吉林省稻瘟病菌無毒基因鑒定及分析

姜兆遠 劉曉梅 李莉 鄒曉威 任金平 袁媛 張鐵新 王繼春 吳憲+朱峰 孫輝

摘要：為了明確無毒基因在吉林省不同稻區的分布及變異情況，將PCR檢測技術與接種鑒定技術相結合，分析2014年吉林、長春、通化、四平、延邊、松原、白城、遼源等稻區的24株優勢單孢菌株中無毒基因的情況。結果表明，24個優勢稻瘟病菌株含無毒基因的比率較高，5個稻區的優勢菌株100%含有無毒基因，松原稻區1株優勢菌株PCR檢測到無毒基因，但對[WTBX][STBX]Pi9[WTBZ][STBZ]單基因品系IRBL9-W仍有致病性，說明該菌株無毒基因結構發生了變化，其他PCR結果均與接種結果相一致。

關鍵詞：稻瘟?。豢共』?；無毒基因；；接種鑒定；PCR檢測

中圖分類號： S435.111.4+1文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）10-0027-03

稻瘟病是世界范圍內的主要水稻病害之一。在我國各水稻栽培地區均經常發生稻瘟病，吉林省也是稻瘟病經常流行的主要地區，如果不防治可導致稻谷損失30%以上，局部田塊甚至出現絕收的情況[1]。稻瘟病的病原為稻巨座殼（Magnaporthe oryzae B.C.Couch），隸屬于子囊門巨殼屬。其無性階段為稻梨孢（Pyricularia oryzae Cavara），屬于子囊菌無性型梨孢屬。稻瘟病是完全符合基因對基因假說的病害[2-3]，稻瘟病的發生程度取決于田間菌群的無毒基因類型，當種植的水稻所含抗瘟基因與田間菌群所含的無毒基因相對應時，水稻則表現抗??；若水稻的抗病基因與菌群的無毒基因不對應，則表現感病，在適宜的氣候條件下極易造成災變。種植抗瘟品種是防治稻瘟病最經濟有效的方法，但一個抗病品種在推廣3～5年后就失去對當地稻瘟病菌的抗性[4]，主要是由稻瘟病菌變異及其上升為優勢菌群所致。引起稻瘟病菌變異的因素很多[5-10]，但田間稻瘟病致病性的變異實質是田間無毒基因功能的缺失或獲得[11]。吉林省是優質粳稻主產區，粳稻種植面積超過70萬hm2[12]，稻瘟病的控制對我國優質米的保障尤為重要。

截至2015年3月，已至少報道了69個抗稻瘟病位點共84個主效基因，其中24個基因已被成功克隆[13]，抗瘟基因中[WTBX][STBX]Pi9[WTBZ][STBZ]抗譜較廣，對來自13個國家的43個稻瘟病菌株均表現出很高的抗性[14]，抗瘟基因[WTBX][STBX]Pi9[WTBZ][STBZ]對應的無毒基因已被克隆[15]，因此明確吉林省稻瘟病菌無毒基因分布情況對吉林省稻區水稻品種布局具有較好的指導意義。

1材料與方法

1.1供試品種

以單基因等基因系品種IRBL9-W、蒙古稻（感病對照）為供試材料。

1.2稻瘟病樣采集及菌株篩選

2014年從吉林、長春、通化、四平、延邊、松原、白城、遼源各稻區采集穗頸瘟標樣，通過振蕩法分別獲得10個單孢菌株，從中選出3株菌絲生長較好、產孢子能力強的優勢菌株，共獲得24個稻瘟病優勢菌株，所有菌株均由吉林省農業科學院植物保護研究所水稻病害課題組保存。

1.3菌絲的培養及孢子收集

取4塊直經約為5 mm的斜面培養稻瘟病菌菌塊于PDA平板上，27 ℃條件下在PDA培養基上培養7 d后，移至產孢培養基上，再培養5～7 d，無菌條件下洗去表面菌絲，將菌絲[HJ1.4mm]收集到2 mL的離心管中同時放入2粒玻璃珠，置于-80 ℃冰箱中保存，將洗掉菌絲的平板進行12 h—12 h光—暗培養 3 d，用無菌水洗滌并稀釋孢子懸浮液終濃度為2×105個/mL，用于接種。

1.4接種檢測

將IRBL9-W播于16穴苗盤內，同時播2穴蒙古稻，在稻[CM（25]苗3葉期時進行噴霧接種。接種在溫室內進行，接種后于[CM）][LM]24～28 ℃暗箱保濕16 h，6～7 d后進行調查，采用0～9級標準調查發病率[16]。設3次重復，蒙古稻發病率達5級及以上。

1.5稻瘟病菌28 S rDNA檢測及分析

將-80 ℃超低溫冰箱保存的菌株置于液氮中，2 min后將樣品置于高通量組織細胞研磨破碎儀中進行破碎。DNA提取方法按試劑盒說明書進行。

根據NCBI上公布的稻瘟病菌28S核糖體RNA基因（GenBank：KM484999.1）設計引物28SF-TAGGACGCCGAACCTCTGTA，28SR-GGTATTACGCAACGGGCTA；根據NCBI上公布的無毒基因（GenBank：KM004023.1）起始密碼子前1 170 bp到起始密碼子后254 bp設計引物 F-GAGATTGTCAGAGAAGTCCGA，R-GCTTATTTACCCATCATCGC。

反應程序為94 ℃預變性5 min；隨后30個擴增循環：94 ℃ 變性1 min，55 ℃（引物52 ℃）退火30 s，72 ℃延伸30 s（引物90 s）；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴增產物采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳成像分析。

2結果與分析

2.1接種檢測分析

將24株菌株孢子懸液均勻的噴霧接種在IRBL9-W和蒙古稻葉片上，結果如表1所示，24株菌株均能侵染蒙古稻，且病級都達5級及以上。吉林稻區的2號菌株、通化稻區9號菌株和松原稻區的16號菌株均能侵染IRBL9-W，病級達到4級水平；松原稻區的18號菌株在IRBL9-W水稻上產生病斑達到5級水平，其他菌株均不能侵染IRBL9-W。根據基因對基因假說，未侵染水稻的稻瘟菌含有對應的無毒基因，侵染水稻的菌株不含有對應的無毒基因，因此，24個菌株中有20個菌株含有無毒基因。其中長春、四平、延邊、白城及遼源等稻區的供試菌株都含有無毒基因，而吉林、通化及松原分別檢測到1、1、2株不含有無毒基因[WTBX][STBX]AvirPi9[WTBZ][STBZ]的菌株。

2.2稻瘟病菌28S rDNA檢測及無毒基因基因分析

根據稻瘟病菌28S rDNA序列設計引物檢測24個優勢菌株的DNA，所有供試菌株均擴增到342 bp大小的特異性片段（圖1），說明該方法提取的稻瘟病菌DNA完全可以用于稻瘟病菌無毒基因的PCR檢測分析。

根據設計的引物擴增24個菌株的無毒基因，經檢測吉林地區2號菌株、通化地區株9號菌株、松原地區16號菌株未擴增出目的條帶，與接種鑒定結果一致，而松原的18號菌株擴增出目的條帶，與接種鑒定結果不一致，說明18號菌株無毒基因結構可能發生了改變。其他菌株均擴增到 1 425 bp 大小的目的條帶（圖2），PCR檢測結果與接種鑒定結果一致。

3結論與討論

3.1結論

接種鑒定與PCR檢測結果表明，長春、四平、延邊、白城及遼源稻區供試稻瘟病菌優勢菌株均含有無毒基因且[CM（25]不能侵染IRBL9-W葉片；吉林、通化和松原稻區分別有[CM）]

1、1、2株稻瘟病菌優勢菌株不存在無毒基因結構且能夠侵染 IRBL9-W 葉片；松原稻區有1株菌株存在基因結構但可以侵染IRBL9-W葉片，具體原因需要進一步研究分析。

3.2討論

本研究從2014年吉林、長春、通化、四平、延邊、松原、白城、遼源各稻區栽培稻上分離病菌鑒定了24株稻瘟病菌優勢菌株。吉林省位于中緯度歐亞大陸的東側，地處長白山脈，東部為山區、半山區，中部為松遼平原區，西部為草原區。從東南向西北由濕潤氣候過渡到半濕潤氣候再到半干旱氣候，有明顯的季節變化和地域差異[17]。根據地域特點吉林省稻區可以劃分為平原稻作區、半山區稻作區、山區冷涼稻作區及高

寒山區稻作區，不同稻區活動積溫存在顯著差異，水稻品種覆蓋極早熟至晚熟所有熟期的品種。根據各地區生產水平，吉林省可分為8個稻作區域[18]，所分離的8個地區稻瘟病菌優勢菌株基本代表了吉林省稻瘟病菌優勢菌群遺傳特點，分析這些菌株的無毒基因，對了解吉林省整體稻瘟病菌菌群的變化和特點有重要的參考價值。

2014年吉林省各稻區整體稻瘟病菌無毒基因存在頻率較高。松原地區3株優勢菌株中存在1株優勢菌株含無毒基因，該菌株分離自吉粳88，由于吉粳88種植面積逐年縮小，該優勢菌株群可能存在下降的趨勢。吉林、通化及松原稻區PCR未檢測到無毒基因的菌株均分離自稻花香品種。稻花香2號品種目前對吉林省稻瘟病菌具有一定的抗性，但在稻田中已經出現零星發病的稻穗，稻花香種植

面積在吉林省各稻區呈逐年增加的趨勢，因此該稻瘟病菌優勢菌群富集可能是吉林省未來稻瘟病暴發的原因。所得結果對含[WTBX][STBX]Pi9[WTBZ][STBZ]抗病基因水稻育種及推廣具有重要的參考價值。

參考文獻：

[1]陳溫福，潘文博，徐正進. 我國粳稻生產現狀及發展趨勢[J]. 沈陽農業大學學報，2006，37（6）：801-805.

[2]Silue D，Notteghem J L，Tharreau D. Evidence of a gene-for-gene relationship in the Oryza sativa-Magnaporthe grisea pathosystem[J]. Phytopathology，1992，82（5）：577-580.

[3]Flor H H. Current status of the gene-for-gene concept[J]. Annual Review of Phytopathology，1971，9（1）：275-296.

[4]雷財林，凌忠專，王久林，等. 北方稻區稻瘟病菌種生理小種變化與抗病育種策略[J]. 作物雜志，2000（3）：14-16.

[5]Ou S H. Pathogen variability and host resistance in rice blast disease[J]. Annual Review of Phytopathology，2003，18（1）：167-187.

[6]Giatgong P，Frederiksen R A. Pathogenic variability and cytology of monoconidial subcultures of Piricularia oryzae[J]. Phytopathology，1969（8）：1152.

[7]Quamaruzzaman M，Ou S H. Monthly changes of pathogenic races of Pyricularia oryzae in a blast nursery[J]. Phytopathology，1970，60（8）：1266-1269.

[8][JP3]Jeon J，Choi J，Lee G W，et al. Experimental evolution reveals genome-[JP]wide spectrum and dynamics of mutations in the rice blast fungus， Magnaporthe oryzae[J]. PLoS One，2013，8（5）：e65416.

[9]王軍，宮丹妮，楊杰，等. 江蘇省粳稻品種抗稻瘟病基因型與穗頸瘟抗性分析[J]. 江蘇農業學報，2016，32（2）：250-256.

[10]王偉舵，于俊杰，聶亞鋒，等. 2011—2014年江蘇省稻瘟病菌種群動態及毒力變化[J]. 江蘇農業學報，2015，31（2）：285-289.

[11]姚琳，王劍，盧代華，等. 稻瘟病菌無毒基因研究進展[J]. 中國農學通報，2014，30（4）：232-237.

[12]周廣春，孟維韌，全東興，等. 吉林省水稻生產及增產潛力研究[J]. 沈陽農業大學學報，2012，43（6）：688-692.[HJ1.7mm]

[13]國家水稻數據中心. 稻瘟病主效抗性基因列表[DB/OL]. （2012-06-20）[2015-11-03]. http：//www.ricedata.cn/gene/gene_pi.htm.

[14]Liu G，Lu G，Zeng L，et al. Two broad-spectrum blast resistance genes，[WTBX][STBX]Pi9[WTBZ][STBZ]（t） and [WTBX][STBX]Pi2[WTBZ][STBZ]（t），are physically linked on rice chromosome 6[J]. Molecular Genetics and Genomics，2002，267（4）：472-480.

[15]Wu J，Kou Y，Bao J，et al. Comparative genomics identifies the Magnaporthe oryzae avirulence effector that triggers [WTBX][STBX]Pi9[WTBZ][STBZ]-mediated blast resistance in rice[J]. New Phytologist，2015，206（4）：1463-1475.

[16]錢前，郭龍彪. 曾大力等水稻分子育種技術指南[M]. 北京：科學出版社，2012.

[17]萬立民. 基于GIS的吉林省耕地地力評價[D]. 長春：東北師范大學，2014.

[18]侯立剛，周廣春，嚴永峰，等. 吉林省水稻發展現狀與未來發展對策[J]. 北方水稻，2015，45（2）：73-76.