利拉魯肽對缺氧和高糖所致心肌細胞鈣超載和細胞凋亡的影響

李銀科，史瓊枝，陳 晨，廖翔茹，謝向陽

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利拉魯肽對缺氧和高糖所致心肌細胞鈣超載和細胞凋亡的影響

李銀科，史瓊枝，陳 晨，廖翔茹，謝向陽

目的 研究利拉魯肽對缺氧和高糖所致心肌細胞鈣超載和細胞凋亡的影響。方法 采用原代培養的乳鼠心肌細胞，建立缺氧和高糖模型。實驗分為：正常對照組、利拉魯肽對照組、缺氧和高糖模型組、利拉魯肽處理組、胰高血糖素樣肽-1 (glucagon like peptide-1, GLP-1)受體抑制劑組、高滲對照組6組。采用熒光分光光度法檢測心肌細胞內鈣離子變化，化學熒光法檢測活性氧族(reactive oxygen species, ROS)水平、利用生化方法檢測Ca2+-ATP 和Na+-K+-ATP酶活性、RT-PCR技術檢測鈣敏感的鈣蛋白酶(μ-calpain)基因表達、流式細胞儀測定細胞凋亡率、ELISA法檢測細胞caspase-3活性。結果 與正常對照組相比，缺氧高糖模型組細胞內ROS水平、μ-calpain mRNA表達量、caspase-3活性均顯著升高(P<0.01)；Ca2+-ATP 和Na+-K+-ATP酶活性顯著降低(P<0.01)；游離鈣離子濃度由(117.19±15.04)nmol/L增加至(508.53±26.11)nmol/L，細胞凋亡率由(3.95±0.12)%增加至(31.03±4.30)%(P<0.01)。利拉魯肽處理組細胞較缺氧高糖模型組上述參數均明顯改善，游離鈣離子濃度和細胞凋亡率顯著降低(P<0.01)；GLP-1R抑制劑exendin(9-39)可拮抗利拉魯肽的上述作用(P<0.05)。結論 利拉魯肽可明顯抑制缺氧和高糖所致心肌細胞鈣超載及μ-calpain基因的上調，降低caspase-3水平，減少心肌細胞凋亡，對心肌細胞具有保護作用。

利拉魯肽；心肌細胞；缺氧；高糖；鈣超載；凋亡

糖尿病是心血管疾病最常見的易患因素之一，同時也是心肌梗死的獨立高危因素[1]，對心血管疾病的治療及預后產生重要的影響。高糖和缺氧也是臨床常見的心肌損傷因素，高糖導致心肌細胞凋亡和心肌纖維化[2]，缺氧導致心肌細胞壞死[3]，最終都造成心肌細胞數量減少，心肌收縮力減弱，對心臟功能造成不可逆損傷。已有證據表明，心血管并發癥在糖尿病人群的致死率是非糖尿病人群的3～5倍[4]，缺血性心臟病在糖尿病人群的發病率是非糖尿病人群的2倍[5]。利拉魯肽是胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)的類似物，目前主要應用于2型糖尿病的治療。最新的研究發現，利拉魯肽在發揮降糖作用的同時還具有一定的心肌保護作用[6]，但對其藥理作用機制的研究尚不完善。本研究采用體外培養高糖孵育的乳鼠心肌細胞經缺氧處理，模擬糖尿病心肌細胞缺血損傷病理過程，從抑制鈣超載和心肌細胞凋亡的角度，探討利拉魯肽對缺氧和高糖誘導的心肌細胞損傷的保護作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 試藥和儀器 利拉魯肽注射液(Novo Nordisk公司，丹麥)，二甲基亞砜( DMSO)(Amresco 公司，美國)，DMEM/F-12培養液、胎牛血清(Gibco公司，美國)，5-溴-2-脫氧尿嘧啶(Brdu)、TritonX-100、胰蛋白酶、exendin-4(9-39)(Sigma公司，美國)，Fura-2/AM(Biotium公司，美國)，D-葡萄糖(天津市福晨化學試劑廠)，ROS檢測試劑盒、Ca2+-ATP 酶、Na+-K+-ATP酶測定試劑盒、考馬斯亮藍蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程研究所)，Annexin-V-FLUOS Staining KIT(BD公司，美國)，caspase-3 ELISA檢測試劑盒(R&D公司，美國)，μ-calpain引物(Takara公司)二氧化碳培養箱(Thermo Fisher Scientific公司，美國)，醫用型超凈工作臺(SW-CJ-1F，蘇州)，倒置相差顯微鏡(CK-40，日本Olympus)，數字式測氧儀(CYS-1型，北京)，酶標儀(BIO-RAD，美國)，熒光分光光度計(RF-5301PC，日本島津)。

1.2 實驗動物 新生1～3 d的SD乳鼠，雌雄不限，由軍事醫學科學院動物實驗中心提供，許可證號：SCXK-(軍)2012-004。

1.3 方法

1.3.1 乳鼠心肌細胞原代培養 新生l～3 d的SD乳鼠用75%乙醇消毒后，取出心臟置于預冷的D-Hanks液中，將心室肌剪成約1 mm3大小組織塊，加入0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)，于37 ℃消化并離心收集心肌細胞，加入含10%胎牛血清的DMEM/F-12培養液和Brdu(終濃度0.1 mmol/L)接種于25 ml培養瓶中，培養4 d后采用臺盼藍染色法檢測細胞存活率[7]。

1.3.2 心肌細胞缺氧高糖模型的建立 取培養4 d的心肌細胞，換用無血清培養液培養12 h后，換用含30 mmol/L葡萄糖的DMEM/F-12培養液(預先充入95%N2+5%CO2混合氣飽和30 min)，替代正常培養液，而后迅速將培養板移入通有95%N2+5%CO2混合氣的缺氧裝置中，維持氧濃度<1%，37 ℃缺氧培養3 h后進行各項指標的檢測[8]。

1.3.3 實驗分組 實驗分為6組：(1)正常對照組：不加任何干預；(2)利拉魯肽對照組：正常細胞培養液中加入利拉魯肽25 nmol/L；(3)缺氧高糖模型組：細胞按“1.3.2”項下方法建立缺氧和高糖模型；(4)利拉魯肽處理組：高糖培養液中加入25 nmol/L的利拉魯肽，再行缺氧過程；(5)GLP-1R抑制劑組：高糖培養液中加入利拉魯肽和exendin (9-39)，濃度均為25 nmol/L，再行缺氧過程；(6)高滲對照組：正常細胞培養液中加入濃度為24.5 mmol/L的甘露醇。

1.3.4 細胞內ROS水平測定 心肌細胞按“1.3.3”項下分組處理3 h后，各組加入適量DCFH-DA(10 μmol/L)，37 ℃避光孵育30 min。收集細胞，于熒光分光光度計(激發波長480 nm、發射波長525 nm)下檢測各組熒光強度。

1.3.5 心肌細胞內[Ca2+]i的測定 按Fura-2/AM 說明書，將各組細胞經胰酶消化后收集細胞，制備細胞懸液，加入溶于DMSO的Fura-2/AM(終濃度為1 μmol/L)。37 ℃恒溫振蕩30 min，負載后的細胞用Hanks液離心洗滌后，采用熒光分光光度計測定心肌細胞胞漿[Ca2+]i。

1.3.6 心肌細胞內Ca2+-ATP 酶、Na+-K+-ATP酶活性測定 接種于24孔板的心肌細胞，按照“1.3.3”項下分組進行處理3 h后，收集各組細胞，試劑盒測定心肌細胞內Ca2+-ATP 酶、Na+-K+-ATP酶活性，實驗操作按試劑盒說明書進行。

1.3.7 RT-PCR技術檢測鈣敏感的鈣蛋白酶(μ-calpain)基因表達 參照Trizol試劑盒的方法提取細胞總RNA。采用反轉錄酶和Oligo dT引物將總RNA反轉錄為cDNA，進行PCR反應。μ-calpain引物：上游：5′-GATGGAAAGCTGGTGTTCGT-3′，下游：5′-AGCTGCTCACGTTCATAGGG-3′，擴增產物長度為491 bp。β-actin引物上游：上游：5′-AAAGACCTCTATGCCAAC A-3′，下游：5′-TTGTCA AAGAAAGGGTGTAA-3′，擴增產物長度為301 bp。反應條件：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；59 ℃，45 s；72 ℃，50 s；72 ℃，6 min；35個循環后轉為4 ℃保存。用凝膠成像分析系統測出各擴增條帶的光密度值，以同一樣品目的基因擴增帶的光密度與β-actin 擴增帶的光密度比值計算出RT-PCR產物的相對含量。

1.3.8 細胞凋亡指數的測定 按照Annexin-V-FLUOS Staining KIT使用說明進行操作，用流式細胞儀測定各組細胞凋亡率。

1.3.9 ELISA 法測定細胞培養上清中caspase-3活性 細胞按照“1.3.3”項下分組進行處理3 h后，試劑盒測定心肌細胞培養上清中caspase-3活性，實驗操作按試劑盒說明書進行。在酶標儀450 nm處測定OD值，依據標準方程計算各樣品的caspase-3水平。

2 結 果

2.1 新生大鼠心肌細胞形態觀察及存活率檢測 心肌細胞貼壁3～4 h后，細胞由圓形變為不規則狀，約24 h可見心肌細胞自律搏動，48 h細胞呈現為多角形或梭形，3 d后大部分細胞相互連接，聚集成簇。臺盼藍染色結果顯示，細胞成活率為(95±1.02)%，能夠滿足下一步實驗要求。

2.2 利拉魯肽對缺氧和高糖狀態下心肌細胞的影響

2.2.1 對心肌細胞內活性氧族(ROS)和游離鈣離子濃度([Ca2+]i)的影響 與正常對照組相比，缺氧高糖模型組細胞內ROS水平和[Ca2+]i顯著升高(P<0.01)，利拉魯肽對照組和高滲對照組無顯著變化(P>0.05)，提示缺氧和高糖狀態導致心肌細胞內鈣超載；與缺氧高糖模型組相比，利拉魯肽處理組細胞內ROS水平和[Ca2+]i顯著降低(P<0.01)；與利拉魯肽處理組相比，GLP-1R抑制劑組細胞內ROS水平和[Ca2+]i升高 (P<0.01)。見表1。

2.2.2 對心肌細胞Ca2+-ATP、Na+-K+-ATP酶活性的影響 與正常對照組相比，缺氧高糖模型組細胞內Ca2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性顯著降低(P<0.01)，利拉魯肽對照組和高滲對照組細胞無明顯變化(P>0.05)；與缺氧高糖模型組相比，利拉魯肽處理組細胞內Ca2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性顯著增加(P<0.01)；與利拉魯肽處理組相比，GLP-1R抑制劑組細胞內Ca2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性降低(P<0.05)。見表1。

表1 利拉魯肽對缺氧高糖狀態下心肌細胞ROS和[Ca2+]i的影響 (n=6；±s)

注：與正常對照組比較，①P<0.01；與缺氧高糖模型組比較，②P<0.01；與利拉魯肽處理組比較，③P<0.05

2.2.3 對心肌細胞μ-calpain mRNA表達的影響 與正常對照組相比，缺氧高糖模型組μ-calpain mRNA表達量顯著增加(P< 0.01)；與缺氧高糖模型組相比，利拉魯肽處理組μ-calpain mRNA表達量明顯降低 (P<0.01)；GLP-1R抑制劑exendin(9-39)能抑制利拉魯肽的上述作用(P< 0.05)；而利拉魯肽對照組、高滲對照組與正常對照組相比差異無統計學意義 (P>0.05，圖1)。

2.2.4 對心肌細胞caspase-3活性和細胞凋亡率的影響 與正常對照組相比，缺氧高糖模型組細胞caspase-3活性及凋亡率顯著升高(P<0.01)，利拉魯肽對照組和高滲對照組細胞無明顯變化(P>0.05)；與缺氧高糖模型組相比，利拉魯肽處理組細胞caspase-3活性及凋亡率顯著降低(P<0.01)；與利拉魯肽處理組相比，GLP-1R抑制劑組細胞caspase-3活性及凋亡率升高(P<0.05，表2)。

圖1 利拉魯肽對缺氧和高糖狀態下心肌細胞 μ-calpain mRNA表達的影響(n=3；

A.電泳圖；B.數據圖。1.正常對照組；2.缺氧高糖模型組；3.利拉魯肽對照組；4.利拉魯肽處理組；5.GLP-1R抑制劑組；6.高滲對照組。與正常對照組比較，①P<0.01；與缺氧高糖模型組比較，②P<0.01；與利拉魯肽處理組比較，③P<0.05

表2 利拉魯肽對缺氧高糖狀態下心肌細胞 caspase-3活性和凋亡率的影響 (n=6；

注：與正常對照組比較，①P<0.01；與缺氧高糖模型組比較，②P<0.01；與利拉魯肽處理組比較，③P<0.05

3 討 論

在糖尿病患者中，高糖和缺氧是臨床常見的心肌損傷因素，心肌缺血等心血管疾病導致的死亡占糖尿病患者死亡的50%以上[9]。因此，本實驗模擬糖尿病病變過程中心肌細胞的缺氧和高糖狀態，采用原代培養的心肌細胞作為干預的靶點，對預防和延緩糖尿病心肌病具有指導意義。

在高血糖狀態下，缺氧和細胞內過多的葡萄糖可通過多種通路致使細胞損傷[10,11]，這些代謝通路均可產生活性氧，大量氧自由基可使細胞膜脂質過氧化，使細胞膜通透性增強，引起細胞外鈣離子大量內流；并導致膜上Na+-K+-ATP酶失活，鈉鈣交換增強，細胞內鈣離子升高[12]，導致細胞內鈣超載。鈣離子是胞漿內重要的第二信使，是多條信號傳導通路的共同交匯點，在多途徑信號轉導中起中心調節作用。細胞內鈣超載，會使細胞信號傳導異常，進一步導致物質代謝和能量代謝障礙[11]。本研究發現，在缺氧和高糖的雙重刺激作用下，缺氧高糖模型組細胞內ROS水平顯著增加，鈣離子濃度急劇升高，Ca2+-ATP和Na+-K+-ATP酶活性顯著降低，提示心肌細胞在缺氧和高糖雙重刺激下處于鈣超載狀態。利拉魯肽是一種長效的GLP-1類似物。近年來，多項基礎研究和臨床試驗證實，利拉魯肽對大鼠心肌缺血再灌注損傷有保護作用，可縮小心肌梗死范圍，提高小鼠冠狀動脈阻塞后存活率[13]。本實驗觀察到利拉魯肽可抑制缺氧和高糖刺激下心肌細胞氧化應激水平和鈣超載，對心肌細胞具有保護作用。

鈣敏感的鈣蛋白酶(calpain)屬于半胱氨酸蛋白水解酶超家族成員，是一種特殊的蛋白水解酶，其中研究最廣泛的是calpain-1(μ-calpain)，在細胞內游離鈣離子高水平時被激活。μ-Calpain的激活可引起心肌細胞凋亡效應分子(caspase-3，9，12)的級聯反應，導致細胞凋亡的發生[14]；μ-calpain激活caspase-3，活化的caspase-3水解鈣蛋白酶抑制蛋白(calpastatin)，使calpain活性增加，促進細胞的凋亡[15]。Carpi等[16]報道心肌細胞鈣超載時，線粒體膜電位降低的同時伴隨著calpain活性的上調。在半胱氨酸蛋白酶介導的細胞凋亡過程中，caspase-3是凋亡途徑下游中進行底物酶解的關鍵蛋白酶，是凋亡的效應分子和執行者[17]。有研究指出，在缺血心肌組織內caspase-3高度表達，而降低caspase-3活性的干預均可減輕心肌細胞的凋亡程度。本實驗結果顯示，利拉魯肽可通過抑制心肌細胞μ-calpain基因的表達，降低caspase-3水平，降低細胞凋亡率。而GLP-1R抑制劑exendin(9-39)可拮抗利拉魯肽的上述作用，由于利拉魯肽通過與廣泛分布于全身多個器官和組織的GLP-1R結合而發揮生物學效應，提示利拉魯肽抑制心肌細胞鈣超載和凋亡的機制可能與GLP-1R通路相關。

綜上所述，利拉魯肽能夠降低缺氧和高糖所致的心肌細胞氧化應激水平，抑制鈣超載和μ-calpain基因的上調，降低caspase-3水平和細胞凋亡率，從而對心肌細胞發揮保護作用。

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(2016-11-08收稿 2017-04-15修回)

(責任編輯 梁秋野)

Effects and possible mechanism of liraglutide on hypoxia and high glucose-induced calcium overload and apoptosis in neonatal rat cardiomyocytes in vitro

LI Yinke, SHI Qiongzhi, CHEN Chen, LIAO Xiangru, and XIE Xiangyang.

Department of Pharmacy, Wuhan General Hospital of the Chinese People’s Liberation Army, Wuhan 430070, China

Objective To investigate the effect and possible mechanism of liraglutide on hypoxia and high glucose-induced calcium overload and apoptosis in neonatal rat cardiomyocytes in vitro.Methods A model of hypoxia and high glucose was established using primarily cultured neonatal rat cardiomyocytes. Then, cells were divided into six groups: normal control group, liraglutide control group, hypoxia and high glucose model group, liraglutide treatment group, GLP-1R antagonist group, and high osmolality control group. The concentration of intracellular dissociative calcium in myocardial cells was determined with fluorospectrophotometry. The levels of Ca2+-ATPase, Na+-K+-ATPase and ROS were measured with biochemical approaches. The apoptosis rate was observed by a flow cytometer. The level of μ-calpain mRNA was examined with RT-PCR method. The level of caspase-3 was measured with ELISA.Results Compared with normal control group, the levels of expression of ROS, caspase-3, and μ-calpain mRNA were significantly increased in hypoxia and high glucose model group (P<0.01), the activity of Ca2+-ATPase and Na+-K+-ATPase decreased (P<0.01), the concentration of free Ca2+increased from 117.19±15.04 nmol/L to 508.53±26.11 nmol/L, and the apoptosis rate increased from (3.95±0.12)% to (31.03±4.30)%. Liraglutide improved the parameters mentioned above (P<0.01). However, exendin(9-39), an antagonist of GLP-1R, attenuated the protective effect of liraglutide under hypoxia and high glucose.Conclusions Liraglutide can obviously inhibit calcium influx of myocardial cells and μ-calpain up-regulation, and decrease the level of caspase-3 and cell apoptosis.

liraglutide; cardiomyocyte; hypoxia; high glucose; calcium overload; apoptosis

醫學期刊常用字詞正誤對照表

湖北省知識創新專項(自然科學基金)(2016CFB198)，湖北省衛計委科研基金(WJ2017Q031)

李銀科，碩士，主管藥師。

430070，解放軍武漢總醫院藥劑科

謝向陽，E-mail：xxy5727035@163.com

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