索氏抽提法測定花生脂肪含量的方法改進

趙會芳 張習金 張永康 崔志鋼 王琨 顧昌華

摘要：為準確快速地測定花生中的脂肪含量，對花生脂肪測定進行探索與改進，在原方法的基礎(chǔ)上增加抽提前對樣品進行石油醚浸泡，設(shè)定5、8、11 h 3個浸泡時間與2、4、8 h 3個抽提時間，與不浸泡、抽提7 h的對照進行對比。對試驗結(jié)果進行精確性和準確性分析，結(jié)果表明本試驗精確度高。對各處理與對照進行t檢驗，處理1和處理4與對照差異極顯著，處理2與對照差異顯著，余下處理與對照差異不顯著且檢驗數(shù)據(jù)穩(wěn)定。結(jié)果表明，浸泡11 h抽提2 h時為最快的測定方法，其次為浸泡8 h抽提4 h，與原方法抽提7 h相比，節(jié)約了工作時間和試驗試劑，且其結(jié)果準確、可靠，能替代原方法使用。

關(guān)鍵詞：花生；石油醚提取物；脂肪含量；索氏抽提法；改進方法；縮短測定時間

中圖分類號： S565.201文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）10-0154-03

花生為世界上四大油料作物之一，脂肪和蛋白質(zhì)含量豐富，為食用蛋白質(zhì)、植物油及食品原料的重要來源。目前，我國常用的脂肪測定方法有索氏抽提法、巴布科克氏法[1]、羅斯-哥特里法、酸水解法[2]、蓋勃氏法、氯仿-甲醇提取法、近紅外光譜技術(shù)[3]和氣相色譜法[4]等，然而最常用的為經(jīng)典的索氏抽提法，具有穩(wěn)定性好、準確度高的特點，但存在測定時間過長、測定值偏小、測定數(shù)量少等不足，需不斷改進。由于有機溶劑的抽提物中除脂肪外，還含有游離脂肪酸、蠟、色素、甾醇及磷脂等類脂物質(zhì)，因而索氏提取法測定的結(jié)果只能是粗脂肪含量，即用低沸點有機溶劑（石油醚）回流抽提，把樣品中的粗脂肪去除，以樣品與殘渣質(zhì)量之差或抽提瓶反應前后之差（干燥情況下）計算粗脂肪含量。就酸水解法而言，與索氏抽提法比較的優(yōu)勢在于其操作簡便、快速、準確，不受特殊器材限制，且適用于各種類型樣品的測定[5-6]，但操作危險性較大。索氏抽提法要更好地發(fā)展還有許多有待改進的地方。

索氏抽提法從問世至今，經(jīng)過不斷的改進，方法的實用性越來越好。張儉樸等在脂肪抽提器改進和試驗中對脂肪抽提器中的紙筒進行擴大，使樣品更好地與抽提液接觸，對冷凝管進行加長改進，提高冷凝效果，也提升了抽提回流速度[7]。馮慧等對濾紙筒的大小進行調(diào)整，在樣品中加入1 ∶[KG-*3]1的海沙，并用蒸汽進行加熱，能較好地縮短抽提時間，但海沙必須潔凈以及蒸汽溫度不易控制，致使這個方法后面只采用對濾紙筒的改進[8]。嚴映德等對樣品測定前，先將樣品打磨粉碎，粉碎后再烘干，這樣打磨時細胞里還有水分，不會產(chǎn)生凝塊以及滲油現(xiàn)象[9]。該方法開始的抽提液為乙醚，對人體傷害大且為易制毒化學品，與空氣混合會發(fā)生爆炸，危險性極大。在脂肪測定教學中的影響因素及改進方法中，羅有文等對乙醚進行替換，改用不易揮發(fā)、沸點低和安全性較高的石油醚[10]。在魏紅等的索氏抽提法測定粗脂肪含量的改進[11]和王玉玲等的索氏抽提法測定粗脂肪含量方法的探討[12]等文章中，對脂肪測定的計算方法進行探索，得出抽提瓶抽提前后的質(zhì)量差和抽提前后濾紙包質(zhì)量差為樣品脂肪含量，這樣可免去對抽提瓶的重復清洗工作，且可與原方法替代使用。鐘艷梅等在脂肪抽提時，增加了抽提樣品數(shù)量，由原來的1個樣品增加到3個，大大提高了工作效率[13]。在張江榮等的食品中粗脂肪測定方法的改進研究一文中，對樣品用抽提液浸泡過液，抽提時間有所縮短，但未作出具體時間的測定[14]。目前，隨著索氏抽提法的不斷完善，相應的抽提儀器隨之出現(xiàn)，如SZC-C型和ST-06C型等，為脂肪測定的研究提供了便利，大大加快了對脂肪含量方面的研究進展。

前人對索氏抽提法進行的改進均未涉及到花生脂肪的測定，而花生產(chǎn)量為四大油料作物之首，占有很大的市場前景。測定花生的脂肪含量能為花生加工、自身品質(zhì)提供衡量的依據(jù)。本研究通過提前對樣品進行浸泡處理，隨浸泡時間不同而不同程度縮短抽提時間，達到縮短測定時間的目的，保護實驗者自身安全，減少資源浪費和保護環(huán)境，對花生和油料作物脂肪測定有很好的理論和實際意義。

1材料與方法

1.1試驗材料

黔花生4號，源于貴州省農(nóng)作物品種資源研究所。

1.2主要儀器與試劑

ST-06C型脂肪測定儀、干燥箱、干燥器、電子天平（感量0.000 1 g）、實驗用打磨機、石油醚（沸程60～90 ℃）。

1.3試驗設(shè)計

本試驗設(shè)置2、4、6 h 3個不同的抽提時間，對抽提前花生用石油醚進行浸泡，設(shè)置5、8、11 h 3個浸泡時間，共9個處理，以不浸泡抽提7 h為對照，重復3次。試驗設(shè)計見表1。

1.4試驗方法

無病斑、飽滿的花生仁，再用四分法對花生樣品進行篩選取樣。

1.4.2試驗前處理

每個處理稱取10 g裝入鋁盒放入干燥箱中在105 ℃下干燥7 h，在干燥器中冷卻30 min后稱質(zhì)量，再烘干30 min后稱質(zhì)量，2次質(zhì)量之差小于0.000 8 g為恒質(zhì)量[15]。進行粉碎，稱取2～3 g樣品（準確至0.000 2 g，記作m），用濾紙（直徑12.5 cm）折疊包上（記作m1），再用鉛筆編上序號。

1.4.3測定步驟

將包好的濾紙包放入棕色瓶中，加入石油醚使溶液高出濾紙包1～2 cm，按不同處理時間浸泡。浸泡完成后將濾紙包放入吊籃中，每個吊籃放2個[16]，在抽提瓶中加入50 mL石油醚。連接好抽提器各部分，打開冷凝水水流，調(diào)節(jié)水溫在80 ℃，打開石油醚回流開關(guān)，待水溫升至 80 ℃ 開始計時，抽提時間按設(shè)計要求控制。抽提完畢后，用鑷子取出濾紙包，在通風處使石油醚揮發(fā)10～15 min，放入105 ℃干燥箱中干燥2 h，冷卻至恒質(zhì)量（記作m2），對抽提瓶中石油醚進行繼續(xù)加熱，再冷凝回收。

1.4.4結(jié)果計算

[JZ]粗脂肪含量=（m1-m2）/m×100%。

2結(jié)果與分析

2.1抽提時間對測定脂肪含量的影響

由表2中平均值和圖1可知，隨著抽提時間的延長，測定脂肪含量增加，抽提2～4 h時測定的脂肪含量增速最快。抽提時間為2 h時脂肪含量平均值最小，為51.38%；抽提6 h時平均值最大，為54.87%。抽提2～6 h，脂肪含量與抽提時間呈正相關(guān)，抽提6 h后脂肪含量保持穩(wěn)定。

2.2浸泡時間與測定脂肪含量的關(guān)系

隨浸泡時間的延長，脂肪含量增加，浸泡5～8 h的脂肪含量增加最快。在浸泡5 h時最大相對偏差最高，達到 7.69%；浸泡8 h次之，為2.86%；浸泡11 h為0.08%，測定

值最穩(wěn)定（表2）。從圖2中可知，隨浸泡時間延長，3個抽提時間下的脂肪含量接近相等，且趨近于對照，在浸泡11 h后脂肪含量基本不變，近似相等于對照，此時脂肪含量最大，為55.04%。

2.3改進法的精密度

對改進法的精密度進行試驗比較分析（表3），改進法各處理的標準差最大為0.90%，最小為0.42%，且變異系數(shù)最大為1.91%，最小為0.60%，表明試驗結(jié)果的離散程度不大。試驗結(jié)果表明，改進法的重現(xiàn)性好，方法的精密度高。

2.4改進法的準確性

通過對不同處理進行脂肪測定，將不同處理與原方法（CK）配對進行t檢驗，結(jié)果如表4所示，其中t（2，0.05）=4.303，t（2，0.01）=9.925，處理1和處理4與原方法（CK）差異極顯著，處理2與原方法差異顯著，處理3、處理5、處理6、處理7、處理8、處理9與原方法差異不顯著，其中處理3與原方法差異最小，處理6次之。差異不顯著的幾個處理整體穩(wěn)定性較好，數(shù)據(jù)波動不大。

3結(jié)論

3.1方法改進的效果

本試驗花生含水量為12.84%，為自然風干花生，對試驗結(jié)果基本無影響，且在李正強等高產(chǎn)高油花生新品種黔花生4號的選育中測出的黔花生4號脂肪含量范圍[17]內(nèi)。抽提 6 h 時抽提瓶中冷凝回收的石油醚顏色正常，則粗脂肪已完全提取[18]，說明在測定的脂肪含量不變的情況下，浸泡時間的延長能縮短抽提時間。在原方法的基礎(chǔ)上增加浸泡的步驟，能大大縮短抽提時間。本試驗中當浸泡11 h、抽提時間 2 h 時為最快，其次為浸泡8 h、抽提4 h，分別縮短了5 h和 3 h 的抽提時間。而在浸泡過程中無需管理，通過對試驗時間的合理安排，能明顯提高工作效率，在抽提過程中石油醚會發(fā)生揮發(fā)，本方法減少了石油醚的揮發(fā)量，提高了回收率，減少了能源的消耗。通過試驗驗證，改進法的精確度較高，與原方法的測定結(jié)果差異不顯著，可靠性高。

3.2方法改進的優(yōu)點及操作注意事項

改進法的優(yōu)點可歸納為節(jié)省時間、減少檢測工作量、節(jié)約試劑、減少試劑損失和環(huán)境污染幾點，原方法未進行試樣浸泡，抽提時間比用石油醚浸泡11 h的多用5 h，改進法采用每個抽提瓶2個濾紙包，在原來測定量的基礎(chǔ)上翻了1倍，且在測定樣品粗脂肪前，對樣品進行烘干處理，樣品中不含水分，可以加快石油醚進入樣品內(nèi)部的速度，使脂肪全部抽提出來的抽提時間縮短明顯；改進法在抽提結(jié)束后對濾紙包進行干燥處理，避免干燥除去溶劑時的脂肪氧化問題，提高結(jié)果測定的精密度以及工作效率；隨著溫度升高，回流冷凝的效果變差，抽提時間越長石油醚浪費越多，而石油醚對人體眼睛、黏膜和呼吸道有刺激性，對皮膚有強烈刺激性，對環(huán)境造成污染?？s短抽提時間既減少試劑浪費，也減少環(huán)境污染以及對人體的傷害，提高了本試驗的安全性；石油醚的揮發(fā)量明顯降低，且對冷凝回流的流動水使用量減少2/3還要多；測定樣品時，在7 h的情況下，原方法只能測定1次，而改進方法能測定3次以上，大大縮短了測定時間，提高工作效率。

在試驗過程中應該注意，整個測定過程中應戴上手套和口罩，避免手上油脂影響試驗結(jié)果和石油醚的揮發(fā)對人體呼吸道的刺激；稱樣量不宜過多，且濾紙應選中號（11 cm），濾紙包應包嚴實，避免浸泡時間過長而散開，且保證濾紙包能放入抽提管中的吊籃內(nèi)且不滑落；抽提結(jié)束后取濾紙包時，不能弄破濾紙，以保證試驗的準確性；在環(huán)境條件要求上，樣品與濾紙應在105 ℃下烘干7 h，當室內(nèi)濕度過大時（大于60%），為提高試驗準確度，對天平添加干燥試劑，其他稱量工具進行干燥處理，且稱量過程應嚴格規(guī)范；在脂肪測定過程中，對不同處理間的脂肪含量會有所影響，測定時應將不同處理分開測定；為保證石油醚在樣品中的滲透速度一致和快速，對樣品打磨時應充分均勻，必要情況下應將樣品過篩。

3.3討論

在張江榮等的食品中粗脂肪測定方法的改進研究[14]一文中，對大豆進行浸泡過夜再抽提的試驗結(jié)果表明，浸泡過夜后能縮短抽提時間4 h，縮短時間也比較明顯，與本試驗結(jié)果較為一致。但從其文章中可知，大豆的脂肪含量低于花生，改進后的抽提時間卻為6 h，明顯高于本研究的抽提時間。這可能是因為在本研究中花生抽提時間為6 h時，浸泡時間為 5 h，而其文內(nèi)只是提到浸泡過液，浸泡時間不具體；溫度和對樣品的處理方式也是影響滲入樣品速度的主要因素，浸泡效果與其有直接關(guān)系，而其浸泡時溫度不明確，本研究則控制到室溫。本研究對樣品先打磨成粉狀再干燥，能增加浸泡的效果；花生自身的結(jié)構(gòu)和內(nèi)部物質(zhì)與大豆有所區(qū)別，就如花生含有花生四烯酸，大豆含有亞油酸、亞麻酸，這幾類物質(zhì)都在抽提測定的粗脂肪中，而相互不含有，這幾類物質(zhì)可能也是影響抽提速度的原因之一。在抽提前對樣品先進行浸泡的相關(guān)研究中，均達到了縮短測定時間、提升工作效率的效果，可以看出浸泡也是對樣品的一個緩慢抽提，對脂肪抽提有重要作用。

油料作物有花生、大豆、油菜、芝麻和棉籽等，種類繁多，為植物油的市場主導。為加快對各種油料作物脂肪含量的研究，提高工作效率是重要因素，而本研究因時間、設(shè)備和種質(zhì)資源等有限，只對花生進行了初步研究。而其他油料作物可采取本研究的試驗方法，但上文中花生與大豆就有一定的差別，在本研究的基礎(chǔ)上，還需進行更進一步的研究，以此來發(fā)展我國的油料作物在經(jīng)濟市場的地位。

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