2型糖尿病合并肺癌瘤組織中COX-2的表達及意義

穆維新 王耀賢 閆立曼

·論著·

2型糖尿病合并肺癌瘤組織中COX-2的表達及意義

穆維新 王耀賢 閆立曼

目的 通過檢測COX-2在2型糖尿病合并肺癌癌組織與單純肺癌癌組織中的表達，探討其在2型糖尿病合并肺癌癌組織發生發展中的作用及臨床意義。方法 收集2型糖尿病合并肺癌(試驗組)與單純肺癌(對照組)2組手術切除的癌組織病理石蠟切片各50例。采用免疫組化的方法檢測COX-2在2組癌組織中的表達差異。結果 2型糖尿病合并肺癌及單純肺癌瘤組織中COX-2的表達積分光密度值分別為173.6±11.5，125.4±10.9,差異有統計學意義(P<0.05)。結論 2型糖尿病合并肺癌癌組織中COX-2表達升高，可能是2型糖尿病合并肺癌愈后差的原因之一。

2型糖尿病合并肺癌;單純肺癌;免疫組化;COX-2

惡性腫瘤和2型糖尿病在世界范圍內成為主要兩大慢性非傳染性疾病，是常見病、多發病及終生性疾病，惡性腫瘤中肺癌成為當今發病率及病死率增長最快的疾病，是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一。迄今，肺癌是最主要的腫瘤相關性死因之一，隨著對肺癌發病機制的不斷深入研究，在肺癌的診斷及治療方面取得了一些成果，但是肺癌的5年生存率和患者的生活質量仍然沒有大的提高，在今天的我國，肺癌的患病率及病死率已升至惡性腫瘤之冠[1]，在肺癌病理分型中，以非小細胞肺癌(NSCLC)為多見，因此也是當前研究的熱點。當前，研究者急需解決的難題是怎樣提高肺癌的診治水平，改善患者的生存率及生活質量。同樣，糖尿病隨著人民生活的改善，膳食傳統模式的改變，尤其是攝入高脂肪、高糖類、高蛋白類、高熱量的食物等，糖尿病也成了多發病及常見病。其中2型糖尿病占據本病群體95%。近年來研究認為2型糖尿病患者并發惡性腫瘤的危險性增加，發病率比正常人群高達兩倍甚至還多[2,3]。2型糖尿病合并惡性腫瘤病人多在中晚期，且愈后較差[4]。其中，肺癌發病率在2型糖尿病并發惡性腫瘤中位居前三位[5]。流行病學調查顯示2型糖尿病和肺癌有許多共同的危險因素，比如吸煙、老年、環境因素、生活方式等等，另外2型糖尿病造成的代謝免疫功能紊亂、高血糖、肺損傷、肺部感染、高胰島素血癥等均可能增加肺癌的危險度，但具體原因不詳，國內外研究較多。從動物實驗研究認為炎性因子環氧合酶-2(COX-2)參與了2型糖尿病大鼠的肺炎性損傷，一些研究證明人類的非小細胞肺癌中COX-2表達水平增高[6]，是否參與了2型糖尿病并發肺癌的發生發展并導致愈后差未見報道。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取河北醫科大學第四醫院2004年1月至2014年1月所有臨床資料比較完整的肺癌標本石蠟包埋癌組織，所有病例均外科手術或其他方式病理檢查證實為肺癌，其中共計10 618例，其中單純肺癌10 012例，2型糖尿病合并肺癌575例。我們選取2014年2型糖尿病合并肺癌(試驗組，選取病例均為腺癌)與單純肺癌(對照組，選取病例均為腺癌)患者100例。其中試驗組男28例，女22例；年齡39～76歲，平均年齡56.20歲；其病程2型糖尿病均在2年以上，其中Ⅰ期5例，Ⅱ期35例，Ⅲ10例，以上病例均無合并其他疾病。對照組男31例，女19例;年齡43～78歲，平均年齡58.40歲，其中Ⅰ期6例，Ⅱ期33例，Ⅲ11例，以上病例均無合并其他疾病。2組手術切除的癌組織病理石蠟切片各50例，做免疫組化檢測COX-2的表達。2組一般資料具有可比性。

1.2 2型糖尿病診斷標準 肺癌臨床分期按照國際TNM標準 (UICC 2009)。2型糖尿病診斷標準按照1999年世界衛生組織發布標準。滿足下面條件任意一項：(1)有糖尿病癥狀+任意時間血漿葡萄糖濃度≥11.1 mmol/L；(2)空腹血漿葡萄糖濃度≥7.0 mmol/L； (3)餐后2 h血糖濃度≥11.1 mmol/L。

1.3 試劑及儀器設備

1.3.1 試劑:兔抗人COX-2多克隆抗體(Santa Cruz公司);鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)免疫組化試劑盒(福州邁新生物技術公司);二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒(福州邁新生物技術公司);PBS緩沖液等(福州邁新生物技術公司)。

1.3.2 儀器設備:顯微鏡：日本奧林巴斯IX71熒光倒置顯微鏡;CCD:Discovery C15;IS Capture成像軟件采集系統;切片機：德國萊卡RM2015;離心機：北京離心機廠LDZ5-2型;電子天平：瑞士METTER AE100型;移液器：德國EPPENDORF;干燥箱：日本三洋MIR-153型;低溫冰箱：日本三洋MDF-382E型;恒溫水浴箱：江蘇太倉醫用儀器廠DSHZ-300型;醫用微波爐：浙江臨安愛迪儀器廠YWY781B型。

1.4 免疫組化方法

1.4.2 顯微鏡觀察：選擇試驗組和對照組的陽性和陰性組織相、進行200×和400×的顯微照相。

1.4 3 圖像分析：計算機圖像處理系統由CMOS(日本OLYMPUS公司)及專用軟件(美國Media Cybernetics 公司Image-Pro Plus)組成。依據陽性免疫反應的圖像灰度選擇合適的灰度分割閾值，實現雙閾值分割,得到樣品的半灰度目標圖像，以人機交互方式測定陽性免疫染色強度及面積。每組取50例，每例測5個視野。由計算機計算出所測陽性反應物相對含量的灰度值及面積。選擇有意義的組織相，經登錄、編號、采集、分析、讀取數據、最后存盤。

2 結果

2.1 COX-2陽性染色 其主要定位在核膜，位于肺癌癌細胞的胞漿中，胞漿呈棕黃色彌漫性分布。2型糖尿病合并肺癌組較單純肺癌組棕黃色顆粒比較粗大。試驗組隨著患者TNM分期的增加，棕黃色顆粒染色更加深染，Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期免疫染色強度及面積積分光密度值分別為(162.4±8.9)，(171.3±9.6)，(180.4±10.3)。對照組同樣隨著TNM分期不同，棕黃色顆粒染色變化隨分期增加而加深，Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期免疫染色強度及面積積分光密度值分別為(119.6±7.9)，(121.8±10.5)，(128.7±11.5)，2組差異無統計學意義(P>0.05)。見表1，圖1、2。

TNM分期試驗組例數光密度值對照組例數光密度值Ⅰ5162.4±8.96119.6±7.9Ⅱ35171.3±9.633121.8±10.5Ⅲ10180.4±10.311128.7±11.5

圖1 試驗組HE染色(×200)圖2 對照組HE染色(×200)

2.2 免疫熒光染色成綠色 經測定陽性免疫染色強度及面積，COX-2積分光密度值試驗組與對照組分別為(173.6±11.5)，(125.4±10.9),試驗組表達COX-2明顯高于對照組，且隨著分期的增加，其表達的積分光密度值有增加，2組差異有統計學意義(P<0.01)。見表2，圖3、4。

項目試驗組對照組光密度值173.6±11.5125.4±10.9

圖3 試驗組免疫熒光 染色(×200)圖4 對照組免疫熒光 染色(×200)

3 討論

肺癌是美國最常見的惡性腫瘤之一，在男性和女性中均為腫瘤死亡的首要原因，在美國每年死亡人數超過乳腺癌、結腸癌、前列腺癌和胰腺癌的總和[7]。在世界范圍內，肺癌同樣是腫瘤死亡的首要原因，估計每年有150萬人死于肺癌[8]。糖尿病跟癌癥同樣是快速增長的慢性非傳染性疾病之一，隨著糖尿病發病率的快速增加，其并發癥的研究越來越廣泛越來越深入，國內外關于糖尿病合并肺癌的流行病學研究認為2型糖尿病增加肺癌的風險，且發現時多為中晚期[4]，具體發病機制不詳。腫瘤的發生、進展和轉移是在宿主反應的情況下進行的，越來越多的證據證明腫瘤生成的炎性反應在機體免疫系統與惡性腫瘤相互作用中起了重要作用。雖然基因的改變在正常機體細胞轉化成惡性腫瘤細胞的過程中特別重要，但是惡性腫瘤微環境中的炎性反應在惡性腫瘤發展到轉移癌的過程中也是非常重要，所以炎性反應、宿主的免疫系統及惡性腫瘤之間的關系越來越廣泛的被大家所接受[9]。

惡性腫瘤與炎癥/免疫系統之間的作用通過免疫監視、免疫編輯、腫瘤形成中宿主機體細胞網絡的共同調控、腫瘤介導的免疫抑制等方面交互作用的。其中炎性因子環氧化酶(COX)起重要作用，COX也稱前列腺素內過氧化酶或是前列腺素G氫化氧化物，具有脂肪酸環氧合酶及前列腺素(PG)氫過氧化物酶兩種活性，COX有三種形式，其中COX-1分布在多數機體細胞和組織中,它能夠促使花生四烯酸(AA)生成前列腺素(PG)，其在體內起著抑制胃酸分泌以保護胃黏膜和維持腎臟血流的作用。其活性完全依賴于底物，而COX-2是一種誘導型的同工酶， COX-2是由花生四烯酸合成前列腺素和血栓烷素的限速酶，是一種雙功能酶，正常人機體內幾乎不能檢測到，僅僅在當人體機體細胞受到刺激因素如外傷、感染、生長因子、促癌劑、細胞因子等刺激后開始迅速合成，在靜息狀態下并不表達，可參與包括腫瘤在內的多種生理病理過程[10]。COX-2長約8.3 kb，是由10個外顯子及 9個內含子構成，其位于第1號染色體的 q25.2～q25.3， 其中 5′端含有 CpG 島，內有多個轉錄因子結合位點，可編碼 604個氨基酸，COX-2主要定位在細胞核膜上，分布在內質網的胞質側和細胞膜上。在病理情況下，可能參與炎癥、疼痛、發熱及腫瘤的形成，COX-3被認為是保留了內含子和突變因子的COX-1遺傳變異體，因此又稱COX-1B。所有COX的存在形式也就是亞型在結構特征上是相似的，它們有一個疏水性的通道，這個通道可以使花生四烯酸帶著發夾構型進入COX的催化區域。當機體受刺激誘導產生COX-2后，使AA大量轉變為PG和血栓素，促進白三烯及羧基環氧素等炎性介質產生，引起嚴重的炎性反應，同時吸引大量炎性細胞及因子共同發生炎性反應，在臨床中使用的非甾體抗炎藥正是抑制COX-2的活性降低PG的合成發揮抗炎作用。國內外相關研究認為患者長期使用非甾體抗炎藥物，胃腸道腫瘤相對危險度為0.57，也就是用藥后胃腸道腫瘤的發生率下降了43%，同時還發現使用超過5年患者其胃腸道腫瘤患病的相對危險度為0.21，并得出服用年限與腫瘤發生危險度呈負相關關系[11]。據上述報道，非甾體抗炎藥是否能明確降低癌癥的發生率及其機制備受關注。國外一些學者研究證明人類非小細胞癌(NSCLC)中組成性環氧化酶-2(COX-2)的表達水平增高[12]，在肺癌形成過程中有重要作用。Khuri等用原位雜交的方法檢測了160例NSCLCI期患者的標本中COX-2的表達，并觀察到了COX-2過表達預示了患者更短的生存期，COX-2高表達降低了總生存率并且減少了無瘤生存率[13]。Tsubochi等[12]研究在Ⅰ期肺腺癌患者中COX-2的表達和預后不良相關。另外有研究顯示在癌前病變中COX-2表達增加[14]。COX-2在腫瘤形成的機制可能是：(1)通過增加腫瘤組織血管生成,炎性反應和酪氨酸激酶受體通路構成了由許多對惡性表型有貢獻的調節因子組成的復雜網絡。其中COX-2和表皮生長因子受體(EGFR)的交互信號是這些通路中被研究最深入之一。研究認為COX-2和EGFR可以相互作用來調控細胞的增殖、轉移及入侵[15],這引起了研究者使用COX-2和EGFR抑制劑聯合治療NSCLC的興趣，EGFR抑制劑可以減少血管生成因子比如白介素-8(IL-8)和血管內皮生長因子(VEGF)的產生，這也是COX-2抑制劑抑制血管生成的機制之一[16]。Toamey等[17]研究報道COX-2可能通過產生降解細胞外基質(ECM)的蛋白誘導新生血管的生成?；|金屬蛋白酶(MMPs)是降解ECM的一種酶，其可促進腫瘤細胞向周圍浸潤，并可幫助內皮細胞向遠處遷移，增強腫瘤細胞轉移能力，當COX-2轉錄受抑制時，MMP-7基因的轉錄和翻譯也受到限制，這樣，COX-2通過上調MMP-7的表達降解ECM。(2)增強侵襲力，在COX-2代謝產物中前列腺素E2(PGE2)在腫瘤微環境中廣泛大量存在，是一個重要的調控免疫因子，同時也調控著內皮細胞的生長、浸潤和上皮細胞的存活[15]。前列腺受體屬于G蛋白耦聯受體(GPCR)超家族，是通過EP1、EP2、EP3、EP4這4個GPCR發揮多種作用，PGE2通過EP4受體的信號通路在介導NSCLC的浸潤，且抑制腫瘤COX-2可以降低MMP-2、CD44和EP4受體的表達和浸潤，提示PGE2在NSCLC患者中通過EP受體信號通路調控COX-2依賴的、CD44和MMP-2介導的浸潤[18]。(3)降低宿主免疫力，在肺癌及其他惡性腫瘤中，腫瘤誘導的免疫抑制是公認的，以前的研究證實在NSCLC中腫瘤細胞過表達COX-2是導致肺癌免疫抑制網絡的原因，在一些惡性腫瘤中COX-2的同工酶活性在惡性腫瘤組織中較其正常組織明顯增高，且在肺癌中COX-2同樣會過表達[19]。在肺癌小鼠模型，特異基因或藥物抑制COX-2可以明顯的縮小腫瘤的大小。(4)促進腫瘤細胞增殖及抗凋亡等方式參與了多種腫瘤發生發展,Thiel等[20]學者研究發現，COX-2能夠延長細胞周期的G1期，其能通過降低細胞周期蛋白含量從而抑制細胞凋亡，并增加正常細胞發生突變的幾率。

我們的本課題的研究證明了2型糖尿病合并肺癌患者的COX-2比單純肺癌組患者有更高的表達，并且發現腫瘤TNM分期級別越高，其表達越高，可能是2型糖尿病合并肺癌患者預后更差的原因之一。一些研究顯示在肺癌的前期病灶COX-2表達增高，于是許多學者開始研究著眼COX-2抑制劑在化學預防方面可能存在的治療作用。Mao等[21]學者通過口服6個月的塞來昔布(celecoxib)給予重度吸煙者，進行肺泡灌洗液和活檢等支氣管檢查，結果顯示了應用該藥作為預防用藥的可行性。最新研究Sung等[22]研究人員通過MTT實驗檢測藥物處理腫瘤的敏感性，采用二乙酸二氯熒光素測量活性氧的產生，該研究顯示celecoxib聯合化療藥物5-氟尿嘧啶可能增強抗鱗狀細胞癌的療效。并且認為這種聯合治療的可能主要機制是阻斷AKT通路產生活性氧增強抗癌療效。更大的以安慰劑作為對照組的隨機臨床研究也在進行中，以檢測COX-2抑制劑在肺癌預防中的療效[21]。國內學者王玲嬋等[23]通過將肺腺癌A549細胞接種BALB/c雄性裸鼠右側腋部皮下組織，建立了移植瘤動物模型，研究探討了COX-2抑制劑艾瑞昔布是否能抑制轉移瘤侵襲及轉移，結果發現艾瑞昔布能抑制非小細胞肺癌侵襲和轉移，他們研究作用機制可能與上調PTEN蛋白和下調cortactin蛋白的表達有關。應用COX-2抑制劑是否能改善2型糖尿病合并肺癌患者的預后，尚待我們以后進一步研究。

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10.3969/j.issn.1002-7386.2017.14.015

項目來源：河北省醫學科學研究重點課題計劃(編號：ZD20140272)

050100 河北省石家莊市井陘礦區醫院(穆維新)；河北醫科大學第四醫院東院急診科(王耀賢、閆立曼)

王耀賢，050011 石家莊市，河北醫科大學第四醫院東院急診科；

E-mail:mmllcc36@sina.com

R 578.1,R 734.2

A

1002-7386(2017)14-2139-04

2017-01-12)