼠用75%乙醇消毒后，取出心臟置于預(yù)冷的D-Hanks液中，將心室肌剪成約1 mm3大小組織塊，加入0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)，于37 ℃消化并離心收集心肌細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)液和Brdu(終濃度0.1 mmol/L)接種于25 ml培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)4 d后采用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞存活率[7]。

1.3.2 心肌細(xì)胞缺氧高糖模型的建立 取培養(yǎng)4 d的心肌細(xì)胞，換用無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h后，換用含30 mmol/L葡萄糖的DMEM/F-12培養(yǎng)液(預(yù)先充入95%N2+5%CO2混合氣飽和30 min)，替代正常培養(yǎng)液，而后迅速將培養(yǎng)板移入通有95%N2+5%CO2混合氣的缺氧裝置中，維持氧濃度<1%，37 ℃缺氧培養(yǎng)3 h后進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)[8]。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為6組：(1)正常對(duì)照組：不加任何干預(yù)；(2)利拉魯肽對(duì)照組：正常細(xì)胞培養(yǎng)液中加入利拉魯肽25 nmol/L；(3)缺氧高糖模型組：細(xì)胞按“1.3.2”項(xiàng)下方法建立缺氧和高糖模型；(4)利拉魯肽處理組：高糖培養(yǎng)液中加入25 nmol/L的利拉魯肽，再行缺氧過(guò)程；(5)GLP-1R抑制劑組：高糖培養(yǎng)液中加入利拉魯肽和exendin (9-39)，濃度均為25 nmol/L，再行缺氧過(guò)程；(6)高滲對(duì)照組：正常細(xì)胞培養(yǎng)液中加入濃度為24.5 mmol/L的甘露醇。

1.3.4 細(xì)胞內(nèi)ROS水平測(cè)定 心肌細(xì)胞按“1.3.3”項(xiàng)下分組處理3 h后，各組加入適量DCFH-DA(10 μmol/L)，37 ℃避光孵育30 min。收集細(xì)胞，于熒光分光光度計(jì)(激發(fā)波長(zhǎng)480 nm、發(fā)射波長(zhǎng)525 nm)下檢測(cè)各組熒光強(qiáng)度。

1.3.5 心肌細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i的測(cè)定 按Fura-2/AM 說(shuō)明書(shū)，將各組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后收集細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，加入溶于DMSO的Fura-2/AM(終濃度為1 μmol/L)。37 ℃恒溫振蕩30 min，負(fù)載后的細(xì)胞用Hanks液離心洗滌后，采用熒光分光光度計(jì)測(cè)定心肌細(xì)胞胞漿[Ca2+]i。

1.3.6 心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+-ATP 酶、Na+-K+-ATP酶活性測(cè)定 接種于24孔板的心肌細(xì)胞，按照“1.3.3”項(xiàng)下分組進(jìn)行處理3 h后，收集各組細(xì)胞，試劑盒測(cè)定心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+-ATP 酶、Na+-K+-ATP酶活性，實(shí)驗(yàn)操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.7 RT-PCR技術(shù)檢測(cè)鈣敏感的鈣蛋白酶(μ-calpain)基因表達(dá) 參照Trizol試劑盒的方法提取細(xì)胞總RNA。采用反轉(zhuǎn)錄酶和Oligo dT引物將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)。μ-calpain引物：上游：5′-GATGGAAAGCTGGTGTTCGT-3′，下游：5′-AGCTGCTCACGTTCATAGGG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為491 bp。β-actin引物上游：上游：5′-AAAGACCTCTATGCCAAC A-3′，下游：5′-TTGTCA AAGAAAGGGTGTAA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為301 bp。反應(yīng)條件：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；59 ℃，45 s；72 ℃，50 s；72 ℃，6 min；35個(gè)循環(huán)后轉(zhuǎn)為4 ℃保存。用凝膠成像分析系統(tǒng)測(cè)出各擴(kuò)增條帶的光密度值，以同一樣品目的基因擴(kuò)增帶的光密度與β-actin 擴(kuò)增帶的光密度比值計(jì)算出RT-PCR產(chǎn)物的相對(duì)含量。

1.3.8 細(xì)胞凋亡指數(shù)的測(cè)定 按照Annexin-V-FLUOS Staining KIT使用說(shuō)明進(jìn)行操作，用流式細(xì)胞儀測(cè)定各組細(xì)胞凋亡率。

1.3.9 ELISA 法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清中caspase-3活性 細(xì)胞按照“1.3.3”項(xiàng)下分組進(jìn)行處理3 h后，試劑盒測(cè)定心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清中caspase-3活性，實(shí)驗(yàn)操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。在酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定OD值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算各樣品的caspase-3水平。

2 結(jié) 果

2.1 新生大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)觀察及存活率檢測(cè) 心肌細(xì)胞貼壁3～4 h后，細(xì)胞由圓形變?yōu)椴灰?guī)則狀，約24 h可見(jiàn)心肌細(xì)胞自律搏動(dòng)，48 h細(xì)胞呈現(xiàn)為多角形或梭形，3 d后大部分細(xì)胞相互連接，聚集成簇。臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果顯示，細(xì)胞成活率為(95±1.02)%，能夠滿足下一步實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 利拉魯肽對(duì)缺氧和高糖狀態(tài)下心肌細(xì)胞的影響

2.2.1 對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧族(ROS)和游離鈣離子濃度([Ca2+]i)的影響 與正常對(duì)照組相比，缺氧高糖模型組細(xì)胞內(nèi)ROS水平和[Ca2+]i顯著升高(P<0.01)，利拉魯肽對(duì)照組和高滲對(duì)照組無(wú)顯著變化(P>0.05)，提示缺氧和高糖狀態(tài)導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載；與缺氧高糖模型組相比，利拉魯肽處理組細(xì)胞內(nèi)ROS水平和[Ca2+]i顯著降低(P<0.01)；與利拉魯肽處理組相比，GLP-1R抑制劑組細(xì)胞內(nèi)ROS水平和[Ca2+]i升高 (P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.2.2 對(duì)心肌細(xì)胞Ca2+-ATP、Na+-K+-ATP酶活性的影響 與正常對(duì)照組相比，缺氧高糖模型組細(xì)胞內(nèi)Ca2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性顯著降低(P<0.01)，利拉魯肽對(duì)照組和高滲對(duì)照組細(xì)胞無(wú)明顯變化(P>0.05)；與缺氧高糖模型組相比，利拉魯肽處理組細(xì)胞內(nèi)Ca2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性顯著增加(P<0.01)；與利拉魯肽處理組相比，GLP-1R抑制劑組細(xì)胞內(nèi)Ca2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 利拉魯肽對(duì)缺氧高糖狀態(tài)下心肌細(xì)胞ROS和[Ca2+]i的影響 (n=6；±s)

注：與正常對(duì)照組比較，①P<0.01；與缺氧高糖模型組比較，②P<0.01；與利拉魯肽處理組比較，③P<0.05

2.2.3 對(duì)心肌細(xì)胞μ-calpain mRNA表達(dá)的影響 與正常對(duì)照組相比，缺氧高糖模型組μ-calpain mRNA表達(dá)量顯著增加(P< 0.01)；與缺氧高糖模型組相比，利拉魯肽處理組μ-calpain mRNA表達(dá)量明顯降低 (P<0.01)；GLP-1R抑制劑exendin(9-39)能抑制利拉魯肽的上述作用(P< 0.05)；而利拉魯肽對(duì)照組、高滲對(duì)照組與正常對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05，圖1)。

2.2.4 對(duì)心肌細(xì)胞caspase-3活性和細(xì)胞凋亡率的影響 與正常對(duì)照組相比，缺氧高糖模型組細(xì)胞caspase-3活性及凋亡率顯著升高(P<0.01)，利拉魯肽對(duì)照組和高滲對(duì)照組細(xì)胞無(wú)明顯變化(P>0.05)；與缺氧高糖模型組相比，利拉魯肽處理組細(xì)胞caspase-3活性及凋亡率顯著降低(P<0.01)；與利拉魯肽處理組相比，GLP-1R抑制劑組細(xì)胞caspase-3活性及凋亡率升高(P<0.05，表2)。

圖1 利拉魯肽對(duì)缺氧和高糖狀態(tài)下心肌細(xì)胞 μ-calpain mRNA表達(dá)的影響(n=3；

A.電泳圖；B.數(shù)據(jù)圖。1.正常對(duì)照組；2.缺氧高糖模型組；3.利拉魯肽對(duì)照組；4.利拉魯肽處理組；5.GLP-1R抑制劑組；6.高滲對(duì)照組。與正常對(duì)照組比較，①P<0.01；與缺氧高糖模型組比較，②P<0.01；與利拉魯肽處理組比較，③P<0.05

表2 利拉魯肽對(duì)缺氧高糖狀態(tài)下心肌細(xì)胞 caspase-3活性和凋亡率的影響 (n=6；

注：與正常對(duì)照組比較，①P<0.01；與缺氧高糖模型組比較，②P<0.01；與利拉魯肽處理組比較，③P<0.05

3 討 論

在糖尿病患者中，高糖和缺氧是臨床常見(jiàn)的心肌損傷因素，心肌缺血等心血管疾病導(dǎo)致的死亡占糖尿病患者死亡的50%以上[9]。因此，本實(shí)驗(yàn)?zāi)M糖尿病病變過(guò)程中心肌細(xì)胞的缺氧和高糖狀態(tài)，采用原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞作為干預(yù)的靶點(diǎn)，對(duì)預(yù)防和延緩糖尿病心肌病具有指導(dǎo)意義。

在高血糖狀態(tài)下，缺氧和細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的葡萄糖可通過(guò)多種通路致使細(xì)胞損傷[10,11]，這些代謝通路均可產(chǎn)生活性氧，大量氧自由基可使細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，使細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，引起細(xì)胞外鈣離子大量?jī)?nèi)流；并導(dǎo)致膜上Na+-K+-ATP酶失活，鈉鈣交換增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高[12]，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載。鈣離子是胞漿內(nèi)重要的第二信使，是多條信號(hào)傳導(dǎo)通路的共同交匯點(diǎn)，在多途徑信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起中心調(diào)節(jié)作用。細(xì)胞內(nèi)鈣超載，會(huì)使細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)異常，進(jìn)一步導(dǎo)致物質(zhì)代謝和能量代謝障礙[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧和高糖的雙重刺激作用下，缺氧高糖模型組細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著增加，鈣離子濃度急劇升高，Ca2+-ATP和Na+-K+-ATP酶活性顯著降低，提示心肌細(xì)胞在缺氧和高糖雙重刺激下處于鈣超載狀態(tài)。利拉魯肽是一種長(zhǎng)效的GLP-1類似物。近年來(lái)，多項(xiàng)基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)證實(shí)，利拉魯肽對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，可縮小心肌梗死范圍，提高小鼠冠狀動(dòng)脈阻塞后存活率[13]。本實(shí)驗(yàn)觀察到利拉魯肽可抑制缺氧和高糖刺激下心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平和鈣超載，對(duì)心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。

鈣敏感的鈣蛋白酶(calpain)屬于半胱氨酸蛋白水解酶超家族成員，是一種特殊的蛋白水解酶，其中研究最廣泛的是calpain-1(μ-calpain)，在細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子高水平時(shí)被激活。μ-Calpain的激活可引起心肌細(xì)胞凋亡效應(yīng)分子(caspase-3，9，12)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[14]；μ-calpain激活caspase-3，活化的caspase-3水解鈣蛋白酶抑制蛋白(calpastatin)，使calpain活性增加，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[15]。Carpi等[16]報(bào)道心肌細(xì)胞鈣超載時(shí)，線粒體膜電位降低的同時(shí)伴隨著calpain活性的上調(diào)。在半胱氨酸蛋白酶介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程中，caspase-3是凋亡途徑下游中進(jìn)行底物酶解的關(guān)鍵蛋白酶，是凋亡的效應(yīng)分子和執(zhí)行者[17]。有研究指出，在缺血心肌組織內(nèi)caspase-3高度表達(dá)，而降低caspase-3活性的干預(yù)均可減輕心肌細(xì)胞的凋亡程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，利拉魯肽可通過(guò)抑制心肌細(xì)胞μ-calpain基因的表達(dá)，降低caspase-3水平，降低細(xì)胞凋亡率。而GLP-1R抑制劑exendin(9-39)可拮抗利拉魯肽的上述作用，由于利拉魯肽通過(guò)與廣泛分布于全身多個(gè)器官和組織的GLP-1R結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，提示利拉魯肽抑制心肌細(xì)胞鈣超載和凋亡的機(jī)制可能與GLP-1R通路相關(guān)。

綜上所述，利拉魯肽能夠降低缺氧和高糖所致的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，抑制鈣超載和μ-calpain基因的上調(diào)，降低caspase-3水平和細(xì)胞凋亡率，從而對(duì)心肌細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。

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(2016-11-08收稿 2017-04-15修回)

(責(zé)任編輯 梁秋野)

Effects and possible mechanism of liraglutide on hypoxia and high glucose-induced calcium overload and apoptosis in neonatal rat cardiomyocytes in vitro

LI Yinke, SHI Qiongzhi, CHEN Chen, LIAO Xiangru, and XIE Xiangyang.

Department of Pharmacy, Wuhan General Hospital of the Chinese People’s Liberation Army, Wuhan 430070, China

Objective To investigate the effect and possible mechanism of liraglutide on hypoxia and high glucose-induced calcium overload and apoptosis in neonatal rat cardiomyocytes in vitro.Methods A model of hypoxia and high glucose was established using primarily cultured neonatal rat cardiomyocytes. Then, cells were divided into six groups: normal control group, liraglutide control group, hypoxia and high glucose model group, liraglutide treatment group, GLP-1R antagonist group, and high osmolality control group. The concentration of intracellular dissociative calcium in myocardial cells was determined with fluorospectrophotometry. The levels of Ca2+-ATPase, Na+-K+-ATPase and ROS were measured with biochemical approaches. The apoptosis rate was observed by a flow cytometer. The level of μ-calpain mRNA was examined with RT-PCR method. The level of caspase-3 was measured with ELISA.Results Compared with normal control group, the levels of expression of ROS, caspase-3, and μ-calpain mRNA were significantly increased in hypoxia and high glucose model group (P<0.01), the activity of Ca2+-ATPase and Na+-K+-ATPase decreased (P<0.01), the concentration of free Ca2+increased from 117.19±15.04 nmol/L to 508.53±26.11 nmol/L, and the apoptosis rate increased from (3.95±0.12)% to (31.03±4.30)%. Liraglutide improved the parameters mentioned above (P<0.01). However, exendin(9-39), an antagonist of GLP-1R, attenuated the protective effect of liraglutide under hypoxia and high glucose.Conclusions Liraglutide can obviously inhibit calcium influx of myocardial cells and μ-calpain up-regulation, and decrease the level of caspase-3 and cell apoptosis.

liraglutide; cardiomyocyte; hypoxia; high glucose; calcium overload; apoptosis

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湖北省知識(shí)創(chuàng)新專項(xiàng)(自然科學(xué)基金)(2016CFB198)，湖北省衛(wèi)計(jì)委科研基金(WJ2017Q031)

李銀科，碩士，主管藥師。

430070，解放軍武漢總醫(yī)院藥劑科

謝向陽(yáng)，E-mail：xxy5727035@163.com

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