提取枸杞棉蚜基因組DNA的9種方法比較

李琳琳 嚴林 金生英 謝久祥 溫小成

摘要：為探討適合枸杞棉蚜基因組DNA提取的方法，采用9種方法提取枸杞棉蚜基因組DNA，并對每種方法提取的DNA樣本質量進行綜合比較分析。結果表明，改進十二烷基硫酸鈉（SDS）法、優化KAc法、STE精提法、Chelex粗提法、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法、鹽析法均可從枸杞棉蚜中提取總DNA，濃度高且所制備出的DNA均可成功應用于mtDNA CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因擴增。STE粗提法、Chelex精提法、飽和NaCl法Ⅱ提取的枸杞棉蚜基因組DNA質量低，不能滿足分析要求。改進SDS法及STE精提法所制備的DNA質量較佳、產量較高、實用性強，是值得推廣應用的枸杞棉蚜基因組DNA提取方法。鹽析法提取DNA，試劑成本低、毒性小，是一種安全有效的枸杞棉蚜基因組DNA提取方法。Chelex粗提法是一種快速的枸杞棉蚜基因組DNA提取方法。

關鍵詞：枸杞；棉蚜；基因組DNA；提取方法

中圖分類號： S435.671文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）10-0030-04

枸杞棉蚜（Aphis gossypii Glover）屬同翅目（Hompotera）蚜科（Aphididae）蚜屬（Aphis），是我國西北地區栽培枸杞（Licium barbarum L.）分布地的主要害蟲，短期內可暴發成災，引起枸杞果產量和品質嚴重下降[1]。棉蚜具有明顯的生物型[2-3]，如棉花型和黃瓜型[4-5]，而枸杞棉蚜屬于何種生物型亟待驗證。確定昆蟲的生物型，不僅需要采用傳統的生物學特征和生態學參數比較[4，6-7]，而且需要分子遺傳學數據佐證[2，7-8]。

單頭枸杞棉蚜基因組DNA提取是開展枸杞棉蚜分子遺傳學研究的前提與基礎[9]。由于枸杞棉蚜體型微小，體表有外骨骼，其DNA提取有一定難度。Black等通過十二烷基硫酸鈉（SDS）方法提取蚜蟲基因組DNA，并通過隨機擴增多態性DNA-PCR（RAPD-PCR）檢測蚜蟲多態性[10]；龔鵬等在棉蚜DNA的提取中采用STE精提法，用簡單重復序列PCR（SSR-PCR）技術研究了棉花和木槿上棉蚜的多態性[11]；安瑞生等對KAc法、SDS法的研磨步驟進行了改進[12-13]；張帆對改進后的KAc法中加入蛋白酶K進行了優化，并用 mtDNA-CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]技術研究了棉花型、黃瓜型棉蚜的多態性[14]。目前，國內最常用的2種棉蚜基因組DNA提取方法為改進SDS法和優化KAc法。國外棉蚜基因組DNA提取常采用SDS法[2，8]，以及Chelex粗提法[7，15]。

為篩選出適合枸杞上棉蚜基因組DNA的提取方法，本研究借鑒國內外應用較多的提取蚜蟲DNA的8種方法對其稍作改進，即改進SDS法、優化KAc法、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法、鹽析法、飽和NaCl法Ⅱ、STE粗提法、Chelex粗提法、STE精提法，并參照Chelex粗提法自創了Chelex精提法，對這9種方法提取的基因組DNA的質量、DNA提取所需時間、操作難易程度和所用試劑的毒性大小進行綜合比較，為進一步開展枸杞棉蚜遺傳結構分析奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

于2015年7—8月在青海諾木洪枸杞主產區蚜蟲發生較重的栽培枸杞田，采集無翅蚜蟲成蟲，每株枸杞采集1頭試蟲，每頭試蟲所在植株至少間隔5 m，樣品單頭分別放于盛有無水乙醇的1.5 mL離心管中浸泡，于4 ℃低溫采樣箱內保存，帶回實驗室后，于-40 ℃超低溫冰箱保存備用。試驗時隨機抽取。

1.2基因組DNA的提取方法

改進SDS法：參照楊子祥等的改進SDS法[16]，稍作改進。具體方法：將單頭蚜蟲在雙蒸水中漂洗，濾紙吸干后轉入1.5 mL離心管中，加入100 μL勻漿液（按A液 ∶[KG-*3]B液 ∶[KG-*3]C液體積比25 ∶[KG-*3]3 ∶[KG-*3]2配制。其中A液：Tris-HCl 10 mol/L，NaCl 01 mol/L，EDTA 1 mol/L，pH值為8.0；B液：10% SDS；C液：蛋白酶K 10 mg/mL）。用滅菌玻璃研磨棒對蚜蟲進行研磨。并用500 μL勻漿液沖洗研磨棒，56 ℃水浴4 h（若裂解液未透明，水浴時間延長至8 h），其間搖勻3～4次。加入600 μL Tris飽和酚，在搖床上緩慢搖勻20 min后，7 000 r/min 離心10 min，取上清液。加入600 μL三氯甲烷 ∶[KG-*3]異戊醇（體積比為24 ∶[KG-*3]1），在搖床上緩慢搖勻20 min后，7 000 r/min 離心 10 min，取上清液。加入600 μL無水乙醇（-20 ℃預處理），混勻，-20 ℃冰箱內放置1 h以上。12 000 r/min 離心 10 min，棄去上清液。加入600 μL 70%乙醇（-7 ℃預處理），12 000 r/min離心10 min，棄去上清液。自然干燥后，加入20 μL ddH2O溶解，-20 ℃保存。

優化KAc法：參照張帆的優化KAc法[14]。

STE粗提法：參照Gomi等的STE粗提法[17]，挑取蚜蟲方法同改進SDS法中的挑取方法，加入20 μL STE緩沖液（100 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH值為8.0），用玻璃研磨棒研磨，加入1.6 μL蛋白酶K（10 mg/mL）；簡單離心后，37 ℃孵育30 min；95 ℃初始變性5 min；簡單離心后，-20 ℃保存。

Chelex粗提法：參照Carletto等的Chelex粗提法[7，15]，蚜蟲在0.65%（質量分數）NaCl溶液中洗2次；將蚜蟲放入 1.5 mL 離心管中，管內放有55 μL 5%（質量分數）Chelex樹脂溶液，用玻璃研磨棒研磨；56 ℃水浴30 min，在100 ℃水浴7 min；5 000 r/min離心1 min，取上清液，-20 ℃保存。

STE精提法：參照龔鵬等的STE精提法[11]，在STE粗提法的基礎上進行改進，挑取單頭蚜蟲置于1.5 mL離心管內分別加入200 μL STE緩沖液（100 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH值為8.0），用玻璃研磨棒研磨，分別向離心管內再加入500 μL勻漿液、1.6 μL蛋白酶K（10 mg/mL），56 ℃水浴4 h；剩余步驟參照改進SDS法進行酚-三氯甲烷抽提，無水乙醇沉淀DNA，溶解保存。

Chelex精提法：在Chelex粗提法的基礎上進行改進，蚜蟲在0.65%（質量分數）NaCl溶液中洗2次；將蚜蟲放入 1.5 mL 離心管中，管內放有100 μL 5%（質量體積比）Chelex樹脂溶液，研磨；分別向離心管內再加入500 μL勻漿液、2 μL蛋白酶K（10 mg/mL），56 ℃水浴4 h；剩余步驟參照改進SDS法進行酚-三氯甲烷抽提，無水乙醇沉淀DNA，溶解保存。

CTAB法：參照韓玉翠等的CTAB法[18]，稍作改進。具體步驟如下：挑取蚜蟲于離心管中，加入50 μL CTAB 緩沖液[2%CTAB，0.1 mol/L Tris-HCl（pH值為8.0），0.02 mol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，0.2% β-巰基乙醇]，用滅菌玻璃研磨棒對蚜蟲進行研磨。并用150 μL CTAB緩沖液沖洗研磨棒；65 ℃水浴1 h；取出后加入1 U RNA酶，置于37 ℃溫箱中1 h；取出后加入500 μL三氯甲烷-異戊醇（體積比為 24 ∶[KG-*3]1），緩慢搖動混勻，13 000～15 000 r/min離心15 min；取上清液（約 150 μL），加入2倍體積的冰無水乙醇，約1/10體積NaAc（3 mol/L，pH值為5.2），混勻后置于-20 ℃ 3 h以上；13 000 r/min 離心15 min，棄上清液，用70%乙醇（-20 ℃ 預處理）清洗2次；室溫干燥，加入20 μL TE緩沖液溶解，于-20 ℃ 保存。

鹽析法：參照Sunnucks等的鹽析法[19]，稍作改進。具體步驟如下：挑取蚜蟲于離心管中，加入20 μL TNES提取緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，pH值為7.5，400 mmol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，0.5% SDS），用滅菌玻璃研磨棒對蚜蟲進行研磨，并用200 μL TNES沖洗研磨棒；再加入5 μL蛋白酶K（20 mg/mL），輕搖混勻，于60 ℃水浴1 h（中間取出搖勻1次）；加入80 μL 5 mol/L NaCl，用力搖動15 s，4 ℃、14 000 r/min 離心5 min，取上清液；加入300 μL預冷的無水乙醇輕輕混勻，-20 ℃放置30 min；4 ℃、14 000 r/min離心 5 min，棄上清液；加入300 μL 75%乙醇（-20 ℃預處理）洗滌，4 ℃、14 000 r/min離心5 min，棄上清液；在室溫下干燥，然后加20 μL滅菌ddH2O，充分溶解后-20 ℃保存備用。

飽和NaCl法Ⅱ：參照馬麗濱等挑取螞蟻的飽和NaCl法Ⅱ[20]。

1.3基因組DNA純度及濃度檢測

對9種方法提取的DNA濃度和純度進行檢測。用Biowave DNA型蛋白核酸分析儀測定DNA純度和濃度。純度由D260 nm/D280 nm值確定，該值介于1.7～1.9之間時DNA純度較好，以測量值為參數確定DNA濃度。

1.4基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測

采用1%瓊脂糖凝膠（添加了0.01% GoldView I型核酸染色劑）電泳，將8.0 μL DNA、2 μL 6×Loading Buffer混勻后上樣，電泳條件為140 V，30 min，經Gel Doc凝膠成像系統（購自美國BIO-RAD公司）照相和分析。DNA的條帶無拖尾、無RNA污染，點樣孔無酚、蛋白質殘留，可用于mt-DNA CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]擴增研究。

1.5PCR 擴增及檢測

參照張帆使用的棉蚜CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]引物[14]，上游引物為CAL：5′-TAATAACGAACAGGAACAG-3′，下游引物為CAR：5′-TAGTTGCTGATGAAGTAG-3′，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。擴增體系為50 μL：25μL Premix TaqTM（TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye），1 μL上游引物，1 μL下游引物，1 μL DNA，22 μL ddH2O。擴增程序為94 ℃預變性 2 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火50 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃終延伸10 min。PCR產物于-20 ℃保存。

PCR產物經1%瓊脂糖凝膠（添加了0.01% GoldView I型核酸染色劑）電泳檢測（140 V，30 min），上樣量為每孔 10 μL，經Gel Doc凝膠成像系統照相和分析。其中CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因在電泳中檢測到目標片段后，將40 μL擴增產物送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序，以PCR引物為測序引物，在ABI3730測序儀上進行正向測序。

2結果與分析

2.1基因組DNA純度及濃度檢測

通過9種方法提取單頭枸杞蚜蟲樣品，檢測DNA的濃度和純度，如表1所示，改進SDS法、STE精提法、Chelex粗提法提取DNA樣品濃度的平均值分別為264.33、225.00、256.67 ng/mL，D260 nm/D280 nm 平均值分別為1.73、1.84、1.73，均為高質量DNA；CTAB法、鹽析法、飽和NaCl法Ⅱ提取DNA樣品濃度的平均值分別為316.67、456.67、216.67 ng/mL，D260 nm/D280 nm平均值分別為1.94、1.94、1.90，可見DNA中有少量RNA的污染；Chelex精提法提取DNA樣品濃度的平均值為36.67 ng/mL，D260 nm/D280 nm平均值為213，說明DNA中有大量RNA的污染，DNA濃度過低；優化KAc法提取DNA樣品濃度的平均值為318.33 ng/mL，D260 nm/D280 nm平均值為1.63，說明DNA中有蛋白質或酚的污染；STE粗提法提取DNA樣品濃度的平均值為834.67 ng/mL，D260 nm/D280 nm平均值為146，說明DNA中有大量蛋白質或酚的污染。

2.2基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測

9種提取枸杞棉蚜基因組DNA方法的電泳檢測結果如圖1、圖2所示，改進SDS法、STE精提法、CTAB法、鹽析法顯示DNA主帶明顯，其中改進SDS法、STE精提法中有RNA條帶；飽和NaCl法Ⅱ條帶暗，說明濃度低；優化KAc法DNA主帶不明顯，DNA不完整，有降解；STE粗提法、Chelex粗提法、Chelex精提法均無DNA條帶， 說明STE粗提法、Chelex粗提

法提取的DNA含大量雜質，無法檢測出DNA主條帶，Chelex精提法提取的DNA濃度極低，因而無法檢測出DNA條帶。

2.3PCR擴增及檢測

按照“1.5”節中的方法進行CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]引物的特異性擴增，結果顯示，STE粗提法、Chelex精提法、飽和NaCl法Ⅱ沒有擴增到特異性條帶，而其余6個方法均擴增到目的條帶，且目的條帶清晰，如圖3、圖4所示。

2.4測序結果分析

以改進SDS法、優化KAc法、STE精提法、Chelex粗提法、CTAB法、鹽析法提取的枸杞蚜蟲的基因組DNA為模板，以CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]引物擴增的產物均能達到測序要求，獲得成功測序，

部分測序結果如圖5所示。將所測定的蚜蟲CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因序列在GenBank數據庫中進行比對，根據結果判定為棉蚜。

3討論與結論

本研究首次采用國內外9種方法對枸杞棉蚜基因組DNA[JP]提取進行了比較試驗。結果表明，改進SDS法、STE精提法、Chelex粗提法、CTAB法、鹽析法均可有效地提取枸杞棉蚜基因組DNA，并成功應用于mtDNA CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因的擴增；飽和NaCl法Ⅱ可以提取枸杞棉蚜DNA，但質量較低，在CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]擴增中不能顯示出DNA條帶；STE粗提法、Chelex精提法提取的枸杞棉蚜基因組DNA質量低，不能滿足分析的需求。

楊子祥等認為改進SDS法優于KAc法[13]，本試驗的結果[CM（25]與之一致。在用改進SDS法提取棉蚜DNA過程中，采用[CM）]

無水乙醇沉淀DNA也能制備出高質量棉蚜的DNA，滿足 CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）] 擴增需求；張帆采用優化KAc法成功提取棉蚜DNA，并滿足CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]擴增[14]，本研究采用優化KAc法提取的DNA雖能滿足CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]擴增，但提取的DNA樣品不完整，D260 nm/D280 nm 值低于165，原因可能是枸杞棉蚜較棉花棉蚜、黃瓜棉蚜體壁顏色深，該方法不能有效去除色素雜質，并且研磨時間長，導致提取的DNA樣品降解。

龔鵬等采用STE精提法需要30頭棉蚜混合制備高質量DNA[11]，而本研究用單頭棉蚜也可以提取出相同質量的棉蚜DNA，說明STE裂解液能有效釋放枸杞棉蚜的DNA，經由酚-三氯甲烷抽提可以有效去除雜質，即制備出高質量的DNA。本研究STE粗提法未能快速提取枸杞棉蚜高質量的DNA，與Gomi等的研究結果[17]不一致，Gomi等采用STE粗提法提取單頭葉螨DNA，滿足16S rDNA的分析，原因可能是STE粗提法提取枸杞棉蚜DNA時，水浴條件為37 ℃、30 min，導致蛋白質、多糖等雜質不能完全降解。是否可以通過提高水浴溫度、延長孵育時間使蛋白質等雜質完全降解，有待進一步驗證。

本研究表明，鹽析法也適用于棉蚜DNA的提取，與前人試驗結果一致，他們通過鹽析法高效地提取了大豆蚜[21]、麥長管蚜[22]、煙粉虱[23]的DNA，其中張燁等采取液氮破碎蟲體[22]，本研究改進使用滅菌玻璃研磨棒研磨蟲體，也可提取相同質量的DNA，使操作更加簡便。

采用CTAB法提取枸杞棉蚜DNA過程中，采取無水乙醇沉淀DNA無法制備高質量的DNA，與韓玉翠等的研究結果[18]一致，韓玉翠等用CTAB法提取麥長管蚜、高粱蚜DNA，認為異丙醇沉淀DNA優于無水乙醇沉淀DNA[18]。使用異丙醇沉淀DNA能否制備高質量棉蚜DNA有待進一步驗證。

胡尊瑞等采用CTAB法、飽和NaCl法Ⅱ、鹽析法提取桃蚜DNA時，認為飽和NaCl法Ⅱ優于其他方法[24]，本試驗結果與之不一致，表明飽和NaCl法Ⅱ不適用于提取枸杞棉蚜DNA，原因可能是試驗材料物種不同。

Chelex粗提法是國外常用的提取棉蚜DNA的方法，本試驗也證明Chelex粗提法能夠快速地提取高質量的枸杞棉蚜DNA。Chelex精提法，提取DNA濃度極低，不能滿足CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]分析，原因可能是Chelex-100為化學離子螯合樹脂，Chelex-100吸附DNA，經酚抽提時，DNA也進入有機相，故上層水相中無DNA。

綜上所述，在時間充裕并要求提取高產量、高質量的DNA情況下，提取枸杞棉蚜DNA建議選用改進SDS法、STE精提法；在要求減少對試驗人員毒害的前提下，建議選用鹽析法，此方法在安全性及時間方面優于改進SDS法、STE精提法；在時間緊促情況下，建議選用Chelex粗提法，該方法操作簡單，耗時最少，Chelex-100使用手冊上指出該法所獲得DNA模板保存時間較短，應在1周內使用。因此，可以根據試驗目的、試驗成本等情況綜合考慮，選取合適的枸杞棉蚜基因組DNA提取方法。

參考文獻：[HJ1.7mm]

[1]郭蕊. 柴達木枸杞蚜蟲生物學特性及種群生態學研究[D]. 西寧：青海大學，2012：57-61.

[2]Komazaki S，Toda S，Shigehara T，et al. The genetic structure of Aphis gossypii populations in Japanese fruit orchards[J]. Entomologia Experimentalis Et Applicata，2011，140（2）：171-179.

[3]張帆，劉向東. 寄主型和遷飛型棉蚜的交配行為[J]. 應用昆蟲學報，2012，49（4）：900-905.

[4]劉向東，張立建，張孝羲，等. 棉蚜對寄主的選擇及寄主?；脱芯縖J]. 生態學報，2002，22（8）：1281-1285.

[5]劉向東，翟保平，張孝羲，等. 棉花型和瓜型棉蚜形態和生態適應力的分化[J]. 昆蟲學報，2004，47（6）：768-773.

[6]Liu X D，Zhai B P，Zhang X X. Specialized host-plant performance of the cotton aphid is altered by experience[J]. Ecological Research，2008，23（5）：919-925.

[7]Carletto J，Lombaert E，Chavigny P，et al. Ecological specialization of the aphid Aphis gossypii Glover on cultivated host plants[J]. Molecular Ecology，2009，18（10）：2198-2212.

[8]Adrianaj N，Elizabetha M，Craigd H，et al. The ecological differentiation of asexual lineages of cotton aphids：alate behaviour，sensory physiology，and differential host associations[J]. Biological Journal of the Linnean Society，2009，97（3）：503-519.

[9]Nataliav I，Jeremyr D，Pauldn H. An inexpensive，automation-friendly protocol for recovering high-quality DNA[J]. Molecular Ecology Notes，2006，6（4）：998-1002.

[10]Black W C，Duteau N M，Puterka G J，et al. Use of the random amplified polymorphic DNA polymerase chain reaction （RAPD-PCR） to detect DNA polymorphisms in aphids （Homoptera：Aphididae）[J]. Bulletin of Entomological Research，1992，82（2）：151-159.

[11]龔鵬，張孝羲，楊效文，等. 用微衛星引物PCR分析棉蚜不同蚜型的DNA多態性[J]. 昆蟲學報，2001，44（4）：416-421.

[12]安瑞生，譚聲江，陳曉峰. 小型昆蟲DNA提取時勻漿方法的改進[J]. 昆蟲知識，2002，39（4）：311-312.

[13]楊子祥，陳曉鳴，馮穎，等. 蚜蟲基因組DNA提取方法的改進[J]. 昆蟲知識，2006，43（6）：880-884.

[14]張帆.寄主型和遷飛型棉蚜在交配行為mtDNA與共生菌相關基因上的分化[D]. 南京：南京農業大學，2011：26-37.

[15]Vanlerberghe‐Masutti F，Chavigny P，Fuller S J. Characterization of microsatellite loci in the aphid species Aphis gossypii Glover[J].

[KG2] Molecular Ecology，1999，8（4）：693-695.

[16]楊子祥，馮穎，陳曉鳴.一種有效的蚜蟲基因組DNA提取方法[J]. 林業科學研究，2005，18（5）：641-643.

[17]Gomi K，Gotoh T，Noda H. Wolbachia having no effect on reproductive incompatibility in Tetranychus kanzawai Kishida（Acari：Tetranychidae）[J]. Applied Entomology and Zoology，1997，32（3）：485-490.

[18]韓玉翠，呂芃，侯升林，等. 2種蚜蟲DNA提取方法的比較與改進研究[J]. 中國農學通報，2014，30（16）：272-277.

[19]Sunnucks P，England P R，Taylor A C，et al. Microsatellite and chromosome evolution of parthenogenetic sitobion aphids in Australia[J]. Genetics，1996，144（2）：747-756.

[20]馬麗濱，許升全.螞蟻DNA提取方法的研究[J]. 陜西師范大學學報，2006，34（1）：85-87.

[21]張拓，龐春杰，韓嵐嵐，等. 大豆蚜基因組DNA四種提取方法的比較[J]. 大豆科學，2013，32（4）：473-476.

[22]張燁，李克斌，尹姣，等. 幾種適合蚜蟲基因組DNA提取方法的比較研究[C]//中國植物保護學會. 中國植物保護學會2008年學術年會論文集. 北京：中國農業科學技術出版社，2008：658-661.

[23]滕希，武強，萬方浩.鹽析法提取煙粉虱基因組DNA[J]. 生物技術通報，2009（8）：166-168.

[24]胡尊瑞，吳曉云，張翌楠，等. 桃蚜DNA提取方法的研究[J]. 安徽農業科學，2013，41（33）：12823-12825.