丹酚酸B對缺氧復氧誘導H9c2心肌細胞損傷的保護作用機制研究

劉莎莎，張 賽，湯 智，李玉冰，馮 凱，劉 湘*

（1.湘潭市中心醫院，湖南 湘潭 411100；2.湘潭市中醫院，湖南 湘潭 411100；3.大連市友誼醫院，遼寧 大連 116100；4.大連市口腔醫院，遼寧 大連 116021）

丹酚酸B對缺氧復氧誘導H9c2心肌細胞損傷的保護作用機制研究

劉莎莎1，張 賽2，湯 智2，李玉冰3，馮 凱4，劉 湘1*

（1.湘潭市中心醫院，湖南 湘潭 411100；2.湘潭市中醫院，湖南 湘潭 411100；3.大連市友誼醫院，遼寧 大連 116100；4.大連市口腔醫院，遼寧 大連 116021）

目的 觀察丹酚酸B（Sal B）對H9c2心肌細胞缺氧復氧（hypoxia-reoxygenation，H/R）損傷的保護作用，并探討其可能的作用機制。方法 首先構建H9c2心肌細胞缺氧復氧模型，采用噻唑藍（MTT）法研究丹酚酸B與H9c2心肌細胞活力的量效關系，確定丹酚酸B的保護作用，給藥方式為預給藥。實驗分為正常對照組、丹酚酸B組、模型組（H/R組）、H/R+丹酚酸B組，分別檢測各組乳酸脫氫酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）、活性氧簇（ROS）以及半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-3（Caspase-3）的含量變化。Western印跡檢測添加丹酚酸B對Akt磷酸化的影響，添加Akt抑制劑LY294002加以比較。結果 與正常對照組相比較，模型組LDH、MDA、ROS以及Caspase-3含量水平顯著升高（P<0.05），SOD、GSH-Px以及CAT含量水平顯著降低（P<0.05）；與模型組相比，丹酚酸B能夠顯著提高SOD、GSH-Px以及CAT含量水平（P<0.05），顯著降低LDH、MDA、ROS以及Caspase-3含量水平（P<0.05）。Western印跡結果顯示與正常對照組相比較，模型組Akt磷酸化水平顯著降低（P<0.001），相對于模型組丹酚酸B能夠顯著提高Akt的磷酸化水平（P<0.01），而這種保護作用能被LY294002所阻斷（P<0.01）。結論 丹酚酸B對H9c2心肌細胞缺氧復氧損傷具有保護作用，其機制可能與磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K/Akt）通路相關。

丹酚酸B；H9c2心肌細胞；缺氧復氧；抗氧化；抗凋亡；磷脂酰肌醇3-激酶

缺血性心臟?。ü谛牟。┦侨澜绶秶鷥劝l病率及致死率最高的疾病之一，嚴重威脅人類的健康[1]。冠心病的治療過程中常常伴隨著心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI），其中氧自由基的大量生成及其后續的凋亡是MIRI損傷的重要機制之一[2-4]。丹參作為一種傳統的活血化瘀中藥，常用于冠心病的治療[5-7]。丹酚酸B（Sal B）作為丹參中含量最多的成分同時也是最主要的活性成分，具有廣泛的臨床應用前景[8]。本研究采用心肌細胞缺氧復氧 （hypoxia-reoxygenation，H/R）損傷模型，從抗氧化及抗凋亡等方面探討丹酚酸B對H/R損傷的作用機制，旨在為其臨床應用提供基礎理論依據。

1 材料

1.1 細胞

大鼠心肌細胞H9c2，購于中國科學院細胞庫。

1.2 受試藥物

丹酚酸B，購于上海融禾醫藥科技發展有限公司，質量分數>98%。以二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解，加DMEM 稀釋至所需濃度。

1.3 主要儀器及試劑

二氧化碳細胞培養箱購自美國Thermo Scientific公司；超凈工作臺購自上海智成分析儀器制造有限公司；超純水儀購自美國Merck Millipore公司；恒溫磁力攪拌器購自上海司樂儀器有限公司；臺式離心機購自上海安亭科學化學儀器廠；低溫冰箱購自青島海爾股份有限公司；酶標儀購自奧地利Tecan公司；電子天平購自梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；厭氧手套箱購自美國COY Laboratory公司；SDS PAGE微型凝膠電泳及轉膜設備購自美國BioRad公司；高糖DMEM培養基、無糖DMEM培養基和胎牛血清購自美國Gibco公司；噻唑藍（MTT）及活性氧簇（ROS）試劑盒購自美國ENZO公司；胰酶（Trypsin）及DMSO購自美國Sigma公司；乳酸脫氫酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）和考馬斯亮藍蛋白定量試劑盒購自南京建成科技有限公司；半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶3（Caspase-3）活性檢測試劑盒購自美國Biovision公司。哺乳動物蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、增強型免疫化學發光免疫印跡檢測試劑盒和兔抗鼠二抗購自北京康為世紀有限公司；抑制劑LY294002(CID:3973)購自美國CA公司；鼠源一抗 p-Akt 1/2/3(B-5)、Akt 1/2/3(H-136)和 β-actin(C-2)購自美國Santa Cruz公司。

2 方法

2.1 心肌細胞H/R模型的構建

H9c2心肌細胞復蘇后轉移至培養瓶中，加入含有10%胎牛血清的培養液，置于37℃含5%CO2的細胞培養箱中培養。H9c2心肌細胞在含10%血清和1%雙抗的高糖DMEM培養基中鋪板生長24 h后達到生長對數期。缺氧處理前去除培養板中高糖DMEM培養基，加入無糖DMEM培養基，放入COY厭氧手套箱37℃恒溫培養。復氧處理時，從厭氧手套箱中取出細胞培養板，用新鮮的高糖DMEM培養基替換無糖培養基，放入正常細胞培養箱中培養。H9c2心肌細胞缺氧時間固定為 6 h， 分別復氧 0、3、6、9、12、18、24 h，MTT法檢測復氧不同時間對H9c2心肌細胞活力的影響，最終確定造模時間為缺氧6 h和復氧24 h。

2.2 分組與干預

實驗分為正常對照組、丹酚酸B組、模型組（H/R組）和H/R+丹酚酸B組，其中H/R組和H/R+丹酚酸B組細胞進行H/R損傷處理，對照組和丹酚酸B組細胞不做處理。

2.3 指標檢測

2.3.1 MTT法檢測丹酚酸B預處理對H/R誘導H9c2心肌細胞的影響 首先在正常條件下1.563、3.125和6.25 μg/mL三個濃度丹酚酸B預孵育細胞24 h，考察藥物的增殖作用和毒性作用，隨后在缺氧6 h和復氧24 h條件下篩選最佳藥物作用濃度，本部分實驗分為正常對照組，H/R組和低、中、高濃度丹酚酸B給藥組。

2.3.2 乳酸脫氫酶（LDH）活性測定 正常對照組和丹酚酸B組不做處理，H/R組和H/R+丹酚酸B組細胞缺氧6 h和復氧24 h，處理結束后收集細胞培養液，參考南京建成試劑盒操作步驟進行測定。

2.3.3 超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）含量變化測定 正常對照組和丹酚酸B組不做處理，H/R組和H/R+丹酚酸B組細胞缺氧6 h和復氧24 h，處理結束后收集細胞培養液，按照南京建成試劑盒說明書進行操作。

2.3.4 活性氧簇（ROS）含量變化測定 正常對照組和丹酚酸B組不做處理，H/R組和H/R+丹酚酸B組細胞缺氧6 h和復氧24 h，處理結束后取足量細胞移至離心管中，按照試劑盒說明書進行操作。

2.3.5 半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶3（Caspase-3）的含量變化測定 正常對照組和丹酚酸B組不做處理，H/R組和H/R+丹酚酸B組細胞缺氧6 h和復氧24 h，處理結束后取足量細胞移至離心管中，按照試劑盒說明書進行操作。

2.3.6 Western印跡檢測 采用哺乳動物蛋白提取試劑盒提取細胞蛋白，BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，轉NC膜。5%脫脂奶粉TBST溶液室溫封閉3 h后，分別加入 p-Akt、Akt和 β-actin 鼠源一抗 （1∶200），4℃孵育過夜，1×TBST洗3次，加入兔抗鼠二抗（1∶2 000），室溫孵育 2 h，1×TBST 洗 3 次，用 ECL顯色并曝光，凝膠系統拍片，采用Image J軟件進行條帶灰度掃描。加入Akt抑制劑LY294002組進行驗證，給藥前預處理1 h，濃度為50 mol/L。

2.4 統計學處理方法

3 結果

3.1 心肌細胞H/R模型的構建

結果顯示隨著復氧時間的增加，心肌細胞活力逐漸下降，表明復氧在MIRI中發揮著重要作用。最佳的造模條件為缺氧6 h和復氧24 h（P<0.01）。結果見圖1A。

3.2 不同濃度丹酚酸B對H/R誘導的H9c2心肌細胞的影響

結果顯示細胞的活力沒有發生變化（圖1B）。排除了丹酚酸B的增殖作用和毒性作用后，尋找最佳的給藥濃度，最終發現最佳的給藥濃度為6.25 μg/mL。見圖1B-1C。

3.3 丹酚酸B對H/R誘導的H9c2心肌細胞LDH的影響

LDH在細胞膜損傷時會從細胞中漏出，其可作為細胞死亡的標志。圖1D顯示相對于正常對照組，H/R組能夠顯著增加LDH的釋放，相對于H/R組H/R+SalB能夠顯著減少LDH的釋放（P＜0.01）。見圖1D。

圖1心肌細胞H/R模型構建及丹酚酸B對其影響

3.4 丹酚酸B對H/R誘導的H9c2心肌細胞SOD、MDA、GSH-Px和CAT的影響

相對于對照組，H/R能夠對H9c2心肌細胞造成氧化應激損傷，它能夠降低SOD、CAT和GSH-Px的活力（P＜0.05）并且提高 MDA 的含量（P＜0.01）。丹酚酸B的預處理能顯著抑制抗氧化物酶活性的降低（P＜0.05）和 MDA 量的增加（P＜0.01）。 見圖2A-2D。

3.5 丹酚酸B對H/R誘導的H9c2心肌細胞ROS的影響

ROS的大量生成在細胞凋亡的過程中發揮重要作用[9]。圖2E顯示相對于正常對照組，H/R 組的細胞內 ROS水平顯著提高（P＜0.001），而丹酚酸B的預處理能顯著降低細胞內ROS的水平 （P＜0.05）。結果表明丹酚酸B對H/R誘導的H9c2心肌細胞損傷的保護作用與其抑制氧化應激反應有關。

3.6 丹酚酸B對H/R誘導的H9c2心肌細胞Caspase-3的影響

Caspase-3活力的升高顯示H/R組的凋亡損傷增加（P＜0.001），相對于H/R組，丹酚酸B的預處理可以減輕凋亡損傷（P＜0.05）。見圖2F。

3.7 丹酚酸B對H/R誘導的H9c2心肌細胞Akt磷酸化水平的影響

Western印跡結果顯示與正常對照組相比較，模型組Akt磷酸化水平顯著降低（P<0.001），相對于模型組，丹酚酸B能夠顯著提高Akt的磷酸化水平（P<0.01），而這種保護作用能被LY294002所阻斷（P<0.01）。見圖3。

圖2丹酚酸B對H/R損傷H9c2心肌細胞活力指標的影響

4 討論

H9c2心肌細胞株是一種從大鼠胚胎心臟中分離出的永生化的心肌細胞系，不但具有類似于胚胎大鼠心肌細胞的形態學特征，而且具有成年大鼠心肌細胞電生理學和信號轉導方面的生理特征，且性質穩定，因而被廣泛應用于心肌細胞生理和病理方面的實驗研究[10]。本研究利用體外H/R模型誘導H9c2心肌細胞凋亡，接近于體內心肌組織細胞MIRI的病理生理本質，是探討丹酚酸B對MIRI過程中心肌細胞損傷的影響和機制研究的合適模型。

圖3 Western blot檢測丹酚酸B對H/R損傷H9c2心肌細胞Akt磷酸化水平的影響

目前研究報道的MIRI的發生機制主要有氧化應激、細胞凋亡、鈣超載、炎癥反應和能量代謝障礙等[11-12]。盡管MIRI發生的機制目前仍不完全清楚，但是越來越多的研究認為，氧化應激介導的心肌細胞凋亡與MIRI的發生發展關系密切，可能是其發病機制中的重要環節之一。氧化應激是指活性氧簇(ROS)的產生超過了機體內的清除能力導致活性氧自由基及其相關代謝產物在體內過量積聚造成失衡，從而對機體造成多種損害作用的病理狀態。在機體正常情況下ROS可以被體內的抗氧化酶清除從而使細胞免受ROS的氧化損傷。當機體處于非正常情況比如組織細胞缺血缺氧時，ROS的清除系統功能降低或喪失從而造成細胞急性或慢性損傷[2,4,13]。氧化應激在心血管疾病的發生發展過程發揮著重要作用，既可直接損傷細胞DNA誘導凋亡，還可以通過激活線粒體途徑等間接方式介導細胞凋亡。細胞凋亡（Apoptosis）是受一系列基因調控的、自發性的程序性死亡，它對維持機體細胞生長與消亡的平衡起著重要的調節作用，細胞凋亡并不是病理條件下自體損傷的一種現象，而是為更好地適應生存環境而主動爭取的一種死亡過程。大量的研究證實缺血性心臟病、MIRI損傷、心衰以及神經退行性疾病等多種病理生理狀態的過程中均伴有細胞凋亡的發生[14-18]。因此抗氧化應激從而抑制凋亡成為探索這些疾病的發病機制及研制相關藥物的一個重要的方向。

細胞凋亡的誘導因子能夠通過激活蛋白磷酸化依賴的信號傳導級聯反應抑制或促進凋亡程序。研究表明磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K/Akt）信號轉導通路在MIRI誘導的心肌細胞凋亡信號傳導中具有重要的作用[19]。PI3K/Akt信號傳導通路抗細胞凋亡作用可能與下面幾種機制有關：（1）調節Bcl-2家族成員的活性[19]；（2）抑制 Caspase 導致的細胞凋亡；（3）抑制促凋亡基因的表達[20]；（4）活化轉錄因子NF-κB，抑制細胞凋亡；（5）活化的Akt能夠抑制線粒體釋放細胞色素c從而抑制細胞凋亡[21]。此外PI3K/Akt信號轉導通路還可以調控細胞的生長與存活，血管新生，細胞遷移以及細胞周期等多種細胞活動與生物學效應[22-23]。

H/R誘導的H9c2心肌細胞氧化損傷模型被廣泛用于模擬氧化應激[24]。在本研究中，H/R誘導的H9c2心肌細胞凋亡表現出了LDH釋放的顯著增加以及細胞存活率的顯著降低。H/R造模的MTT結果顯示復氧的0～24 h過程中細胞存活率呈時間依賴性地降低，說明了缺氧能夠使H9c2心肌細胞的存活率降低，而復氧能使其進一步地降低。最終選擇缺氧6 h加復氧24 h作為造模條件。

在觀察完丹酚酸B的增殖作用和毒性作用以后，發現采用6.25 μg/mL丹酚酸B預處理24 h后能顯著提高H/R損傷后的H9c2心肌細胞的存活率。丹酚酸B預處理對心肌細胞的保護作用體現在細胞存活率的增高和LDH漏出的降低。

大量ROS的存在能夠通過脂質過氧化作用，蛋白質和DNA的氧化損傷多種生物分子，最終導致線粒體功能失常，Caspase-3的激活以及細胞的凋亡[25]。Caspases（半胱氨酸-天門冬氨酸特異性蛋白酶）家族是一類獨特的半胱氨酸蛋白酶，它們可特異性水解目標蛋白中天門冬氨酸殘基的羧基端。至今在哺乳動物中已發現的Caspase超過13種，其中起最為關鍵作用的是Caspases-3，一種凋亡關鍵效應酶。Caspase-3主要作用是對底物蛋白質進行酶解從而直接介導凋亡實施。MIRI導致氧化應激等因素可誘導內源性和外源性凋亡通路的激活，并最終激活Caspases-3。活化的Caspases-3可以降解多種胞內蛋白，使胞膜、細胞骨架及染色體結構遭到破壞，導致胞體固縮，染色體崩解，凋亡小體形成等。因此許多研究中將Caspase-3作為凋亡損傷的標志性指標[26]。許多研究表明MIRI能夠引起Caspase-3活性的增高和心肌凋亡細胞數量的增加[27]。在本研究中H/R誘導的損傷能夠提高H9c2心肌細胞胞內ROS濃度，并且也能增高氧化應激標志物比如脂質過氧化產物MDA的含量。丹酚酸B的預處理能夠降低它們的含量并且能有效地增加SOD、GSH-px和CAT的活力。

PI3K/Akt信號通路在調控心肌細胞的生存和凋亡過程中發揮著重要作用。Western印跡檢測結果顯示丹酚酸B的預處理可以顯著升高H/R損傷造成的Akt磷酸化水平降低，而這種保護作用可以被LY294002所阻斷。因此我們推測丹酚酸B預處理可能通過激活PI3K/Akt通路抑制H/R誘導的H9c2心肌細胞凋亡。

綜上所述，丹酚酸B對H/R誘導H9c2心肌細胞損傷具有保護作用，其作用機制可能與PI3K/Akt通路相關，但其確切的作用機制尚需進一步研究。

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（本文編輯 楊 瑛）

Protective Effect of Salvianolic Acid B on Hypoxia-Reoxygenation Induced Injury in H9c2 Cardiomyocytes

LIU Shasha1,ZHANG Sai2,TANG Zhi2,LI Yubing3,FENG Kai4,LIU Xiang1*
(1.Xiangtan Central Hospital,Xiangtan,Hunan 411100,China;2.Xiangtan Chinese Medicine Hospital,Xiangtan,Hunan 411100,China;3.Dalian(Municipal)Friendship Hospital,Dalian,Liaoning 116001,China;4.Dalian Stomatological Hospital,Dalian,Liaoning 116021,China)

ObjectiveTo investigate the protective effect of salvianolic acid B (Sal B)on hypoxia-reoxygenation(H/R)induced injury in H9c2 cardiomyocytes.MethodsThe hypoxia-reoxygenation model of H9c2 cardiomyocytes was constructed.The relationship between the activity of Sal B and H9c2 was measured by MTT assay,and the protective effect of Sal B was determined.The following sets of experiments were performed:control group,Sal B group,model group(H/R group),H/R+Sal B group.The contents of lactic dehydrogenase(LDH),superoxide dismutase(SOD),malonaldehyde(MDA),glutathione peroxidase(GSH-Px),catalase(CAT),reactive oxygen species(ROS)and Caspase-3 in all groups were determined.The effect of Sal B on Akt phosphorylation was tested with Western blotting,and LY294002 added as the control.ResultsCompared with the control group,LDH,MDA,ROS,and Caspase-3 levels in H/R group significantly increased(P<0.05)and SOD,GSH-Px,and CAT levels in H/R group significantly decreased (P<0.05).Compared with H/R group,Sal B significantly increased SOD,GSH-Px,and CAT levels and decreased LDH,MDA,ROS,and Caspase-3 levels.Western blotting results showed that:compared with the controlgroup,Aktphosphorylation levelin modelgroup decreased significantly (P<0.01);comparedwith model group,Akt phosphorylation level in Sal B group increased significantly (P<0.01),while this effect could be blocked by LY294002(P<0.01).Conclusion Sal B shows protective effect on H9c2 cadiomyocytes injury induced by H/R,which mechanism may be related with the PI3K/Akt signaling pathway.

salvianolic acid B;H9c2 cadiomyocytes;hypoxia-reoxygenation;antioxidant;anti-apoptosis;PI3K/Akt

R285.5；R541.4

A

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2017.08.005

2016-12-10

劉莎莎，女，碩士，研究方向：心血管藥理。

*劉 湘，女，主任藥師，E-mail：liuxiangtougao@163.com。

本文引用：劉莎莎，張 賽，湯 智，李玉冰，馮 凱，劉 湘.丹酚酸B對缺氧復氧誘導H9c2心肌細胞損傷的保護作用機制研究[J].湖南中醫藥大學學報，2017，37（8）：832-837.