春石斛雜交種與藥用金釵石斛3種活性成分的比較研究

章金輝，王再花，旦真次仁，李 杰，朱根發

（1. 廣東省農科院環境園藝研究所/廣東省園林花卉種質創新綜合利用重點實驗室，廣東 廣州 510640；2. 林芝地區科技開發交流服務中心，西藏 林芝 860000）

春石斛雜交種與藥用金釵石斛3種活性成分的比較研究

章金輝1，王再花1，旦真次仁2，李 杰1，朱根發1

（1. 廣東省農科院環境園藝研究所/廣東省園林花卉種質創新綜合利用重點實驗室，廣東 廣州 510640；2. 林芝地區科技開發交流服務中心，西藏 林芝 860000）

比較分析了春石斛雜交種Dendrobium Second Love‘Tokimeki’與傳統藥用石斛金釵石斛活性成分，結果顯示，D. Second Love‘Tokimeki’9月至翌年1月的莖多糖含量均值高于金釵石斛；多糖DHPP-Ⅰ數均分子量和重均分子量均低于金釵石斛多糖DNPP-Ⅰ；兩種石斛莖都含有所檢測的19種氨基酸，金釵石斛所測的氨基酸總量高于D. Second Love‘Tokimeki’，但D. Second Love‘Tokimeki’的8種必需氨基酸總量高于金釵石斛；金釵石斛的Fe和B元素含量顯著高于D. Second Love‘Tokimeki’，而D. Second Love‘Tokimeki’的Mn、Zn、Cu元素含量顯著高于金釵石斛。通過兩種石斛3種活性成分比較可知，D. Second Love‘Tokimeki’ 多糖含量較高，但多糖DHPP-Ⅰ數均分子量和重均分子量均低于金釵石斛多糖DNPP-Ⅰ；D. Second Love‘Tokimeki’的氨基酸、礦質元素與金釵石斛組成相同，但含量有所差異。

石斛；多糖；氨基酸；礦質元素

石斛為蘭科石斛屬多年生草本植物，是一類重要的觀賞兼藥用植物，全世界約有1 500余種，主要分布于亞洲熱帶和亞熱帶地區至大洋州，我國共分布有74個種、2個變種。石斛的莖是名貴的中藥材，具有滋陰清熱、益胃生津、清肺明目和提高機體免疫力的功效。《本草綱目》中，李時珍認為石斛能“治發熱自汗，癰疽排膿內塞”。清代《藥性論》評稱石斛有補腎積精、益氣力、養胃陰等功效。

金釵石斛又名扁黃草等，盛產于云南、貴州等地，多糖和生物堿是金釵石斛的主要活性成分，同時氨基酸和微量元素也較豐富。春石斛雜交種的始祖源于中國的金釵石斛（Dendrobium nobile Lindl.）等名貴藥用石斛，經過多年的遺傳改良和選育，目前已達上萬個品種。當前關于金釵石斛的活性成分、多糖結構、藥理活性等方面的報道較多，而關于春石斛雜交種的報道較少，主要集中在組培增殖、試管開花［1］、花期調控［2］及不同器官多糖、生物堿含量研究［3］等方面，關于春石斛雜交種D. Second Love‘Tokimeki’的氨基酸、微量元素及分子量的研究還未見報道。現代研究證明，石斛具有降血糖［4］、抗氧化［5］、抗腫瘤［6-7］、祛痰鎮咳及增強免疫力［8-10］等作用，具有較高的藥用價值。春石斛雜交種一直作為觀賞性花卉進入市場，由于其始祖源于金釵石斛，因此，為了進一步開拓春石斛雜交種在藥用方面的潛在價值，本研究以比較春石斛雜交種與金釵石斛3種活性成分的異同為切入點，通過在活性成分上的比較為春石斛雜交種在藥用開發利用方面提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料金釵石斛（Dendrobium nobile Lindl.）和春石斛雜交種（Dendrobium Second Love ‘Tokimeki’），栽培于廣東省農科院環境園藝研究所溫室大棚內，為獨立盆栽，基質配方、光、溫、水肥管理一致。

1.2 試驗方法

1.2.1 多糖含量測定 （1）標準曲線制作。設置10個濃度梯度，分別吸取0.05 mg/mL的葡萄糖標準液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、2.0 mL，各加蒸餾水補至2.0 mL，然后各加6%重蒸苯酚1.0 mL，搖勻，再加入98%濃硫酸5.0 mL，搖勻，靜置5 min，再置于沸水浴中加熱20 min，冷卻至室溫，于490 nm處測定吸光度，繪制標準曲線，得到回歸方程為：y=0.0586x+0.0338 （R2=0.997）。

（2）多糖提取。取2.5 年生、9月至翌年1月兩種石斛的成熟莖，切成小段，105℃殺青15 min，以60℃烘干至恒重，再制成粉末，過0.25 mm篩。分別稱取兩種石斛干燥粉末各50 g置于1 000 mL圓底燒瓶中，然后加入石油醚（沸點60～90℃）500 mL，80℃回流提取1 h，抽濾、揮干、溶媒，再加石油醚，相同條件下重復1次；所得兩種石斛濾渣分別加入80%乙醇水溶液500 mL，再加入80%乙醇水溶液，相同條件下重復1次，得到兩種石斛脫脂干粉；兩種石斛脫脂干粉再分別加入蒸餾水500 mL，80℃浸提1 h，抽濾，收集濾液，重復索氏提取提1次；合并兩次濾液，減壓濃縮，加入預冷無水乙醇使溶液含醇量至80%，4℃靜置過夜，離心，收集沉淀，冷凍干燥得到兩種石斛粗多糖。將兩種石斛粗多糖配制成40 mg/mL的水溶液，以胰酶液和粗多糖溶液的體積比為0.4∶1，加入1 mg/mL的胰蛋白酶，37℃恒溫5 h后升溫滅酶，然后添加1/3體積的Sevag溶液，劇烈搖蕩5 min，離心，棄下層有機相。上層水相繼續加入1/3體積的Sevag溶液，按相同條件重復2次，合并上層水相，采用截留分子量為7 500 Da透析袋蒸餾水透析3 d；然后，加入預冷無水乙醇使溶液含醇量至80%，4℃靜置過夜，離心，收集沉淀，無水乙醇、丙酮各洗2遍，冷凍干燥后得到兩種石斛精多糖，分別命名為金釵石斛DNPP和春石斛雜交種DHPP。

（3）多糖與葡萄糖換算因子的測定。稱取金釵石斛精多糖10 mg溶于10 mL蒸餾水，配制濃度為50 μg/mL的多糖溶液，吸取樣品溶液0.1 mL，按照標準曲線制作的方法測定吸光度，計算樣品中葡萄糖的濃度，由下列公式計算換算因子f：

式中，Cs為石斛精多糖溶液的實際濃度，C為回歸方程計算石斛精多糖溶液中葡萄糖的濃度，f為校正系數。依公式計算可得金釵石斛多糖與葡萄糖換算因子f = 2.41，春石斛雜交種多糖換算因子參照金釵石斛。

（4）樣品溶液的測定。分別稱取3份金釵石斛和春石斛雜交種9月至翌年1月的石斛莖的干燥粉末各1 g，分別加入80%乙醇100 mL，80℃回流提取1 h，抽濾、揮干、溶媒，重復上述操作1次，所得濾渣加入純水100 mL，80℃回流提取1 h后抽濾，重復上述操作1次，合并濾液，蒸餾水定容至250 mL，搖勻，得到樣品溶液。采用改良的苯酚-硫酸比色法測定樣品溶液的石斛多糖含量X，計算公式為：

式中，f為石斛多糖與葡萄糖的換算因子，C為各石斛樣品溶液中葡萄糖含量，D為樣品稀釋倍數，W為石斛干粉重量。

1.2.2 多糖分子量測定 取2.5年生、9月至翌年1月兩種石斛的成熟莖，用蒸餾水洗凈，切成小段，以60℃烘干至恒重，再制成粉末，過0.25 mm篩，用于氨基酸、微量元素測定。

精多糖分級。預處理：取DEAE-52 100 g加入蒸餾水500 mL，浸泡24 h，使纖維素顆粒充分膨脹；去除懸浮的細顆粒后，再加4倍量的0.5 mo1/L HC1浸泡、攪拌4 h；濾去酸液，蒸餾水洗至中性，再加4倍量的0.5 mo1/L NaOH浸泡、攪拌4 h；濾去堿液，蒸餾水洗至中性。如此酸堿反復輪洗，直至洗出液無色澄清為止。最后再用0.5 mo1/L HCL洗滌，即制成Cl-型柱，脫氣，備用。將層析柱2.6 cm×50 cm垂直放置，倒入適量pH 8.0的0.05 mo1/L Tris-HCl緩沖液，將DEAE-52懸濁液緩慢傾入柱中，待其自然沉降至柱高的1/4～1/3時打開柱下端出口，讓溶液慢慢流出，保持吸附劑表面浸沒在溶液中，嚴防氣泡產生，以緩沖液平衡24 h。取多糖樣品100 mg溶于5 mL Tirs-HCl緩沖液（pH 8.0），4 000 r/min離心5 min，上清液用于上樣。先用適量蒸餾水洗脫后，再用0.3 mo1/L NaCl進行階段洗脫，洗脫速度控制在1 mL/min，部分收集器的轉速為8 mL/管，間隔每管取適量多糖溶液加蒸餾水補足2 mL，苯酚-硫酸法測定490 nm處吸光度。以洗脫液的管數為橫坐標，490 nm處吸光度為縱坐標作圖，得到洗脫曲線，合并主峰，凍干得到金釵石斛和春石斛雜交種D. Second Love‘Tokimeki’水溶性多糖，分別記為DNPP-I和DHPP-I；用0.3 mo1/L NaCl洗脫所得多糖分別記為DNPP-II和DHPP-II。

GPC條件：色譜柱：TSK SWXL 4000-3000（2柱串聯），300 mm（柱長）×7.8 mm（內徑），柱溫35℃；流動相：0.05 mol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液（pH 6.7，加0.05% NaN3）；體積流量：0.5 mL/min；示差折光檢測器，恒溫35℃；進樣量20 μL。GPC校正曲線：取已知相對分子質量分別為738、5 800、1.22×104、2.37 ×104、4.8×104、1.0×105、1.86×105、3.8×105的多糖標樣，用0.05 mol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液（pH 6.7，加0.05% NaN3）溶解，經0.45 μm濾膜濾過，進行GPC分析。取10 mg/mLDNPP-I和DHPP-I的樣品溶液，按照標準曲線中的條件操作，根據樣品的出峰時間在校正曲線上求得多糖峰的平均相對分子質量及其分布。

1.2.3 氨基酸含量測定 標準溶液及樣品制備：準確稱取10 mg 氨基酸標準品，蒸餾水定容至50 mL，得到200 mg/L的游離氨基酸標準儲備液，臨用時用空白溶劑稀釋得到1.0、5.0、10.0 mg/L系列標準溶液。準確稱取0.25 g樣品3份，分別置于250 mL容量瓶中，加入0.1 mol/L鹽酸后超聲處理30 min，過濾，再取2 mL水解處理，取水解前后的溶液各100 μL于液相色譜樣品小瓶中，60℃加熱并氮氣吹干，取出后，加入3.5 mol/L鹽酸正丁醇100 μL，密封樣品瓶，60℃衍生化反應30 min。然后60℃加熱，氮氣吹干，殘渣加80%乙腈1 mL，振蕩1 min，溶解，0.45 μm 針筒式濾器過濾，于LC-MS/MS測定。

色譜及質譜條件：色譜柱為BDS HYPERSIL C18（2.1 mm×150 mm，2.4 μm） ，流動相為乙腈-水（0.2%甲酸，10 mmol/L甲酸銨）梯度洗脫，梯度洗脫程序：乙腈比例變化為0 min，0%；5min，40%；7 min，80%；8～12 min，0%。流速為0.2 mL/min，進樣量1 μL。離子源：電噴霧（ESI），正離子電離模式，干燥氣（N2）流量為9.0 L/min，溫度為350℃，霧化氣（N2）壓力為275.8 kPa，電噴霧電壓為4 000 V，掃描方式為多反應監測（MRM）模式。

1.2.4 礦質元素含量測定 準確稱取0.50 g樣品3份，分置于50 mL三角瓶中，然后加入10 mL混合酸（9 mL硝酸+1 mL高氯酸）。密封浸泡過夜后，于電熱板上消煮（不超180℃），直至冒白煙，消化液呈無色透明為止，再于25 mL容量瓶中超純水定容，混勻，得測試液。采用石墨爐原子吸收分光光度計測定礦質元素含量。

試驗數據采用Excel和SPSS 13.0 軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 多糖含量比較

從圖1可以看出，不同月份的石斛莖的多糖含量是不同的，其中金釵石斛莖的多糖含量呈現10月（16.8%）＞11月（14.2%）≈9月（13.7%） ＞12月（10.0%） ＞翌年1月（4.1%）的趨勢；春石斛雜交種D. Second Love‘Tokimeki’則表現為12月（23.7%）＞9月（20.8%）＞11月（17.8%）≈10月（16.4%）＞翌年1月（9.5%）。金釵石斛莖多糖含量除10月份與D. Second Love ‘Tokimeki’無顯著差異外，其他月份多糖含量均顯著低于D. Second Love ‘Tokimeki’。

圖1 不同月份金釵石斛和春石斛雜交種莖多糖含量比較

2.2 多糖分子量比較

從圖2可以看出，用蒸餾水洗脫時，兩種石斛都會有大量的多糖被洗脫下來，而0.3 mol/L NaCl洗脫時兩種石斛只有一個較小的多糖洗脫峰；兩種石斛的水洗多糖DNPP-Ⅰ和DHPP-Ⅰ占絕大部分，而0.3 mol/L NaCl洗脫多糖DNPP-Ⅱ和DHPP-Ⅱ只有很少一部分。

多糖分子量的大小與其活性存在較大關系。從表1可以看出，數均分子量、重均分子量均是DHPP大于DNPP，而DHPP-Ⅰ的數均分子量和重均分子量均低于DNPP-Ⅰ，在分布寬度方面則呈現DHPP-Ⅰ＞DNPP＞DNPP-Ⅰ＞DHPP。

2.3 氨基酸含量比較

從表2可以看出，兩種石斛均含有所檢測的19種氨基酸，且兩種石斛均含有人體所必需的8種氨基酸，其中以苯丙氨酸含量最高。從必需氨基酸總量來看，金釵石斛、D. SecondLove‘Tokimeki’莖的含量分別為0.423%和0.454%，而游離氨基酸總量為金釵石斛高于D. Second Love‘Tokimeki’。

圖2 兩種石斛莖多糖DEAE-Cellulose-52 離子交換層析

表1 兩種石斛的多糖分子量及其分布

表2 兩種石斛莖中19種游離氨基酸含量比較

2.3 礦質元素含量比較

從表3可以看出，在所測的礦質元素中，兩種石斛均以Ca元素的含量最高，且D. Second Love‘Tokimeki’高于金釵石斛；其次是Mg和 K，金釵石斛的Mg和K元素含量高于D. Second Love‘Tokimeki’；微量元素表現為金釵石斛、D. Second Love‘Tokimeki’的Mn、Fe元素含量均較高。由于微量元素在維持生命活動中起著重要作用，因此通過微量元素含量的差異可推斷石斛的功效各有側重點。

表3 兩種石斛莖中8種礦質元素含量比較

3 結論與討論

多糖是石斛的主要藥效成分之一，李滿飛等［11］通過測定25種石斛36個樣品的多糖含量，發現石斛生理活性強弱與其多糖的含量有關。本試驗結果表明，不同月份之間，兩種石斛莖多糖含量高低沒有呈現一致的規律性，其中金釵石斛莖多糖含量最高為10月份，遠遠高于多數文獻所報道的水平［12］，這可能是試驗材料的差異和取材時間不同所致；D. Second Love‘Tokimeki’莖多糖含量以12月份最高，且顯著高于金釵石斛。若以多糖含量為評價標準，金釵石斛以10月為最佳采收季節，D. Second Love‘Tokimeki’以12月為最佳采收季節。

關于石斛多糖的分離、純化、分級已有一些報道，與本研究結果類似，王軍輝［13］將金釵石斛水提粗多糖用DEAE-纖維素分級分離，蒸餾水、NaCl梯度洗脫，Sephadex G-100、Sephacryl S-200進一步純化，分別得到2個水洗脫組分和5個鹽洗脫組分，其中蒸餾水洗脫組分的量最多。在眾多藥用石斛多糖的提取研究中，水溶性多糖均為主要組分，如霍山石斛［14］、細莖石斛［15］等。多糖分子量的大小與其活性存在較大關系，郝杰等［16］發現相對分子量最大的霍山石斛多糖S（平均分子量為14.79×105Da）對H2O2、·OH的清除作用強于其他多糖組分；鮑素華等［17］發現鐵皮石斛多糖分子質量小于3.53 ×104Da或大于7.44×104Da時抗氧化活性較高。本試驗所測兩種石斛莖多糖的重均分子量與前人報道的石斛多糖重均分子量的檢測范圍接近，多數在1×104～105Da之間［18］。可見，多糖分子量大小可能取決于多糖種類、純度和結構等。

氨基酸是人體的生理活性所需物質，近年來研究表明氨基酸與藥效存在著一定的關系［19］。何鐵光等［20］測定了鐵皮石斛原球莖17種氨基酸，其中7種是人體必需氨基酸，而本試驗測定了兩種石斛莖的19種游離氨基酸，均含有人體所必需的8種氨基酸。在所測氨基酸中，金釵石斛和D.Second Love‘Tokimeki’均以精氨酸（Arg）含量最高。精氨酸具有重要的生理，營養代謝功能如合成細胞漿蛋白和核蛋白，促進傷口復原，肌肉蛋白合成［21］分泌激素，以及改善性欲等作用。精氨酸也有改善腸道的機械屏障和損傷后的黏膜屏障功能［22-23］及促進小腸黏膜生長、發育、適應及恢復創傷等作用［24-25］，還具有提高機體免疫力［26］等作用。本試驗結果表明，金釵石斛莖的Arg、Lys和GABA含量均顯著高于D. Second Love‘Tokimeki’，而D.Second Love ‘Tokimeki’中有10種氨基酸含量顯著高于金釵石斛；從必需氨基酸總量來看，D. Second Love‘Tokimeki’要高于金釵石斛。

人體雖然對微量元素的需求量低，但其在維持人體正常生理功能和生長發育方面起著非常重要的作用［27］。研究發現，鐵、錳、鉻、鋅、鈣、鎂、銅等元素在造血、保持人體機體免疫力、神經系統發育、生長、生殖發育方面起著重要作用，也對糖尿病、尿毒癥等疾病的發生發展發揮著一定的影響［28-29］。金釵石斛莖的Fe和B含量顯著高于D. Second Love‘Tokimeki’，說明金釵石斛可能在預防貧血和維持機體免疫力和抗感染能力方面較強；而D. Second Love‘Tokimeki’的Mn、Zn、Cu含量顯著高于金釵石斛，說明D. Second Love‘Tokimeki’可能在促進骨骼發育和繁殖性能方面的功效更強。

綜上所述，D. Second Love‘Tokimeki’與傳統藥用石斛金釵石斛相比，在多糖含量方面要優于金釵石斛，春石斛雜交種DHPP-Ⅰ數均分子量和重均分子量均低于金釵石斛DNPP-Ⅰ。在總氨基酸總量方面雖低于金釵石斛，但有達10種氨基酸顯著高于金釵石斛，且從必需氨基酸總量來看，D. Second Love‘Tokimeki’的8種必需氨基酸總量高于金釵石斛。礦質元素方面，春石斛品種D. Second Love‘Tokimeki’的Ca、Mn、Zn和Cu含量較多，具有一定的優勢。通過春石斛雜交種D. Second Love‘Tokimeki’與傳統藥用石斛金釵石斛活性成分比較分析，為春石斛雜交種作為金釵石斛的替代品進行開發提供了理論依據。

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（責任編輯 鄒移光）

Comparative study of three kinds of active ingredients between Nobile-type Dendrobium and Dendrobium nobile Lindl.

ZHANG Jin-hui1，WANG Zai-hua1，DANZhen ci-ren2，LI Jie1，ZHU Gen-fa1
（1.Environmental Horticulture Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences /Guangdong Key Lab of Ornamental Plant Germplasm Innovation and Utilization，Guangzhou 510640，China；2.Linzhi Science and Technology Development and Communication Service Center，Linzhi 860000，China）

This paper analyzed the active ingredients contents betwenDendrobium Second Love‘Tokimeki’and the traditional medicinalD. nobileto provide reference for the development ofD. Second Love‘Tokimeki’. The content of polysaccharide was determined by phenol sulfuric acid colorimetry，and the molecular weight of polysaccharides was detected by Gel Permeation Chromatography. The content of free amino acid was determined by LC-MS/MS. The mineral element content was determined by Graphite furnace atomic absorption spectrophotometer 240ZAA（GTA120Z）. Results showed that the mean value of polysaccharide content ofD. Second Love‘Tokimeki’was higher than that ofD. nobilefrom September to January of next year，the number-average molecular weight and weight- average molecular weight of DHPP-ⅠofD. Second Love‘Tokimeki’ were lower than DNPP-ⅠofD. Nobile. There were 19 kinds of free amino acids measured in both species ofDendrobiums，the total free amino acid content ofD. nobilewas higher than that ofD. Second Love‘Tokimeki’，but the total content of eight kindsof essential amino acids inD. Second Love‘Tokimeki’ was higher than that ofD. Nobile. The content of Fe and B elements ofD. nobilewere higher than those ofD. Second Love‘Tokimeki’，but the content of Mn，Zn and Cu elements ofD. Second Love‘Tokimeki’ were higher than those ofD. Nobile. By comparative analysis of three kinds of active ingredients in both species ofDendrobiums，we can know that the polysaccharide content ofD. Second Love‘Tokimeki’ was higher，and the number-average molecular weight and weight-average molecular weight of DHPP-Ⅰ ofD. Second Love‘Tokimeki’ were lower than DNPP-ⅠofD. Nobile，the composition of free amino acids and mineral element in both species ofDendrobiums were the same，but the contents were different. The results could provide a reference for the medicinal development ofD. Second Love‘Tokimeki’ .

Dendrobium；polysaccharide；free amino acids；mineral element

S567.23+9

A

1004-874X（2017）04-0024-08

章金輝，王再花，旦真次仁，等. 春石斛雜交種與藥用金釵石斛3種活性成分的比較研究［J］.廣東農業科學，2017，44（4）：24-31.

2016-11-08

廣東省科技計劃項目（2015A020210084，2014A020209058）

章金輝（1986-），男，碩士，助理研究員，E-mail：zhangjinhui41@163.com

朱根發（1968-），男，博士，研究員， E-mail：genfazhu@163.com