14-3-3σ基因表達下調促進腎癌細胞增殖

仇煒 沈永青 張愛莉

·論著·

14-3-3σ基因表達下調促進腎癌細胞增殖

仇煒 沈永青 張愛莉

目的 檢測14-3-3σ在腎癌(renal cell carcinoma,RCC)及相應正常腎組織(normal tissue,NT)中的mRNA及蛋白表達情況，探討14-3-3σ在RCC中的作用及其作用機制。方法 隨機選擇47例經腎腫瘤根治性手術治療的腎癌患者，提取腎癌組織及正常腎組織mRNA及蛋白，使用RT-PCR法檢測腎癌及正常腎組織中14-3-3σ mRNA的表達情況，使用Western blot方法檢測14-3-3σ蛋白在腎癌及正常腎組織中的表達水平，統計腎癌組織及正常腎組織中14-3-3σ基因的表達差異。轉染腎癌786-O細胞，分別使用質粒過表達或siRNA敲低14-3-3σ基因的表達，使用CCK-8法檢測786-O細胞在過表達和敲低14-3-3σ基因后的增殖變化。結果 腎癌組織較正常腎組織14-3-3σ基因mRNA表達水平明顯降低(P<0.01)，且該基因在腎癌組織中的蛋白表達水平也較正常腎組織明顯降低 (P<0.01)。在786-O細胞內過表達14-3-3σ基因能夠明顯抑制786-O細胞的增殖(P<0.05)，敲低該基因的表達能夠明顯促進786-O細胞增殖(P<0.01)。結論 腎癌組織較正常腎組織14-3-3σ基因的表達水平明顯下降，14-3-3σ與腎癌細胞的增殖有關。

腎腫瘤；14-3-3σ；增殖；RT-PCR

腎癌是泌尿系統最常見的惡性腫瘤之一。全球每年有超過350 000人的新發腎癌病例，占惡性腫瘤發病率的第7位，每年超過140 000人因腎癌而死亡[1]。隨著我國人口老齡化、環境因素、生活方式和飲食結構的改變，腎癌的發病率呈現逐年上升的趨勢。在我國，腎癌的5年患病率(2006至2011年)已上升至所有惡性腫瘤的第11位[2]。盡管目前已有多種治療手段用于晚期腎癌患者的治療，但其療效對于不同患者往往有較大差異，還有許多問題尚未解決。14-3-3蛋白是一類廣泛存在于真核生物細胞的高度保守蛋白，通過與靶蛋白相互作用，14-3-3蛋白能夠改變其活性、構型及胞內定位，參與調控多種細胞內的信號轉導[3]。14-3-3蛋白的主要功能可以劃分為兩方面：一、細胞周期調控及凋亡；二、細胞內蛋白質的轉運，該蛋白對于細胞維持其正常生理功能具有重要的作用和意義[3,4]。14-3-3蛋白家族具有多種亞型，目前已經發現了10個以上的該蛋白家族成員。在這些14-3-3蛋白家族成員中，14-3-3σ蛋白與腫瘤的關系最為密切，可能是潛在的抑癌基因，具有一定的臨床應用前景[5]。已有研究證實，14-3-3σ蛋白在結腸癌[6]、食管癌[7]、膀胱癌[8]、肝癌[9]等多種惡性腫瘤中表達水平發生了改變，并進一步參與了腫瘤的發生與治療抵抗，而該基因在腎癌中的表達情況尚不十分清楚。基于此，本研究擬從腎癌患者入手，檢測患者腫瘤及對應正常腎組織中14-3-3σ基因及蛋白的表達水平，并從細胞水平探討該基因對腎癌細胞增殖的作用，為進一步明確14-3-3σ基因與腎癌的關系提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 腎癌患者隨機取自于2015年6月至2016年7月在河北醫科大學第四醫院泌尿外科住院患者47例，其中男34例，女13例；年齡40～82歲，平均年齡 (61.5±8.5) 歲。所有患者經腎腫瘤根治性切除術，術后病理均證實為腎透明細胞癌，所有病例術前均未接受任何化學及放射治療。取材標準如下：(1)癌組織：患者于術后切取的腫瘤組織標本；(2)正常組織：距離癌組織5 cm以上的腎組織。患者均于術后即刻采集腎癌及正常腎組織，取材后立即保存于液氮中備用。本研究遵循倫理學標準并得到河北醫科大學第四醫院倫理委員會批準及受試者的知情同意。

1.2 實驗試劑 人腎透明細胞癌786-O細胞系購自國家實驗細胞資源共享平臺；反轉錄試劑盒購買自寶生物工程(大連)有限公司，PCR試劑及DEPC水購買自北京康為世紀生物科技有限公司，本研究所使用引物均由上海生工生物工程技術公司提供。14-3-3σ真核細胞過表達載體pcDNA3.1-14-3-3σ質粒及14-3-3σ siRNA購自上海吉瑪制藥技術有限公司；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；RPMI-1640培養基、胎牛血清、PBS、Opti-MEM培養基、胰蛋白酶為美國Gibco公司產品；CCK-8購自日本東仁化學研究所；鼠抗14-3-3σ抗體、鼠抗β-actin抗及羊抗鼠二抗體購自美國Abcam公司。

1.3 方法

1.3.1 RNA提取、RT-PCR及PCR擴增:采用Trizol法提取組織總RNA，取30-50mg組織置于玻璃均漿器中，加入1 ml Trizol后研磨，研磨至組織破裂后，離心取上清，加入氯仿抽提，離心取上清，加入異丙醇充分混勻后離心，棄上清，70%乙醇洗滌，晾干后DEPC水充分溶解，紫外分光光度計測定RNA的濃度及純度。取等量RNA，依照反轉錄試劑盒說明使用配置反應體系，進行反轉錄。反轉錄后取等量cDNA分別使用14-3-3σ及β-actin引物進行PCR擴增，引物序列如下：14-3-3σ上游引物GAGCGAAACCTGCTCTCAGT，下游引物CTCCTTGATGAGGTGGCTGT；β-actin上游引物CCTTCCTGGGCATGGAGTCCTG，下游引物GGAGCAATGATCTTGATCTTC。PCR反應體系為20 μl，包括1 μl逆轉錄產物，上下游引物 (10 pmol) 各取1 μl，dNTP (2.5 mmol/L) 1 μl，10×PCR反應緩沖液2 μl，Taq DNA聚合酶 (5 U/μl) 0.2 μl，無菌水補齊至20 μl。PCR擴增條件：95℃預變性3 min，95℃變性15 s，58℃退火15 s，72℃延伸20 s，37個循環。37個循環結束后，72℃再延伸6 min，擴增片段長度為213 bp。以β-actin為內參照，擴增長度為202 bp。PCR產物電泳分離后，掃描成像，用凝膠成像分析系統進行密度分析。

1.3.2 Western blot:組織從液氮中取出，切取30～50 mg 組織塊放入RIPA裂解液，用電動勻漿器冰上研磨組織，直至無肉眼可見組織為止，裂解后離心取上清，使用BCA法進行蛋白定量，并按比例加入SDS 上樣緩沖液至終濃度為1×，沸煮變性，取等量蛋白上樣進行SDS-PAGE電泳，之后將蛋白300 mA恒流電轉移至硝酸纖維素膜上，根據所需檢測蛋白分子量不同，轉膜時間在1～1.5 h不等。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST溶液漂洗數次后，分別使用鼠抗14-3-3σ及鼠抗β-actin一抗4℃下孵育過夜，一抗封閉濃度均為1∶1 000。次日TBST洗膜后，用辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗室溫封閉1 h，二抗封閉濃度為1∶5 000，TBST洗膜數次后，使用ECL化學發光法及化學發光儀(美國Bio-rad公司)檢測蛋白表達，并拍照存檔。

1.3.3 質粒的轉染:786-0細胞傳代，待細胞生長至70%～80%匯合時進行質粒轉染操作。轉染前日把細胞培養基換為無血清、無抗生素的細胞培養基培養。依照Lipofectamine 2000使用說明將質粒轉染入細胞。37℃培養箱內培養6 h，去掉轉染培養基。并更換為含1%胎牛血清的細胞培養基。轉染后48 h進行后續實驗。

1.3.4 siRNA的轉染:786-O細胞傳代生長至40%～50%匯合時進行siRNA轉染操作。首先把細胞培養基換為無血清、無抗生素的細胞培養液培養24 h，按Lipofectamine 2000使用說明將siRNA轉染入細胞，siRNA轉染的終濃度為100 nmol/L。轉染后48 h進行后續實驗。

1.3.5 CCK-8細胞增殖試驗:選擇對數生長期的細胞，消化并吹打成單細胞懸液，96孔板每孔接種100 μl細胞懸液，約6 000個細胞/孔，置37℃、5% CO2培養箱內培養，待細胞貼壁后，依不同分組分別轉染入pcDNA3.1-14-3-3σ過表達質粒及對照質粒，或14-3-3σ siRNA及對照siRNA，48 h 或72 h后每孔分別加入10 μl CCK-8，置于細胞培養箱內繼續孵育，2 h后終止反應，450 nm酶標儀比色測定吸光度值(OD值)。按如下公式計算增殖抑制率：細胞增殖抑制率(%)=(對照組OD值-試驗組OD值)/對照組OD值×100%。

2 結果

2.1 腎癌及相應正常腎組織中14-3-3σ mRNA的表達情況 將臨床收集的腎癌及正常腎組織標本的總RNA使用Trizol法提取，之后應用反轉錄試劑盒，依照試劑盒說明對所獲取組織總RNA進行RT-PCR實驗，獲得cDNA，以之為模板，分別使用14-3-3σ及β-actin的引物進行PCR擴增，各組PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后拍照存檔并進行光密度掃描分析。在47例腎癌患者中，37例患者癌組織(RCC)14-3-3σ基因mRNA表達水平較自身正常腎組織(NT)降低(37/47)，占總病例數的78.7%。而其他10例患者腎癌組織(RCC)中14-3-3σ基因的表達與相應正常腎組織(NT)相比變化不明顯。在本研究所采集的47例腎癌患者標本中，腎癌組織14-3-3σ基因mRNA表達強度為 (0.24±0.06)，而相對應的正常腎組織中14-3-3σ基因mRNA的表達強度為(0.59±0.16)。對上述結果進行統計，結果顯示腎癌組織與正常腎組織相比14-3-3σ基因mRNA表達水平顯著降低，結果有統計學意義 (P<0.01)。見圖1A～B，表1。

圖1 腎癌組織(RCC)及相應正常腎組織(NT)中14-3-3σ mRNA的表達水平

注：A 14-3-3σ mRNA在腎癌組織及相應正常腎組織中的表達量(結果未完全展示);B 14-3-3σ mRNA在腎癌組織及相應正常腎組織中表達情況的統計圖

2.2 腎癌組織及相應正常腎組織中14-3-3σ蛋白的表達情況 對本研究所取47例患者的腎癌組織及相應正常腎組織使用RIPA裂解液裂解后，使用Western blot法檢測14-3-3σ蛋白的表達情況，結果同14-3-3σ mRNA的表達情況相類似，14-3-3σ蛋白在腎癌組織(RCC)中表達較對應正常腎組織(NT)明顯下降，在47例腎癌患者中，35例患者腎癌組織(RCC)14-3-3σ蛋白的表達水平較自身正常腎組織(NT)降低(35/47)，占總病例數的74.5%，12例患者腎癌組織(RCC)中14-3-3σ蛋白的表達與相應正常腎組織(NT)相比無明顯變化(圖2A)。14-3-3σ蛋白在腎癌組織中的表達強度為 (0.33±0.08)，而在相應的正常腎組織中的表達強度為(0.71±0.13)。差異有統計學意義(P<0.01)。見圖2A～B，表2。

組織14-3-3σmRNA表達量腎癌組織 0.24±0.06正常腎組織0.59±0.16*

注：與腎癌組織比較，*P<0.05

圖2 腎癌組織(RCC)及對應正常腎組織(NT)中14-3-3σ蛋白的表達水平

注：A 14-3-3σ蛋白在腎癌組織及相應正常腎組織中的表達量(結果未完全展示);B 14-3-3σ蛋白在腎癌組織及相應正常腎組織中表達情況的統計圖

表2 腎癌組織及相應正常腎組織中14-3-3σ蛋白的表達情況 ±s

注：與腎癌組織比較，*P<0.05

2.3 過表達14-3-3σ基因后腎癌786-O細胞的增殖變化 為了進一步明確14-3-3σ基因在腎癌中的作用，我們使用14-3-3σ基因的過表達載體pcDNA3.1-14-3-3σ在腎透明細胞癌786-O細胞中過表達14-3-3σ基因，之后檢測了786-O細胞的增殖變化。在過表達該基因48 h及72 h后，14-3-3σ蛋白的表達量出現了明顯上升，說明過表達有效。之后我們使用CCK-8法檢測了786-O細胞的增殖活力，結果發現過表達14-3-3σ基因48 h及72 h后，786-O細胞的增殖受到了明顯的抑制(P<0.05)。上述結果說明14-3-3σ基因在腎癌中與腫瘤細胞的增殖有關，腎癌中該基因表達的上調能夠抑制腎癌細胞的增殖。見圖3A～B，表3。

圖3 786-O細胞過表達14-3-3σ基因后細胞的增殖變化情況

注：A 14-3-3σ基因過表達質粒轉染786-O細胞后過表達效果驗證圖;B 14-3-3σ基因過表達后786-O細胞增殖活力顯著下降

時間對照組過表達組48h1.000±0.0740.901±0.018*72h1.000±0.0510.775±0.082#

注：與對照組比較，*P<0.05，#P<0.01

2.4 敲低14-3-3σ基因后腎癌786-O細胞的增殖變化 上述結果證明14-3-3σ能夠抑制腎癌786-O細胞的增殖，為了進一步明確14-3-3σ基因對腎癌增殖的影響，我們再次在腎癌786-O細胞中，使用siRNA敲低14-3-3σ基因后檢測該細胞的增殖變化。在使用si 14-3-3σ轉染786-O細胞48 h及72 h后，14-3-3σ蛋白的表達量明顯下降，說明該siRNA能夠有效的敲低靶基因，敲低效果良好。之后我們使用CCK-8法檢測了敲低14-3-3σ基因后786-O細胞的增殖活力，發現敲低14-3-3σ(48 h、72 h)基因能夠顯著促進786-O細胞的增殖 (P<0.01)。上述結果說明14-3-3σ蛋白能夠調控腎癌細胞的增殖，腎癌中該基因表達的下調能夠顯著促進腎癌細胞增殖。見圖4A～B，表4。

圖4 786-O細胞敲低14-3-3σ基因后細胞的增殖變化情況

注：A 14-3-3σ基因siRNA轉染786-O細胞后敲低效果驗證圖;B 14-3-3σ基因敲低后786-O細胞增殖活力顯著上升(**P<0.01)

時間對照組敲低組48h1.000±0.0761.108±0.006*72h1.000±0.1030.235±0.048*

注：與對照組比較，*P<0.01

3 討論

研究表明,14-3-3σ蛋白是一種重要的細胞周期調控蛋白，它能夠抑制Cdc/cyclin B1復合體的功能，促使細胞停滯在G2期[10]。越來越多的研究表明，在多種實體腫瘤中，14-3-3σ蛋白的表達明顯下降甚至缺失，如直腸癌[11]、乳腺癌[12]及卵巢癌[13]等，我們在腎癌組織中進行的檢測結果與上述結果一致，該基因的表達量在腎癌組織中呈明顯下降的趨勢。然而，也有一些相反的研究結果報道，如在胃癌[14]、頭頸部鱗狀上皮癌[15]及胰腺癌[16]組織中，該蛋白的表達卻呈明顯上升。因此14-3-3σ基因的功能可能在不同種類的腫瘤中存在差異，需要進一步的研究和明確。14-3-3σ基因也與腫瘤的化療耐藥有著密切的關系，14-3-3σ參與胰腺癌細胞對吉西他濱的耐藥，該蛋白也乳腺癌細胞對多西他賽的耐藥有關[17,18]。近年來的研究結果也表明14-3-3σ蛋白還參與了腫瘤細胞代謝譜的重編程[19]，同時在腫瘤的放療抵抗、轉移和侵襲中發揮著重要的作用[20-22]。這些研究的發現表明14-3-3σ蛋白與腫瘤的關系十分密切，在腫瘤中的作用多樣。14-3-3σ蛋白與腎癌的關系目前研究較少，已有的研究表明，腎癌組織中14-3-3σ基因啟動子CpG區高度甲基化，進而導致14-3-3σ基因的表達下調，甚至造成該基因的表達缺失，而該基因亦可在癌旁組織及正常腎組織中出現高甲基化從而使癌旁組織或正常腎組織14-3-3σ基因表達下降或缺失[23]。本研究中，我們發現腎癌組織中14-3-3σ基因的表達水平較正常腎組織明顯降低 (P<0.01)，有78.7%的患者腫瘤組織14-3-3σ基因mRNA表達較正常腎組織降低，且14-3-3σ蛋白在腎癌組織中的表達水平也較正常腎組織呈降低的趨勢，其表達量差異較為明顯。有2例患者的腎癌14-3-3σ mRNA表達量明顯降低，但是蛋白水平未出現明顯變化，推測可能與基因的轉錄后調控有關。為了進一步說明該基因在腎癌中的作用，我們繼續在腎透明細胞癌786-O細胞中過表達14-3-3σ基因后進行實驗發現，14-3-3σ能夠明顯抑制786-O細胞的增殖，而在786-O細胞中敲低14-3-3σ基因的表達后，得到了與之前相反的變化，腎癌細胞的增殖明顯加快。上述結果說明14-3-3σ基因表達水平的變化在腎癌的發病機制中起到了重要作用，14-3-3σ參與了腎癌細胞的增殖調控，該基因的表達下調或缺失可能是腎癌發生發展的重要因素，14-3-3σ可能是腎癌的潛在抑癌基因，有望成為腎癌臨床診斷和治療的新靶點，針對該基因進行相應研究、開發和利用，有益于進一步開拓思路，促進腎癌的診斷和治療。

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Effects of down-regulation of gene expression of 14-3-3σ on proliferation of renal cancer cells

QIUWei*,SHENYongqing,ZHANGAili.

*DepartmentofUrinarySurgery,BeijingFriendshipHospital,Beijing100050,China

Objective To investigate the expressions of 14-3-3σ in renal cell carcinoma tissues (RCC) and in normal renal tissues (NT),and to explore the role of 14-3-3σ and its action mechanism in RCC.Methods Forty-seven patient with renal cancer who enderwent radical nephrectomy were enrolled in the study. The RNA and protein were extracted from RCC tissues and normal renal tissues,and the expression levels of 14-3-3σ were detected by RT-PCR and Western blot, respectively. The changes of cell proliferation were detected by CCK-8 assays in 786-O cells after overexpression or knockdown of gene expressions of 14-3-3σ.Results As compared with those in normal renal tissues,the expression levels of 14-3-3σ mRNA and protein in renal cancer tissues were significantly decreased (P<0.01),moreover, the overexpression of 14-3-3σ gene could significantly inhibit the proliferation of 786-O cells (P<0.05),however, the knockdown of 14-3-3σ gene expression could increase the cell proliferation (P<0.01).Conclusion The expression levels of 14-3-3σ gene are significantly down-regulated in RCC tissues,which may be correlated to the the proliferation of renal cancer cells.

renal carcinoma; 14-3-3σ; proliferation; RT-PCR

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.14.001

100050 北京市，首都醫科大學附屬北京友誼醫院泌尿外科(仇煒)；河北中醫學院護理學院(沈永青)；河北醫科大學第四醫院泌尿外科(張愛莉)

張愛莉，050011 石家莊市，河北醫科大學第四醫院泌尿外科;

E-mail: youyiminiao@126.com

R 737.11

A

1002-7386(2017)14-2085-05

2017-02-09)