轉基因棉花對土壤細菌群落的影響

范巧蘭，李永山，王慧，席凱鵬，席吉龍，史俊東，張建誠

（1.山西省農業科學院棉花研究所，山西運城044000；2.運城農業科學院，山西運城044000）

轉基因棉花對土壤細菌群落的影響

范巧蘭1，2，李永山1，2，王慧1，2，席凱鵬1，2，席吉龍1，2，史俊東1，2，張建誠1，2

（1.山西省農業科學院棉花研究所，山西運城044000；2.運城農業科學院，山西運城044000）

為了評價轉基因棉花對土壤細菌群落結構的影響，試驗采用轉基因棉花品種晉棉26號及其非轉基因親本晉棉7號以及傳統棉花品種中棉所12號進行了長期定位試驗，利用高通量基因測序法研究了轉基因棉花對土壤細菌的群落結構的影響。結果表明，3個棉花土壤細菌共檢測到1 585個OTUs、除1個未分類門和4個待定候選門外，其余分別屬于已知的21個門；主要優勢種群有變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、浮霉菌門、綠彎菌門、擬桿菌門；每個品種有獨特的種群，轉基因棉花晉棉26號獨有的種群為棲熱菌門，晉棉7號獨有種群為WCHB1-60；轉基因棉花土壤細菌的多樣性降低，但沒有改變土壤細菌種群結構。

轉基因棉花；土壤；細菌；群落結構；高通量測序

2015年的生物技術作物商業化20周年，全球種植轉基因作物面積是1996年的100多倍，達1.797億hm2。2015年全球種植棉花3 200萬hm2，75%的種植面積是轉基因棉花，其中，我國種植370萬hm2轉基因棉花，占全國棉花總面積的96%[1]。隨著轉基因作物種植面積的不斷擴大，轉基因植物的生態安全風險評價日益受到人們的關注，轉基因對土壤生態安全評價成為研究熱點[2]，國內外學者研究了轉Bt基因抗蟲棉對土壤微生物的影響[3-12]。由于根系分泌物和殘體中的Bt毒素在土壤中的積累，連續種植棉花會導致土壤微生物種群結構變化。由于大田和實驗室采用的試驗方法（傳統微生物培養法、PFLA和DGGE等）、試材等條件的不同，導致試驗結果不一致，多數結果認為，連續種植轉基因作物對土壤微生物沒有影響或影響很小[13-16]，但也有相反的結果[17-22]。近年來，高通量測序技術是一種新的技術，在微生物分子生態學等方面得到了廣泛應用[23]。

本研究應用Illumina平臺的Miseq高通量測序土壤細菌16S rDNA，以轉Bt基因棉花晉棉26號及其非轉基因棉花親本晉棉7號以及傳統品種中棉所12號為試材，進行田間定位試驗，旨在探索連續多年種植轉基因棉花對棉花土壤細菌組成、結構及多樣性的影響，為轉基因棉花安全評價提供依據。

1 材料和方法

1.1 試驗地概況

試驗設在山西省農業科學院棉花研究所牛家凹試驗農場。試驗地為黃壤土，肥力中等偏上，有機質10.91 g/kg，全氮2.13 g/kg，速效氮186.04 mg/kg，速效磷6.52 mg/kg，速效鉀145.14 mg/kg，土壤pH值為7.2。

1.2 試驗材料

供試棉花品種為轉基因棉花晉棉26號（JM26）及其非轉基因棉花親本品種晉棉7號（JM7）和非轉基因品種中棉所12號（CRI12）。

1.3 試驗設計

試驗采用隨機區組設計，3次重復，小區面積30 m2。從2008年開始進行定位試驗，于2014年棉花收獲期采集土樣，采集的土樣放在無菌封口塑料袋中，揀出根系，立即將其放置在-80℃冰箱中保存待測。

1.4 土壤微生物總DNA的提取及細菌的高通量測序及分析

稱取土壤樣品0.5 g，用E.Z.N.A Soil DNA（OMEGA，USA）試劑盒進行土壤總DNA提取后，用核酸定量儀（NanoDrop ND-1000）和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測土壤總DNA的濃度和純度。

高通量測序主要步驟：按指定測序區域，合成帶有bar code的特異引物。PCR采用TransGenAP221-02:TransStart Fastpfu DNA Polymerase；PCR儀:ABI GeneAmpR9700型。

土壤細菌的PCR的擴增引物：采用16S rRNA的擴增引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′）和907R（5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′）來擴增土壤細菌的16S rRNA基因。PCR反應體系共20 μL：4 μL 5×FastPfu Buffer，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL Forward Primer（5 μmol/L），0.8 μL Reverse Primer（5 μmol/L），2 μL Template（10 ng DNA），0.4 μL FastPfu Polymerase和10 μL ddH2O。PCR擴增條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃下延伸45 s，共有27個循環；最后在72℃下終延伸10 min結束。每個樣本3次重復，將同一樣本的PCR產物混合后再用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收PCR產物，Tris-HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測PCR產物的純度和濃度。

將PCR產物用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統（Promega公司）進行定量檢測，之后按照每個樣品的測序量要求，進行相應比例的混合，進行Miseq測序。

通過利用QIIME軟件技術，依照序列的相似度方法把序列分為數個OTUs（operational taxonomic unit）。統計出每個測試樣品中OTU情況以及各個OTU中序列的個數。在Silva（Release115 http://www. arb-silva.de）數據庫中將序列進行比對和物種分類。采用RDP classifier貝葉斯算法在97%相似水平的OTU代表序列進行生物信息分類學分析，分別在phylum（門）和genus（屬）水平上統計各樣本的群落組成，并對OTU進行生態學分析，計算土壤Shannon指數、Simpson指數、物種豐富度Chaol指數等。

土樣樣品由上海美吉生物醫藥科技有限公司應用Illumina平臺的MiSeq進行測序。

2 結果與分析

2.1 土壤樣品的測序結果

表1 不同棉花品種土壤細菌DNA測序結果

通過對3種棉花土壤細菌16S rDNA進行測序，過濾掉樣品中低質量的原始序列后，得到總數為65 470個的有效序列，共獲得55 577條讀數（reads），并在97%相似度下將其聚類為用于物種分類的OUT。由表1可知，晉棉7號的土壤中含有最多數量的OTUs，其次是轉基因棉花晉棉26號，中棉所12號OTUs數量最少；與晉棉7號相比，晉棉26號的土壤OTUs數量減少2.98%，中棉所12號土壤減少18.36%；3個棉花土樣共產生1 585個OTUs，其中，3個棉花品種共享1 124個OTUs，共享率達70.91%（圖1）。

2.2 土壤細菌的種類分析

在門水平上，3個棉花土壤共檢測到21個細菌門，除1個未被分類（unclassified）群體外，還有4個候選細菌門。其中，相對豐度較大的有變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、硝化螺菌門（Nitrospirae）、厚壁菌門（Firmicutes）、藍藻門（Cyanobacteria）等10個細菌門，占到3個處理各自土壤細菌總量的94.9%以上。不同相對豐度大于5%的主要優勢種群有變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、浮霉菌門、綠彎菌門、擬桿菌門，分別占總量的26.6%～29.2%，19.1%～22.6%，8.8%～11.9%，9.2%～10.8%，7.4%～9.2%，6.6%～8.7%。其中，晉棉26號獨有的種群為棲熱菌門（Deinococcus-Thermus，相對豐度0.059 6%），晉棉7號獨有的種群為WCHB1-60（相對豐度0.033%）。

在屬水平上，3種棉花土壤細菌共有相對豐度＞1%的優勢屬數量19個，3個棉花品種中均有分布的優勢種屬有12個。晉棉26號、晉棉7號土壤中優勢屬的種類最多，均為15個；中棉所12號土壤中優勢屬的種類最少，為14個（圖2）。每個品種皆有自己特有的種群，但相對豐度很小，其中，轉基因棉花晉棉26號土壤細菌有Truepera，D05-2_ norank，Methylohalomonas，34P16_norank，Tepidibacter種群，相對豐度0.004%～0.060%，而晉棉7號土壤細菌有Aliihoeflea，PAUC26f_norank，Mucilaginibacter，Martelella，Nubsella，WCHB1-60_norank，Propionibacterium種群，相對豐度為0.012 5%～0.060 0%，中棉所12號有Parasegetibacter種群，相對豐度為0.02%等。

聚類分析結果表明，3個棉花品種可分為2大類，其中一類為傳統棉花品種中棉所12號，另一類為轉基因棉花品種晉棉26號及其非轉基因親本晉棉7號。表明轉基因晉棉26號土壤細菌種群結構與親本晉棉7號沒有明顯差異（圖3）。

2.3 轉基因棉花土壤細菌的多樣性分析

試驗結果表明（表2），轉基因棉花晉棉26號的Shannon指數低于其非轉基因親本晉棉7號，但高于傳統品種中棉所12號，說明轉基因棉花土壤細菌多樣性低于非轉基因；Chaol指數大小依次為晉棉7號＞晉棉26號＞中棉所12號，說明轉基因棉花豐富度低于非轉基因親本；Simpson指數依次為中棉所12＞晉棉26＞晉棉7，說明轉基因棉花晉棉26多樣性低于晉棉7號。

表2 不同棉花品種對土壤細菌多樣性的影響

3 結論與討論

本研究利用高通量的測序技術對土壤細菌16S rDNA進行擴增測序，結果表明，在相似度為97%的條件下，OTUs囊括了土壤細菌量的94%以上；而且測序還發現了很多未被分類細菌，表明高通量測序可以得到更為全面的微生物信息，很多未知細菌或未分類菌也能通過測序發現。因此，利用高通量基因測序研究微生物是一種有效的方法。

轉基因作物主要通過根系分泌物或殘體進入土壤生態環境，從而影響特定的微生物種群。HU等[14]采用傳統微生物培養法進行研究，結果表明，連續5 a種植轉基因棉花，其根際土壤功能細菌沒有受到明顯影響。LI等[15]研究發現，連續3 a種植轉基因棉花對土壤微生物沒有影響（傳統微生物培養法）。ZHANG等[16]采用PCR-DGGE進行3 a田間研究，結果表明，NC33B棉花對土壤細菌、真菌、放線菌沒有影響。本研究表明，棉花土壤細菌的優勢種群有變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、浮霉菌門、綠彎菌門、擬桿菌門，轉基因晉棉26號有獨有的種群棲熱菌門，晉棉7號獨有的種群為WCHB1-60；在屬水平，轉基因棉花晉棉26號土壤細菌有Truepera，D05-2_norank，Methylohalomonas，34P16_ norank，Tepidibacter，而晉棉7號土壤細菌有Aliihoeflea，PAUC26f_norank，Mucilaginibacter，Martelella，Nubsella，WCHB1-60_norank，Propionibacterium，這些獨特的種群相對豐度都很低，沒有影響細菌的種群結構。SINGH等[23]用RFLP-PCR檢測出轉Bt基因茄子土壤獨有藍藻細菌（Cyanobacteria）和擬桿菌（Bacteroidetes），而非轉基因茄子土壤中獨有β變形菌、綠屈撓菌屬、梭桿菌門和浮霉菌門，并沒有改變土壤細菌菌落結構。但也有研究表明，連續種植轉基因棉花會對土壤細菌菌落產生影響[17-21]。因此，有關轉基因棉花對土壤微生物的影響需要建立多學科、多種方法、長期定位進行綜合評價，才能獲得更加有效準確的評價。

［1］JAMES CLIVE.2015年全球生物技術/轉基因作物商業化發展態勢[J].中國生物工程雜志，2016，36（4）：1-11.

［2］SINGH AMIT KISHORE，SURESH，KUMAR DUBEY.Current trends in Bt crops and their fate on associated microbial community dynamics：review[J].Protoplasma，2016，253：663-681.

［3］DONEGAN K K，PALM C J，FIELAND V J，et al.Changes in levels，species，and DNA fingerprints of soil microorganisms associated with cotton expressing the Bacillus thuringiensis var.kurstaki endotoxin[J].Applied Soil Ecology，1995，2：111-124.

［4］李永山，范巧蘭，陳耕，等.轉Bt基因棉花對土壤微生物的影響[J].農業環境科學學報，2007，26（Z）：533-536.

［5］李永山，范巧蘭，陳耕，等.利用PLFA研究轉Bt基因棉花對土壤微生物群落結構變化的影響[J].棉花學報，2009，21（6）：503-507.

［6］范巧蘭，陳耕，李永山，等.轉Bt基因棉花不同生育期對土壤微生物的影響[J].山西農業科學，2010，38（12）：34-36.

［7］范巧蘭，陳耕，李永山，等.轉基因棉花不同生物量對土壤微生物群落結構的影響[J].棉花學報，2012，24（1）：85-90.

［8］娜布其，紅雨，楊殿林，等.利用根箱法解析轉雙價（Bt＋CpTI）基因棉花對土壤微生物數量及細菌多樣性的影響[J].棉花學報，2011，23（2）：160-166.

［9］沈法富，韓秀蘭，范術麗.轉Bt基因抗蟲棉根際微生物區系和細菌生理群多樣性的變化[J].生態學報，2004，24（3）：432-437.

［10］雒珺瑜，崔金杰，李樹紅，等.不同棉花品種對土壤微生物的影響[J].中國棉花，2005，32（9）：10.

［11］SHEN REN FANG，CAI HONG，GONG WAN H E.Transgenic Bt cotton has no apparent effect on enzymatic activities or functional diversity of microbial communities in rhizosphere soil[J].Plant and Soil，2006，285：149-159.

［12］SUN C X，CHEN L J，WU Z J，et al.Soil persistence of Bacillus thuringiensis（Bt）toxin from transgenic Bt cotton tissues and itseffect on soil enzyme activities[J].Biology and Fertility of Soils，2007，43，617-620.

［13］Head G，Surber J B，Watson J A，et al.No detection of Cry1Ac protein in soil after multiple years of transgentic Bt cotton（Bollgard）use[J].Environmental Entomology，2002，31：30-36.

［14］HU H Y，LIU X X，ZHAO Z W.Effects of repeated cultivation of transgenic Bt cotton on functional bacterial populations in rhizosphere soil[J].World J Microbiol Biotechnol，2009，25：357-366.

［15］LI X G，LIU B，CUI J J，et al.No evidence of persistent effects of continuously planted transgenic insect-resistant cotton on soil microorganisms[J].Plant and Soil，2011，339：247-257.

［16］ZHANG YANJUN，XIE MING，WU GANG，et al.A 3-year field investigation of impacts of Mansanto's transgenic Bt-cotton NC33B on rhizosphere microbial communities in northern China[J].Applied Soil Ecology，2015，89：18-24.

［17］崔金杰，雒珺瑜，李樹紅，等.轉基因抗蟲棉對土壤微生物影響的初步研究[J].河北農業大學學報，2005，28（6）：73-75.

［18］張金國，劉翔，崔金杰，等.轉基因（Cry1Ac）抗蟲棉對土壤微生物的影響[J].中國生物工程雜志，2006，26（5）：78-80.

［19］CHEN Z H，CHEN L J，ZHANG Y L，et al.Microbial properties，enzyme activities and the persistence of exogenous proteis in soil under consecutive cultivation of transgenic cottons（Gossypium Hirsutum L.）[J].Plant and Soil Environment，2011，57（2）：67-74.

［20］CHEN Z H，CHEN L J，WU Z J.Relationships among persistence of Bacillus thuringiensis and Cowpea trypsin inhibitor proteins，microbial properties and enzymatic activities in rhizosphere soil after repeated cultivation with transgenic cotton[J].Applied Soil E-cology，2012，53：20-23.

［21］李永山，范巧蘭，劉凱，等.種植轉Bt基因棉花不同年限土壤PLFA指紋特征與差異[J].中國農業大學學報，2015，20（3）：30-37.

［22］BARTRAM A K，LYNCH M D J.Generation of multimillion-sequence 16S rRNA gene libraries from complex microbial communities by assembling paired-end Illuminareads[J].Applied and Environmental Microbiology，2011，77（11）：3846-3852.

［23］SINGH AMIT KISHORE，GOVIND KUMAR RAI.Bacterial community structure in the rhizosphere of a Cry1Ac Bt-brinjal crop and comparison to its non-transgenic counterpart in the tropical soil[J].Microb Ecol，2013，66：927-933.

Effects of Transgenic Cotton on Soil Bacteria Community

FANQiaolan1，2，LI Yongshan1，2，WANGHui1，2，XI Kaipeng1，2，XI Jilong1，2，SHI Jundong1，2，ZHANGJiancheng1，2
（1.Institute ofCotton，Shanxi Academy ofAgricultural Sciences，Yuncheng 044000，China；2.Yuncheng Academy ofAgricultural Sciences,Yuncheng 044000，China）

The experiement was conducted to evaluate the effects of transgenic cotton on soil bacterial community structure and diversity.Transgenic Bt cotton Jinmian 26 and its non-Bt parental line Jinmian 7,and traditional cultivar CRI 12 were used in long-term experiment site to evaluate the effects of transgenic cotton on soil bacterial community structure by high throughput sequencing method. High throughput sequencing analysis showed 1 585 OTUs were detected in soil bacterial communities.Twenty one phylum,one unclassified and 4 candidate bacteria were detected in soils.Dominant phylum were Proteobacteria,Acidobacteria,Actinobacteria, Planctomycetes,Chloroflexi,Bacteroidetes,Gemmatimonadetes,Nitrospirae/Firmicutes,Cyanobacteria,in all soils.Deinococcus-Thermus in transgenic Jinmian 26 soil and WCHB1-60 in non-Bt Jinmian 7 were found uniquely in phylum.Shannon index in Bt-soil bacteria was lower than non-Bt soil,and soil bacteria community structure was not affected by transgenic cotton.

transgenic cotton;soil;bacteria;community structure;high throughput sequencing

S154.38＋1

：A

：1002-2481（2017）07-1124-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.07.21

2016-12-29

山西省自然科學基金項目（2014011029-2）；國家自然科學基金項目（31372143，30871601）

范巧蘭（1965-），女，山西夏縣人，助理研究員，主要從事植物保護和轉基因植物安全評價研究工作。李永山為通信作者。