磷酸肌酸對小鼠移植性S180肉瘤血管生成的作用及機制研究

韓文峰 魏素菊 鄭亞珍

·論著·

磷酸肌酸對小鼠移植性S180肉瘤血管生成的作用及機制研究

韓文峰 魏素菊 鄭亞珍

目的 探討磷酸肌酸(creatine phosphate,Cp)對小鼠移植性S180肉瘤血管生成的作用及其相關機制。方法 建立昆明小鼠S180肉瘤模型，60只小鼠隨機分為4組：0.9%氯化鈉溶液對照組(對照組)、Cp低劑量組(200 mg/kg)、Cp中劑量組(400 mg/kg)、Cp高劑量組(800 mg/kg)，觀察4組小鼠移植瘤重量；流式細胞術測定基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)及金屬蛋白酶組織抑制因子-2(tissue inhibitors of metalloproteinases,TIMP-2)蛋白的表達；免疫組化檢測腫瘤組織微血管密度(microvasvular density，MVD)；RT-PCR檢測移植瘤組織中血管內皮生長因子(vascular endothlial growth factor,VEGF)及堿性成纖維細胞生長因子(base fibroblast growth,bFGF)mRNA的表達水平。結果 對照組、Cp低劑量組和中劑量組移植瘤重量、VEGF、bFGFmRNA、MMP-2、TIMP-2水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；Cp高劑量組與對照組、Cp低、中劑量組比較，小鼠移植性肉瘤質量明顯減小，MVD數顯著減少，VEGF、bFGFmRNA和MMP-2蛋白表達明顯減少，TIMP-2蛋白表達明顯增加，差異均有統計學意義(P<0.01)。結論 Cp低、中劑量對腫瘤血管生成無明顯影響；Cp高劑量對腫瘤血管生成具有明顯的抑制作用，其機制可能與通過下調MMP-2、VEGF和bFGF、上調TIMP-2的表達水平有關。

磷酸肌酸；S180肉瘤；血管內皮生長因子；堿性成纖維細胞生長因子；微血管密度

磷酸肌酸(creatine phosphate,Cp)是細胞內的一種高能磷酸化合物，用于三磷酸腺苷的再合成，在心肌細胞缺血缺氧時為其提供能量,保護心肌細胞膜免受氧自由基等有害物質的侵襲[1,2]。Cp還可以透過細胞膜抑制膜通透，改變孔道的開放，保護線粒體，減少細胞凋亡。此外，Cp還可以提高左心室射血分數，改善心功能，增加冠狀動脈流量，改善冠狀動脈循環。目前，Cp不但應用于體外循環手術中，還應用于治療心力衰竭、心肌梗死、心律失常、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病，因此保持心肌細胞Cp及三磷酸腺苷等高能磷酸化合物水平可以減輕各種原因對心肌細胞的損害[3,4]。化療是治療惡性腫瘤的主要方法之一，但化療藥物的心臟毒性極大限制了其臨床應用，理論上可以使用Cp、三磷酸腺苷等高能磷酸化合物預防化療藥物的心臟毒性。但Cp對腫瘤生長具有促進或抑制作用還未見相關基礎實驗報道。本實驗通過Cp對小鼠移植性S180肉瘤血管生成的作用及可能機制進行初步探討，如果其無促進腫瘤血管生成的作用，則可在化療時應用Cp保護心肌，減輕化療藥物的心臟毒性，提高化療療效及耐受性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 Cp由海南海口奇力制藥有限公司提供，臨用時配制，用0.9%氯化鈉溶液溶解配成質量濃度為16 mg/ml，再用.9%氯化鈉溶液稀釋至所需濃度。RT-PCR試劑盒為Fermentas公司產品，引物為上海生物工程公司產品，Rabbit Anti-Ⅷ Factor多克隆抗體(克隆系：bs-0434R)為北京博奧森公司產品。RPMI1640培養液購自GIBCO公司，小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.2 細胞株與實驗動物 S180肉瘤細胞株由河北醫科大學第四醫院科研中心傳代培養，接種細胞于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中(青霉素、鏈霉素各100 U/ml)，培養器皿置于37℃含有5%CO2的細胞培養箱中昆明小鼠購自河北省實驗動物中心[動物許可證編號：SCXK(冀)2012-1-003]。8周齡，雄性，體重18～22 g，飼養于SPF級實驗室。

1.3 荷瘤鼠模型建立 小鼠肉瘤S180瘤株，腹腔傳代接種，將接種7 d后腹水形成滿意的肉瘤小鼠脫頸椎處死，置75%的乙醇浸泡5 min消毒，無菌操作抽取腹水(乳白色黏稠液體)，加入0.9%氯化鈉溶液，1 000 r/min，離心5 min，傾出上清液，如此反復洗滌3次。臺盼藍染色并計數，將腫瘤細胞用0.9%氯化鈉溶液調整成濃度為1×107/ml，活細胞數98%以上，符合接種要求。取60只小鼠，每只右腋皮下注射0.2 ml(含2×106個瘤細胞)S180肉瘤細胞懸液。24 h后開始腹腔注射用藥，將60只昆明小鼠按隨機分組方法分為4組，0.9%氯化鈉溶液對照組(對照組)、Cp低、中、高劑量組，每組15只，共4組。低、中、高劑量組分別予以磷酸肌酸鈉注射液200、400、800 mg/kg腹腔注射，對照組予以0.9%氯化鈉溶液，每只0.2 ml，連續給藥7 d，第10天脫頸椎法處死小鼠，剝取瘤體稱重，按公式計算抑瘤率：抑瘤率=(對照組平均瘤重-試驗組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100%。將部分標本固定于70%乙醇，用于流式細胞術檢測；部分標本液氮保存，用于分子生物學檢測；部分固定于10%甲醛溶液，用于免疫組織化學檢測。

1.4 流式細胞術檢測腫瘤細胞基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、金屬蛋白酶組織抑制因子-2(tissue inhibitors of metalloproteinases,TIMP-2)蛋白的表達 網搓法制備單細胞懸液，取0.1 ml 單細胞懸液(含1×106個細胞)，分別加入1∶100 稀釋的MMP-2和TIMP-2抗體0.1 ml，室溫孵育30 min，加入PBS10 ml洗滌1次，棄上清，加入FITC-IgG二抗工作液100 μl，避光室溫孵育30 min，加入PBS 10 ml離心同上，棄上清以除去未結合的熒光二抗，上機檢測前加入PBS 1.0 ml，經500目銅網過濾后上機檢測。分別設PBS代替一抗和二抗的陰性對照，以及只加一抗或二抗的同型對照。各蛋白表達量以平均熒光強度(均道值)表示。

1.5 RT-PCR法檢測腫瘤細胞中血管內皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)mRNA的表達 小鼠瘤組織總RNA提取按Invitrogen公司Trizol試劑說明書進行，紫外分光光度計檢測濃度。反轉錄過程按Fementas公司生產的K1622試劑盒說明書進行。PCR反應體系共25 μl，包含cDNA 2 μl；上游引物2.5 μl；下游引物2.5 μl；綠色體系(含TaqDNA聚合酶、MgCl2等)12.5 μl；DEPC水5.5 μl。VEGF反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性60 s，56℃退火30 s，72℃延伸2 min，進行35個循環后，72℃延伸7 min。bFGF反應條件：95℃預變性5 min，94℃變性30 s，48.2℃退火30 s，72℃延伸30 s，進行35個循環后，72℃延伸7 min。β-actin反應條件與VEGF相同。目的基因和β-actin各4 μl EB染色在1.5%瓊脂糖凝膠上以80V電壓直流電泳，紫外光下成像并拍照，并用Gel-proAnalyzer3.1軟件分析擴增產物的光密度值(D)，計算相對系數(相對系數=目的基因D值/β-actin D值)作為目的基因mRNA表達的相對值，對目的基因進行光密度半定量分析。實驗重復3次。見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.6 免疫組化法測定腫瘤組織內微密度(MVD)的表達 免疫組化采用S-P法：10%中性甲醛固定腫瘤組織，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，4 μm連續切片，二甲苯及乙醇梯度脫蠟至水，PBS沖洗2次，5 min/次，按抗體說明書要求進行抗原修復，蒸餾水沖洗2次，5 min/次，甲醇過氧化氫修復20 min。5%正常山羊血清封閉，37℃恒溫箱中孵育45 min，滴加MVD一抗，染色步驟按試劑盒說明進行，DAB顯色，蘇木精復染，脫水，透明，中性樹膠封片。MVD的稀釋濃度為1∶200。以PBS代替一抗作為陰性對照，已知陽性切片作為陽性對照。抗-Ⅷ因子抗體標記的微血管密度(MVD)計數按Weider[5]推薦方法：先在低倍鏡下選擇微血管密度最高的區域，在腫瘤區域內凡染成棕黃色的單個內皮細胞或內皮細胞簇為一個血管計數，在400倍視野下計數4個視野中的微血管數目，取平均數為該例的MVD值。

2 結果

2.1 Cp對S180肉瘤細胞小鼠移植瘤生長的作用 腫瘤細胞接種5 d后，各組小鼠均觀察到移植瘤生長，瘤體呈圓形。實驗結束時，各試驗組移植瘤的重量均小于對照組，但低、中劑量組和對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；高劑量組和各組相比，差異均有統計學意義(P<0.01)。Cp對小鼠移植瘤生長在一定范圍內呈量效關系。見表2。

表2 Cp對小鼠S180肉瘤小鼠移植瘤生長的作用

注：與對照組比較，*P<0.01；與高劑量組比較，#P<0.05

2.2 Cp對移植瘤組織中VEGF、bFGFmRNA表達的影響 以β-actin為內參，Cp低、中劑量組和對照組比較，VEGF和bFGFmRNA的表達量有減小趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)；Cp高劑量組和對照組、Cp低、中劑量組3組之間相比， VEGF、bFGFmRNA表達量明顯減少，與3組之間差異均有統計學意義(P<0.01)。結果示高劑量的磷酸肌酸可抑制腫瘤VEGF、bFGFmRNA的表達。見表3、圖1。

組別劑量(mg/kg)VEGFbFGF對照組 00.3898±0.00250.1602±0.0059低劑量組2000.3813±0.0114#0.1556±0.0038#中劑量組4000.3783±0.0089#0.1548±0.0041#高劑量組8000.3238±0.0115*0.1393±0.0029*

注：與對照組比較，*P<0.05；與高劑量組比較，#P<0.05

2.3 Cp對移植瘤組織中MMP-2、TIMP-2蛋白的表達Cp低、中劑量組和對照組比較，MMP-2蛋白的表達量有降低趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)；TIMP-2表達蛋白有增高趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。Cp高劑量組和對照組、Cp低、中劑量組3組之間相比，MMP-2蛋白的表達量明顯降低，TIMP-2表達蛋白明顯增高，與3組比較差異均有統計學意義(P<0.01)。結果示高劑量的磷酸肌酸可下調MMP-2的表達、上調TIMP-2的表達。見表4,圖2、3。

圖1 RT-PCR檢測各組小鼠移植瘤中VEGF、bFGF mRAN表達

注：1:對照組 2:低劑量組 3:中劑量組 4:高劑量組 M:標記

組別劑量(mg/kg)MMP-2TIMP-2對照組0386.47±2.25276.59±7.96低劑量組200382.41±5.08#284.45±3.76#中劑量組400378.52±8.89#286.32±10.41#高劑量組800323.10±9.27*308.90±14.50*

注:與對照組比較，*P<0.05；與高劑量組比較，#P<0.05

2.4 Cp對移植瘤組織中MVD表達的影響 Cp低、中劑量組和對照組比較，MVD差異無統計學意義(P>0.05)；Cp高劑量組和對照組、Cp低、中劑量組比較，MVD間差異有統計學意義(P<0.01)。結果表明高劑量的磷酸肌酸可抑制腫瘤血管生成。見表5、圖4。

表5 Cp對移植瘤組織中MVD表達的影響 ±s

注：與對照組比較，*P<0.05；與高劑量組比較，#P<0.05

3 討論

Cp是參與細胞能量代謝的重要物質之一，在1927年被發現，Cp在細胞中的含量可高達2～30 mmo/L,當機體消耗三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)過多而致二磷酸腺苷增多時，磷酸肌酸將高能磷酸鍵轉給二磷酸腺苷，二磷酸腺苷在腺苷酸激酶催化下轉變成ATP被利用。因此，它是心肌、骨骼肌、腦、視網膜、腎和精子等這些高耗能細胞器官或細胞內ATP濃度恒定的“緩沖庫”，這些器官或細胞的共同特點是，在生命活動中要消耗大量ATP，所耗ATP的補充要靠胞內的Cp來轉化。生物體內能量的儲存和利用都以ATP為中心，其是直接的供能物質，Cp是能量儲備庫，其含量的多少直接影響體內ATP水平。Cp在肌肉收縮的能量代謝中發揮重要作用，是心肌的能量儲備，當心肌ATP供應不足時，儲存的Cp就迅速動員出來用于ATP的合成，ATP的水解為肌動蛋白收縮過程提供能量；另外，Cp可以保護心肌細胞膜；促進心肌微循環；抑制5-核苷酸酶的活性，穩定心肌細胞內腺苷酸含量。可見，Cp是一種療效非常明顯的心肌保護劑，而化療作為腫瘤治療重要手段之一，其心臟毒性一直是化療的最明顯的副作用之一，限制了化療的療效，如果化療時使用Cp減輕化療藥物的心臟毒性，那么就有可能大大提高化療療效，但Cp對腫瘤血管生長具有促進抑或抑制作用還尚未見研究報道，因此，我們建立了小鼠移植性S180肉瘤模型，來探討磷酸肌酸對小鼠移植性S180肉瘤作用血管生長及其可能的機制。

圖2 1:對照組 2:低劑量組 3:中劑量組 4:高劑量組

圖3 1:對照組 2:低劑量組 3:中劑量組 4:高劑量組

圖4 1:對照組 2:低劑量組 3:中劑量組 4:高劑量組(S-P，×400)

研究表明，腫瘤的生長和轉移是血管依賴性的，實體瘤長到2～3 mm時，如果沒有新生血管生成，腫瘤細胞即進入休眠狀態，阻斷血管生成是遏制腫瘤生長的有效策略這一學說。針對血管生成的治療策略，已成為目前腫瘤治療的熱點研究領域。反映腫瘤血管生成的主要指標是檢測腫瘤組織內VEGF， bFGF的表達量和MVD值。VEGF具有特異性促內皮細胞有絲分裂特性，與其受體結合能引起腫瘤血管內皮細胞增殖，遷移和管狀結構的形成[6,7]。bFGF是最早被證實的血管生成因子之一，其體內外促血管生成作用已被公認，不僅參與腫瘤血管生成，且能促進腫瘤細胞生長，抑制細胞凋亡[8]。第八因子相關抗原是血管內皮細胞較特異性標記物，其表達量的高低反映腫瘤血管的多少；TIMP-2是內源性抗血管生成物質，可抑制血管內皮細胞遷移和由血管刺激因子所致的血管管狀形成，并可預防腫瘤細胞的擴散。MMP-2是溶解血管外基質的主要蛋白溶解酶，是金屬離子依賴性的內源性肽酶，能降解幾乎所有的基底膜和細胞外基質，在腫瘤血管生成和腫瘤轉移中起著重要作用[9]。

實驗結果顯示,對照組、Cp低劑量組和中劑量組3組之間各檢測指標差異均無統計學意義(P>0.05)；Cp高劑量組和對照組、Cp低、中劑量組比較，小鼠移植性肉瘤質量明顯減小，MMP-2蛋白顯著減少及TIMP-2蛋白顯著增加，MVD數顯著減少，VEGF及bFGF mRNA明顯減少。實驗表明Cp低、中劑量對腫瘤血管生成無明顯影響；Cp高劑量對腫瘤血管生成具有明顯的抑制作用。其機制可能與三磷酸腺苷和Cp在體內的相互轉換有關。ATP是體內重要的生物活性物質，參與體內的多種生理功能。近幾年，學者們對其抗腫瘤作用展開了較多研究。Palomares等[10]研究表明ATP 對小鼠黑素瘤具有抗增殖作用；ATP主要通過特異性P受體發揮作用，P受體被核苷酸類物質如 ATP 選擇性激活。當機體補充了Cp后，Cp將高能磷酸鍵轉給二磷酸腺苷，二磷酸腺苷在腺苷酸激酶催化下由轉變成ATP，結果是體內有較多的ATP積累，ATP具有抗腫瘤增殖的作用，從而可能通過ATP下調MMP-2、VEGF和bFGF表達量、上調TIMP-2表達量，發揮抗腫瘤血管生成的作用。

本實驗結果顯示，低劑量的Cp對腫瘤血管生成無影響，高劑量的Cp抑制腫瘤血管生成，其機制可能是Cp通過在體內轉換為ATP，下調MMP-2、VEGF和bFGFmRNA表達量、上調TIMP-2表達量，發揮抗腫瘤血管生成的作用。因此，Cp可用于化療的心肌保護。但此實驗僅為動物實驗，有待于臨床觀察驗證。

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Effects of creatine phosphate on angiogenesis in mice with transplanted S180 sarcoma and its possible mechanism

HANWenfeng,WEISuju,ZHENGYazhen.

DepartmentofOncology,TheSeventhPeople’sHospitalofHebeiProvince,Hebei,Dingzhou073000,China

Objective To investigate the effects of creatine phosphate (Cp) on angiogenesis in mice with transplanted S180 sarcoma, and to explore its related action mechanism.Methods The animal models with S180 sarcoma were established in Kunming mice.The 60 mice were randomly divided into four groups:control group,low-dose group (Cp 200mg/kg),middle-dose group (Cp 400mg/kg), high-dose group (Cp 800mg/kg).The changes of transplanted tumors weight were observed,moreover, the expression levels of (matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMP-2) protein in transplanted sarcoma tissues were detected by flow cytometry,and the microvessel density (MVD) of tumors was detected by immunohistochemistry (IHC),besides the expression levels of VEGF and bFGF mRNA in transplanted tumor were detected by RT-PCR.Results There were no significant differences in transplantation tumor weight,the expression levels of VEGF,bFGFmRNA,MMP-2,TIMP-2 among control group,low-dose group and middle-dose group (P>0.05). However the transplantation tumor weight in high-does group was significantly decreased,as compared with those in control group, low-dose group and middle-dose group,moreover MVD was obviously decreased,and the expression levels of VEGF, bFGFmRNA and MMP-2 protein were significantly decreased,however,the expression levels of TIMP-2 protein were significantly increased (P<0.01).Conclusion The low-dose and middle-dose Cp has no obvious inhibitory effects on angiogenesis in mice with transplanted S180 sarcoma, however high-dose Cp has obvious inhibitory effects on angiogenesis in mice with transplanted S180 sarcoma, and its action mechanism might be correlated to down-regulation of expression levels of MMP-2,VEGF,bFGF and up-regulation of TIMP-2 expression.

creatine phosphate; S180 sarcoma; VEGF; bFGF; MVD

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.14.002

073000 河北省定州市，河北省第七人民醫院腫瘤科

R 73-3

A

1002-7386(2017)14-2090-05

2017-01-18)