豬偽狂犬病三種抗體檢測方法的比較

摘 要 為探索滿足豬偽狂犬病防治需要、準(zhǔn)確、實(shí)用的診斷方法，選用乳膠凝集試驗(yàn)、膠體金免疫層析技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)三種診斷方法，以求篩選出一種簡單、快捷、靈敏、特異的臨床檢測方法。結(jié)果表明：乳膠凝集試驗(yàn)具有敏感、簡便、快捷等優(yōu)點(diǎn)，但其特異性差和假陽性率較高；膠體金免疫試驗(yàn)的成本低廉，對設(shè)備的要求不高，但敏感性、特異性等均較差；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)從準(zhǔn)確性、靈敏性、特異性等方面都得到比較好的效果。

關(guān)鍵詞 豬偽狂犬?。蝗槟z凝集試驗(yàn)；膠體金免疫試驗(yàn)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)；抗體檢測

中圖分類號：S858.28 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2017.09.054

偽狂犬?。≒seudorabies）是一種由皰疹病毒科α皰疹病毒亞科豬皰疹病毒Ⅰ型引起的家畜和多種野生動(dòng)物的傳染病，豬是本病毒的儲藏者和傳染源。本病對豬造成的危害最嚴(yán)重，其特征為體溫升高、劇烈發(fā)癢和急性腦脊髓炎癥狀，并引發(fā)妊娠母豬流產(chǎn)，死胎以及胎兒出生后短期死亡，該病在豬群中具傳播快、死亡率高、流行范圍廣、傳播途徑多和病原體頑固等特點(diǎn)，每年都給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的損失[1]。為了有效預(yù)防和控制此病，減少經(jīng)濟(jì)損失，保證和促進(jìn)我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，需一種簡便、快捷、敏感性高和特異性強(qiáng)且便于使用的方法。

目前，在豬偽狂犬病診斷方面用得最多的是血清學(xué)方法，包括血清中和試驗(yàn)（SN）、乳膠凝集試驗(yàn)（LA）、瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（AGID）等[2]。通過從某些出現(xiàn)偽狂犬病的典型癥狀的種豬場采血，分離血清，運(yùn)用臨床上常用的乳膠凝集試驗(yàn)、膠體金免疫試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，現(xiàn)比較和分析3種方法的準(zhǔn)確性、敏感性。

1 材料及方法

1.1 材料

從廣東某三個(gè)大型豬場隨機(jī)抽樣采血，分離血清，編號（1～15），冷凍保存。

診斷試劑：豬偽狂犬病乳膠凝集試驗(yàn)診斷試劑盒、豬偽狂犬病抗體免疫金標(biāo)測試紙、豬偽狂犬病酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 豬偽狂犬病乳膠凝集試驗(yàn)

將疑似豬偽狂犬病的血清、標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清分別作1∶2稀釋，各取一滴（10～20 μL）依次加于乳膠凝集板上。各加乳膠抗原一滴，用牙簽混勻，攪拌并搖動(dòng)1～2 min，于3～5 min內(nèi)觀察結(jié)果。以出現(xiàn)“++”以上者判為陽性凝集。

1.2.2 豬偽狂犬病膠體金免疫試驗(yàn)

在檢測卡的加樣孔內(nèi)加入2滴50 μL待檢血清，將檢測卡平放在桌面上，在室溫下靜置15 min后判定結(jié)果。判斷標(biāo)準(zhǔn)：陽性，即在觀察孔內(nèi)，檢測線區(qū)（T）及對照線區(qū)（C）同時(shí)出現(xiàn)紫紅色線，豬偽狂犬病抗體越高，檢測線（T）的顏色越深；弱陽性，即在觀察孔內(nèi)，檢測線區(qū)（T）及對照線區(qū)（C）同時(shí)出現(xiàn)紫色線，但檢測線區(qū)（T）出現(xiàn)的色線顏色很淺；陰性，即在觀察孔內(nèi)，只有對照線區(qū)（C）出現(xiàn)一條紫色紅線；失效，在觀察孔內(nèi)，檢測線區(qū)（T）和對照線區(qū)（C）都不出現(xiàn)色線。

1.2.3 豬偽狂犬病酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

第一，取出酶標(biāo)板并記錄樣品在板上的位置。第二，在A1、A2、A3、A4、A5、A6孔內(nèi)各加未稀釋的陰性對照100μL。第三，加100μL已稀釋的樣品（1∶20）到相應(yīng)的孔內(nèi)，每一樣品做2個(gè)重復(fù)。第四，室溫作用30 min，洗滌3～5次，再在每一孔內(nèi)加入100 μL的酶標(biāo)抗體。第五，室溫作用30 min，在每一孔內(nèi)加入TMB底物溶液100μL。第六，室溫顯色15 min后，加入100 μL終止液以終止反應(yīng)。第七，在650 nm測量并記錄樣品和對照的吸收值。第八，結(jié)果判定：陽性對照的平均值（PCx）與陰性對照（NCx）的平均值之差（P-N）大于或等于0.15時(shí)試驗(yàn)成立，而且陰性對照平均值（NCx）必須大于或等于0.151。每一樣品內(nèi)針對PRV抗體的有無是由樣品與陽性對照的比率（S/P）來確定，比值小于0.4的樣品確認(rèn)為PRV抗體陰性，比值大于或等于0.4的樣品確認(rèn)為PRV抗體陽性。

2 結(jié)果

LA、IGFA、ELISA檢測結(jié)果見表1。試驗(yàn)表明，對15份樣品應(yīng)用LA、IGFA、ELISA方法，同時(shí)進(jìn)行豬偽狂犬病血清抗體檢測，結(jié)果為：LA檢測，11份血清判定為陽性，陽性血清率為73.3%；IGFA試驗(yàn)，10份血清判定為陽性，陽性血清率為66.7%；ELISA試驗(yàn)，12份血清判為陽性，陽性血清率為80.0%。

3 討論

豬偽狂犬病是阻礙養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要疫病之一，豬感染PRV或免疫之后，產(chǎn)生抗體水平并不高，因此，生產(chǎn)上需要敏感、準(zhǔn)確的血清學(xué)方法檢測[3]。

從以上結(jié)果看出，在3種豬偽狂犬病血清學(xué)診斷方法中，乳膠凝集試驗(yàn)的敏感性高，但特異性差，檢測結(jié)果中假陽性較高，但其操作簡便，對人員、設(shè)備條件要求不高，檢測成本低，適合作為流行病學(xué)調(diào)查、疫病監(jiān)測以及種豬群檢疫凈化陽性豬初篩的檢驗(yàn)方法使用。

膠體金免疫試驗(yàn)的準(zhǔn)確性、敏感性、特異性均不理想，但具有操作簡便、設(shè)備要求低、檢驗(yàn)成本低廉、結(jié)果易于判定等優(yōu)點(diǎn)，進(jìn)一步完善后，可作為一種適合基層單位大批量快速檢疫需要的理想檢驗(yàn)方法，具有很好的開發(fā)前景[4]。

間接ELISA試驗(yàn)因敏感性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)而被列為國際貿(mào)易指定檢測項(xiàng)目之一[5]。目前的試驗(yàn)室及科研機(jī)構(gòu)常用此方法在臨床上進(jìn)行定性和定量檢測。

三種試驗(yàn)的符合率都達(dá)到了基本的要求，得到了比較好的效果。間接ELISA試驗(yàn)在敏感性、特異性、準(zhǔn)確性等方面都明顯優(yōu)于其他兩種試驗(yàn)，因而可以作為其他試驗(yàn)結(jié)果的參考標(biāo)準(zhǔn)。

目前應(yīng)用的豬偽狂犬病疫苗均可能干擾現(xiàn)有的血清學(xué)檢測方法，因此，作為疫病監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)查，為確信結(jié)果準(zhǔn)確，檢測前應(yīng)該先確定檢測豬群未使用豬偽狂犬病疫苗免疫；作為科研生物制品廠家，應(yīng)加強(qiáng)基因缺失疫苗新產(chǎn)品的研制開發(fā)和生產(chǎn)，并生產(chǎn)與之配套的診斷試劑；作為種豬場，應(yīng)在疫苗檢測的基礎(chǔ)上，確定是否上苗，使用何種疫苗，對監(jiān)測陽性率不高的種豬場要堅(jiān)決采取疫病凈化的防治措施，確定使用疫苗應(yīng)選擇基因缺失疫苗，為此后的監(jiān)測和凈化留有余地。

參考文獻(xiàn)

[1]孫剛，杜宇沛，高忠溶，等.應(yīng)用瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)檢測豬偽狂犬病抗體的研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2000（4）：8-9.

[2]邱德新，陳煥春，何啟蓋，等.間接ELISA檢測豬偽狂犬病血清抗體[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2002（2）：37.

[3]范緯興，胡敬東，吳加強(qiáng)，等.豬偽狂犬病病毒A株的分離鑒定[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2003（6）：15.

[4]張志，柳淑芳，趙宏坤，等.豬偽狂犬病的診斷方法研究進(jìn)展[J].養(yǎng)豬，2000（4）：37-38.

[5]國際獸疫局.診斷試劑和疫苗標(biāo)準(zhǔn)手冊[M].青島：青島新聞出版局，1996.

（責(zé)任編輯：趙中正）

收稿日期：2017-02-18

作者簡介：范燦洪（1981—），男，廣東佛山人，本科，獸醫(yī)師，從事獸醫(yī)工作。