4種保存液對犬紅細胞低溫保存效果的比較

李 燕， 王昌虹， 劉新峰， 郝志明， 丁向彬

(天津農學院動物科學與動物醫學學院，天津 300384)

4種保存液對犬紅細胞低溫保存效果的比較

李 燕， 王昌虹， 劉新峰， 郝志明， 丁向彬*

(天津農學院動物科學與動物醫學學院，天津 300384)

犬類紅細胞低溫保存具有較大的臨床應用價值，犬紅細胞低溫保存液對犬紅細胞低溫保存的時間和保存效果具有重要影響，該實驗選用CPDA-1、CPDA-2、CPDA-3和MAP保存液對犬紅細胞進行4 ℃下低溫保存，于保存的第0、10和20天分別檢測各組紅細胞樣品的紅細胞數及K+、Na+和Cl-的濃度，對低溫保存效果進行比較，以尋找適合犬紅細胞低溫保存的保存液。結果表明：選用MAP保存液對犬紅細胞進行保存時，紅細胞相對減少量顯著低于其它組(P<0.05)，紅細胞樣品中K+濃度的相對增加量顯著低于其它組(P<0.05)，Na+和Cl-濃度的相對減少量顯著低于其它組(P<0.05)，說明MAP保存液較適合用于犬紅細胞的低溫保存。

犬；紅細胞；低溫保存；紅細胞保存液

隨著養犬人群的日益增長，犬的健康問題得到了越來越多的關注，當犬出現貧血、失血及嚴重感染性疾病時必須緊急輸血，輸血療法是搶救這些危重病例最有效的方法。輸血可以起到迅速補充循環血量、維持一定血壓、增加血液的凝固性和血紅蛋白的濃度、增加血液運輸氧的能力以及刺激機體的造血機能等作用。但是新鮮血源并不容易找到，要依靠血庫提供可用血液，目前在發達國家已有商業性動物血庫或中心，而我國在這方面的工作亟待開展。延長犬血液的保存期限，避免血資源浪費，顯得尤為重要。存放時間和溫度對血液中紅細胞的功能具有較大的影響[1-2]。紅細胞保存有4 ℃下的短期保存和-80 ℃或-196 ℃深低溫長期保存，前者保存期為35～42 d，由于保存期短，往往造成大量紅細胞的浪費，后者保存期可長達10年，但應用于臨床耗時費力，保存費用昂貴，僅用于稀有血型的保存。經歷了從常溫保存到低溫保存再到深低溫保存的長期發展，人體血液的保存技術已經日趨成熟。紅細胞低溫保存研究在人上進行的比較多，犬類紅細胞低溫保存的研究還比較少。在人紅細胞4 ℃低溫保存研究中使用過的保存液有ACD保存液、CPD保存液、CPDA保存液和MAP保存液等[3-5]。這些保存液對犬紅細胞低溫保存的效果還需要進一步研究，本實驗選用人類的紅細胞保存液(MAP保存液、CPDA-1保存液、CPDA-2保存液、CPDA-3保存液)對犬的紅細胞進行低溫保存研究，以期找到適合犬紅細胞低溫保存的保存液，延長犬紅細胞低溫保存的時間，為犬紅細胞低溫保存研究及動物血庫建立提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 動物

健康雄性犬，3歲，臨床檢查血液相關指標正常，無受血經歷。

1.2 試劑

氯化鈉、葡萄糖、甘露醇、腺嘌呤、磷酸二氫鈉、檸檬酸鈉、檸檬酸，均購自天津北方化玻采購銷售中心。

1.3 液體配制

1) CPDA-1紅細胞保存液 檸檬酸鈉2.63 g，檸檬酸0.327 g，磷酸二氫鈉0.222 g，葡萄糖3.19 g，腺嘌呤0.027 g，加蒸餾水至100 mL。

2) CPDA-2紅細胞保存液 檸檬酸鈉2.63 g，檸檬酸0.327 g，磷酸二氫鈉0.222 g，葡萄糖4.46 g，腺嘌呤0.054 g，加蒸餾水至100 mL。

3) CPDA-3紅細胞保存液 檸檬酸鈉2.63 g，檸檬酸0.327 g，磷酸二氫鈉0.222 g，葡萄糖5.1 g，腺嘌呤0.054 g，加蒸餾水至100 mL。

4) MAP紅細胞保存液 葡萄糖0.793 g，磷酸二氫鈉0.094 g，氯化鈉0.497 g，甘露醇1.457 g，檸檬酸鈉0.15 g，腺嘌呤0.014 g，檸檬酸0.02 g，加蒸餾水至100 mL。

1.4 血液采集及低溫保存紅細胞樣品制備

用加入相應比例抗凝劑(3.8%檸檬酸鈉溶液，與血液比例為1∶9)的注射器采集犬前肢內側靜脈血液，離心收集紅細胞，以3 000 r/min離心10 min，棄上清液，制成濃縮紅細胞。將濃縮紅細胞分為4組，每組按1∶1比例加入CPDA-1保存液、CPDA-2保存液、CPDA-3保存液和MAP保存液，每組樣品分裝到9個保存管中，將添加各種不同保存液的紅細胞放入4 ℃冰箱中密封保存。于保存的第0、10和20天分別檢測各組紅細胞樣品的紅細胞數量及K+、Na+和Cl-的濃度。

1.5 紅細胞計數及K+、Na+和Cl-濃度測定

吸取10 μL各組紅細胞樣品，用900 μL 0.9%生理鹽水稀釋，然后采用血細胞計數板對各組紅細胞進行計數。

吸取500 μL各組紅細胞樣品，3 000 r/min離心10 min，吸出上清，采用IMS-972電解質分析儀檢測上清中K+、Na+和Cl-的濃度。

1.6 統計學分析

本實驗數據使用SPSS 17.0軟件進行分析，數據資料分析以均值±標準差(x±sd)表示，P<0.05表示有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 不同保存液對低溫保存后紅細胞數量的影響

通過紅細胞計數法對4種保存液中紅細胞的數量進行計數，由表1可知，隨著保存時間的延長，各組低溫保存樣品中紅細胞數量與保存前(第0天)樣品中紅細胞數量相比均有不同程度的下降。各組之間紅細胞的相對減少量均差異顯著(P<0.05)。其中,CPDA-3組的紅細胞減少量最高，MAP組的紅細胞減少量最低，說明MAP保存液較適合用于犬紅細胞的低溫保存。

表1 不同保存液中紅細胞數量變化

注：同列中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),紅細胞減少量為第20天和第0天比較。

2.2 不同保存液對低溫保存紅細胞樣品中K+濃度的影響

采用電解質分析儀檢測4組紅細胞樣品上清中K+的濃度。由表2可知，隨時間的延長各組紅細胞樣品上清中K+濃度均呈上升趨勢，各組低溫保存樣品中K+濃度與保存前(第0天)樣品中K+濃度相比均有不同程度的上升。其中,CPDA-3組K+濃度的相對增加量最高，MAP組K+濃度的相對增加量最低，MAP組與其它各組均存在顯著差異(P<0.05)，說明MAP保存液較適合用于犬紅細胞的低溫保存。

表2 不同保存液中K+濃度變化

注：同列中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。K+相對增加量為第20天和第0天比較。

2.3 不同保存液對低溫保存紅細胞樣品中Na+和Cl-濃度的影響

采用電解質分析儀檢測4組紅細胞樣品上清中Na+的濃度。由表3可知，隨時間的延長各組紅細胞樣品上清中Na+濃度均呈下降趨勢，各組低溫保存樣品中Na+濃度與保存前(第0天)樣品中濃度相比均有不同程度的下降。其中,CPDA-3組Na+濃度的相對減少量最高，MAP組Na+濃度的相對減少量最低，MAP組與其它各組均存在顯著差異(P<0.05)。

表3 不同保存液中Na+濃度變化

注：同列中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，Na+相對減少量為第20天和第0天比較。

采用電解質分析儀檢測4組紅細胞樣品上清中Cl-的濃度。由表4可知，隨時間的延長各組紅細胞樣品上清中Cl-濃度均呈下降趨勢，各組低溫保存樣品中Cl-濃度與保存前(第0天)樣品中濃度相比均有不同程度的下降。其中,CPDA-3組Cl-濃度的相對減少量最高，MAP組Cl-濃度的相對減少量最低，MAP組與其它各組均存在顯著差異(P<0.05)。

表4 不同保存液中Cl-濃度變化

注：同列中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，Cl-相對減少量為第20 天和第0天比較。

3 討論

紅細胞形態學的改變影響和反映了紅細胞質量及回輸后的功能。紅細胞在保存過程中，隨著保存時間的延長，紅細胞會發生保存損傷[6-7]和細胞老化現象。紅細胞突然接觸血袋中的高滲或低滲溶液、抗凝劑和添加劑，或溶液pH值發生驟變，都可能引起紅細胞滲透脆性增高或紅細胞的破壞。有研究表明，隨著紅細胞保存時期的延長，超氧化物歧化酶活性下降，使紅細胞內自由基清除效率降低，紅細胞膜的脂質過氧化，膜結構和功能被破壞，進而使紅細胞損傷和死亡[8]。也有研究表明，紅細胞保存過程中ATP水平的下降會影響紅細胞膜上ATP酶的活性，造成紅細胞的損傷，使紅細胞存活率下降[9]。紅細胞膜結構的破壞容易導致紅細胞溶血，隨著保存時間的延長，溶血現象逐漸嚴重，紅細胞的數目也相應地不斷減少。在紅細胞低溫保存研究中，研究者們開發出了多種紅細胞保存液，比如ACD保存液(檸檬酸+檸檬酸鈉+葡萄糖)、CPD保存液(檸檬酸+檸檬酸鈉+葡萄糖+磷酸鹽)、CPDA保存液(檸檬酸+檸檬酸鈉+葡萄糖+磷酸鹽+腺嘌呤)和MAP保存液(檸檬酸+檸檬酸鈉+氯化鈉+腺嘌呤+葡萄糖+甘露醇+磷酸鹽)[3-5]。保存液是血細胞保存的外部環境，保存體系的成分組成，以及各種理化性質如電導率、滲透壓、pH值等對于細胞的代謝和氧化作用影響很大[10]。合適的保存液對改善血細胞保存質量，延長血液保存時間有著重要的意義。

本實驗選用CPDA-1、CPDA-2、CPDA-3和MAP保存液對犬的紅細胞進行4 ℃下低溫保存，以尋找適合犬紅細胞保存的保存液，試驗結果表明，隨著紅細胞保存時間的延長，各保存液組的溶血現象都逐漸加重，紅細胞的數量也不斷減少，溶血現象逐漸嚴重。其中，MAP組的紅細胞數目減少量最少，說明從保存后紅細胞的數目看，MAP保存液的保存效果最好。

鉀是生命所必需的無機離子之一，對人和動物機體極其重要，血清鉀的高低對機體的影響較大，紅細胞內鉀濃度約為105 mmol/L，血清中鉀濃度僅為3.5～5.5 mmol/L，紅細胞內鉀濃度約為血清鉀濃度的20倍。在紅細胞保存過程中，K+濃度可以反映出紅細胞破壞的程度。隨保存時間延長紅細胞膜上的脂蛋白及脂質逐漸喪失，紅細胞內K+逐漸釋放至紅細胞外，致使紅細胞懸液的K+含量升高[11]。本試驗結果發現，采用不同的保存液對犬紅細胞進行低溫保存后，隨著保存時間的延長各組K+濃度逐漸升高，在保存的第10天和第20天紅細胞樣品中K+濃度均高于保存前K+的濃度，說明保存后紅細胞確實有不同程度的破壞。其中，MAP組K+濃度的相對增加量最低，說明MAP保存液較適合用于犬紅細胞的低溫保存。

鈉有維持血壓的功能，鈉調節細胞外液容量，構成細胞外液滲透壓，細胞外液鈉濃度的持續變化對血壓有很大影響。體內水量的恒定主要靠鈉的調節。有研究表明，在紅細胞體外保存過程中，隨著保存天數的增多，紅細胞懸液中的Na+和Cl-含量隨著保存期延長而逐漸降低[11-12]。這可能是由于保存后紅細胞受不同程度的破壞，紅細胞懸液的K+含量升高，Na+和Cl-濃度的下降有助于維持紅細胞內外的離子濃度平衡。本試驗結果發現，用不同的保存液對犬的紅細胞進行低溫保存后，隨著保存時間的延長各組Na+和Cl-濃度逐漸降低，在保存的第10天和第20天紅細胞樣品中Na+和Cl-濃度均低于保存前的濃度，隨著保存時間的延長，紅細胞內外離子濃度變化加劇，這種離子濃度的變化可能會對紅細胞的形態和脆性造成影響，使其更易發生溶血。本試驗中，MAP組Na+和Cl-濃度的相對減少量最低，說明MAP保存液較適合用于犬紅細胞的低溫保存。

4 結論

本試驗選用CPDA-1、CPDA-2、CPDA-3和MAP保存液對犬的紅細胞進行4 ℃下低溫保存，通過紅細胞樣品中紅細胞數及K+、Na+和Cl-的濃度變化檢測對犬紅細胞低溫保存的效果進行研究。試驗結果表明，選用MAP保存液對紅細胞進行保存時，紅細胞相對減少量、紅細胞樣品中K+濃度的相對增加量、Na+和Cl-的相對減少量均顯著低于其它組，說明MAP保存液中紅細胞破壞較少，紅細胞內外離子濃度變化較小，有利于維持紅細胞的正常形態，比較適合用于犬紅細胞的低溫保存。

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Effects of four different preservation solutions on low-temperature preservation of canine erythrocyte

LI Yan, WANG Changhong, LIU Xinfeng, HAO Zhiming, DING Xiangbin*

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,TianjinAgriculturalUniversity,Tianjin300384,China)

Low-temperature preservation of canine erythrocyte has important clinical value，the preservation solution plays an important role in canine erythrocyte preservation. In this study, four different preservation solutions (CPDA-1, CPDA-2, CPDA-3 and MAP) were used for canine erythrocyte preservation at 4 ℃, the proper preservation solution was selected according to the erythrocyte number and K+, Na+and Cl-concentrations. The results showed that the erythrocyte number in preservation solution was decreased, and the reduction number of erythrocyte in MAP group was significantly lower than that of other groups (P<0.05). The K+concentration in preservation solution was increased, but the K+augmenter in MAP group was significantly lower than that of other groups (P<0.05). The Na+/Cl-concentration in preservation solution was decreased, but the Na+/Cl-concentration decrements in MAP group was significantly lower than that of other groups (P<0.05). These results indicated the MAP solution was more suitable for the low-temperature preservation of canine erythrocyte.

canine; erythrocyte; low-temperature preservation; erythrocyte preservation solutions

2017-03-26 基金項目：天津市“131”創新型人才培養計劃第2層次人選資助計劃項目

李燕(1991—)，女，貴州遵義人，在讀碩士，研究方向為動物細胞工程與繁殖生物技術。丁向彬為通信作者，

E-mail：xiangbinding@163.com

1004-7999(2017)02-0071-05

10.13478/j.cnki.jasyu.2017.02.012

S829.2

A