溫度和光照對浮游植物葉綠素a提取的影響

曹鑫盛，武君君，孫成渤，通信作者

（1. 天津農學院 國家實驗教學示范中心，水產生態與養殖重點實驗室，天津 300384；2. 上海四鰓鱸水產科技發展有限公司，上海200433）

溫度和光照對浮游植物葉綠素a提取的影響

曹鑫盛1，武君君2，孫成渤1，通信作者

（1. 天津農學院 國家實驗教學示范中心，水產生態與養殖重點實驗室，天津 300384；2. 上海四鰓鱸水產科技發展有限公司，上海200433）

采用分光光度法測定浮游植物中葉綠素a的含量，研究光照和溫度對提取浮游植物葉綠素a的影響，以確定提取浮游植物葉綠素a的最佳條件。在抽濾過程中嚴格避光，并用冰水混合物冷卻至0 ℃保存，抽濾水樣。浸提分為避光（低于200 lx）冷藏（-1～1 ℃）組、光照（1 100～1 700 lx）冷藏（-1～1 ℃）組、避光（低于 200 lx）常溫（26～30 ℃）組和光照（1 100～1 700 lx）常溫（26～30 ℃）組，每組放入10 mL丙酮溶液（90%）浸提19 h。4組平均提取量分別為：避光冷藏組155.73 μg/L；光照冷藏組136.24 μg/L；避光常溫組116.67 μg/L；光照常溫組89.85 μg/L。結果表明浮游植物葉綠素a的最佳提取條件為冷藏、避光。

葉綠素a；浸提；溫度；光照

葉綠素 a是水體初級生產力的重要指標，測定葉綠素 a可以了解水體的生產力和富營養化水平，是水質監測的常規項目。但葉綠素 a并不穩定，它在高溫或有光的條件下易發生降解，影響測定結果。浮游植物葉綠素 a的測定方法有分光光度法[1]、熒光法[2]和高效液相色譜法[3]。熒光法具有高效、靈敏的優點，高效液相色譜法可以同時測定多種色素，所得結果更能準確反映浮游植物的生物量，但兩種方法所需儀器價格昂貴，操作復雜，難以作為常規的監測方法。一般將GB17378.7—2007[4]中的可見分光光度法作為常規監測方法，規范中采用90%的丙酮溶液作為溶劑，通過浸提，提取葉綠素a。因免去研磨過程，所以該方法方便、安全，且誤差較小。GB17378.7—2007中未提出影響浸提過程的相關因子，但試驗數據表明，溫度和光照直接影響浮游植物葉綠素 a含量的測定結果，這一點與相關研究相近[5]。本試驗采用 GB17378.7—2007可見分光光度法檢測浮游植物葉綠素a，對影響浸提過程中的主要因子（溫度和光照）引起的誤差進行對比試驗，探究減少浸提過程中浮游植物葉綠素a降解的方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

孔徑0.45 μm的醋酸纖維濾膜；2.5 L有機玻璃采水器；M50型砂芯過濾裝置；LD4-2A離心機；2XZ型旋片式真空泵；721分光光度計；醫用冷藏冷凍箱；TES-1334A照度計；10 mL塑料離心管；BS124S電子分析天平。

1.2 采樣點

設天津市楊柳青子牙河西河閘段A、B兩點，采集A、B兩點斷面混合樣（圖1）。

圖1 子牙河西河閘段采樣點示意圖

1.3 方法

1.3.1 研究方法

按照GB17378.7—2007規定，用2.5 L有機玻璃采水器在子牙河西河閘段采集水面至水下 1.2 m的混合水樣，在每升水樣中加入1 mL碳酸鎂溶液（10 mg/L）并混勻，將水樣在避光條件下運至實驗室，參照有關研究方法[6-8]，結合采樣點情況，確定抽濾水樣體積為250 mL[9]，使用M50型砂芯過濾裝置及孔徑 0.45 μm的醋酸纖維濾膜進行抽濾。將抽濾后得到的水樣分為4組（表1）（每組設置 2個平行樣），每組加入 10 mL丙酮溶液（90%），在10 mL塑料離心管中浸提19 h。再將浸提后的提取液使用 LD4-2A離心機以 3 500 r/min的轉速離心。最后使用721分光光度計分別依次在750、664、647、630 nm波長處對離心后提取液的上清液測定吸光值，并使用計算方法中“1.3.2.1葉綠素a分光光度法計算”進行葉綠素a含量的計算，計算每組平行水樣的平均值。

表1 抽濾后水樣的4組浸提條件

4組水樣均浸提19 h，浸提過程中振搖1～2次，以減小因溶劑分布不均造成的誤差。

1.3.2 計算方法

1.3.2.1 葉綠素a分光光度法計算

將各組提取液經離心后的上清液在664、647、630 nm波長下測得的吸光值，減去其在750 nm波長下測得的吸光值，得到校正后的吸光值 E664、E647、E630，再按公式（1）計算葉綠素a的含量。

式中：ρ（chl-a）為樣品中葉綠素a含量，單位：μg/L；V為水樣品實際用量，單位：L；L為測定池光程，單位：cm；u為樣品提取液體積，單位：mL。

1.3.2.2 標準差

1.3.2.3 變異系數

式中：S為標準差值；X為數據的算術平均值；CV為變異系數。

2 結果與分析

不同浸提條件對葉綠素 a的提取量有顯著影響（圖2）。冷藏（-1～1 ℃）組提取的葉綠素 a含量顯著高于常溫（26～30 ℃）組。常溫（26～30 ℃）組葉綠素a的浸提易受天氣狀況影響，所得數據波動較大。因此，葉綠素 a的浸提過程是否具備冷藏條件，很大程度上影響著提取結果的準確性。

4個試驗組中，葉綠素a的提取量存在顯著差異（P＜0.01）。根據圖2與表2，3分析，4個試驗組葉綠素 a的提取量從多到少依次為：避光冷藏組＞光照冷藏組＞避光常溫組＞光照常溫組，說明無論是常溫還是冷藏，光照條件下葉綠素 a的降解較快，避光條件下葉綠素a分解相對較慢[5-10]，且在單因素條件下，溫度要比光照對葉綠素 a的降解影響更加顯著。

圖2 不同提取方法測定樣本葉綠素a含量結果

表2 A、B點光照與避光條件下溫度對葉綠素a提取效果的影響

表3 A、B點冷藏與常溫條件下光照對葉綠素a提取效果的影響

3 討論

3.1 光照和溫度對葉綠素a提取量的影響

張武昌等研究了溫度和光照對葉綠素 a的降解速率的影響[5]，得出了葉綠素a在不同光照條件及不同溫度的黑暗條件下的降解規律。本研究中，避光（低于200 lx）常溫（26～30 ℃）組與光照（1 100～1 700 lx）常溫（26～30 ℃）組葉綠素a的提取量平均變異系數為27.26%（避光常溫組平均提取量高于光照常溫組），避光（低于200 lx）冷藏（-1～1 ℃）組與光照（1 100～17 00 lx）冷藏（-1～1 ℃）組葉綠素 a的提取量平均變異系數為11.30%，表明葉綠素a的光降解速率在常溫（26～30 ℃）條件下明顯快于冷藏（-1～1 ℃）條件。本試驗結果與張武昌等[5]的研究結果對應，但由于所研究的溫度條件不同，故無法進行數據的比較。

由表2，3可知，避光冷藏組與光照冷藏組葉綠素a提取量的平均變異系數為11.30%（避光冷藏組平均提取量高于光照冷藏組），避光冷藏組與避光常溫組葉綠素 a提取量的平均變異系數為27.84%（避光冷藏組平均提取量高于避光常溫組），說明在浸提過程中，光照條件對提取效果的影響小于溫度，本項對比補充了張武昌等[5]關于溫度和光照對葉綠素 a降解速率影響研究中未涉及的方面。

3.2 其他測定條件對葉綠素a降解速率的影響

葉綠素 a的降解可分為暗降解和光降解，根據張武昌等[5]研究表明，光照和溫度影響葉綠素a的降解，在-20 ℃條件下，葉綠素 a在黑暗中幾乎不降解，在15 ℃條件下，葉綠素a光降解的速度非常快，而暗降解的速度則較慢。

本試驗每次離心時間為10 min，葉綠素a在離心過程中降解率為0.02%；抽濾時間為90 min，葉綠素a在抽濾過程中降解率為0.18%。因此，在室溫且避光的條件下，離心和抽濾過程中葉綠素a的降解量非常低。

參照 GB17378.7—2007中的方法，結合實際操作過程，注意水樣在加入碳酸鎂（10 g/L）溶液后，要置于黑暗環境中保存，如需轉移，其轉移過程也要求嚴格避光。抽濾過程中，由于抽濾液的體積和濃度不同，造成抽濾時間的不一致，以及抽濾過程中環境光照強度的變化會影響測定結果，所以抽濾過程也應嚴格避光。水樣移入比色皿后，應盡快完成測定，以減少葉綠素 a的光降解。根據周靜等[11]研究表明，葉綠素a浸提過程如果采用塑料材質（丙酮對塑料具有腐蝕作用）的離心管作為容器或者冷藏時間過長，測定浮游植物葉綠素a 的提取量都會偏大。

4 結論

對比各試驗組葉綠素 a的提取結果、水樣的保存、抽濾及浸提過程，冷藏（-1～1 ℃）和避光（光照低于 200 lx）條件下浮游植物葉綠素 a的提取量最大（平均提取量155.73 μg/L）。若浸提不能滿足避光（光照低于200 lx）條件，也必須滿足冷藏（-1～1 ℃）要求，這樣才能獲得相對精準有效的葉綠素a浸提數據。

[1] 王玉芳，楊士斌，劉得銀，等. 浮游植物葉綠素a含量不同方法測定比較-以白洋淀區域水體為例[J]. 水文，2014，34（5）：57-60.

[2] Yentsch C S，Menzel D W. A method or the determination of phytoplankton chlorophyll and phaeophytin by fluorescene[J].Deep Sea Research，1963，10：221－231.

[3] Schmid H，Bauer F，Stich H. Determination of algal biomass with HPLC pigment analysis from lakes of different trophic state in comparison to microscopically measured biomass[J].Journal of Plankton Research，1998，20：1651－1661.

[4] 國家標準化管理委員會. 海洋監測規范：第7部分：GB17378.7—2007[S]. 北京：中國標準出版社，2008.

[5] 張武昌，王榮. 光和溫度對葉綠素a和脫鎂葉綠酸a降解的影響[J]. 海洋科學，2000，2（4）：50－52.

[6] 劉麗雪，王玉玨，邸寶平，等. 2012年春季渤海中部及鄰近海域葉綠素a與環境因子的分布特征[J]. 海洋科學，2014，38（12）：8－15.

[7] 鄭曉艷，郭雋. 淺談地表水葉綠素a含量的測定[C]//中國環境科學學會. 中國環境科學學會學術年會論文集（第四卷）：2013年卷. 北京：中國環境科學出版社，2013.

[8] 黃昌妙，葉樹才，王潮. 浮游植物葉綠素a測定方法的比較分析[J]. 福建分析測試，2013，22（4）：23－27.

[9] 林少君，賀立靜，黃沛生，等. 浮游植物中葉綠素a提取方法的比較與改進[J]. 生態科學，2005，24（1）：9－11.

[10] 徐彩平，劉霞，陳宇煒. 浮游植物葉綠素a濃度測定方法的比較研究[J]. 生態與農村環境學報，2013，29（4）：438－442.

[11] 周靜，胡忠軍，李培培，等. 基于葉綠素a測定的分光光度法與bbe法比較：以千島湖為例[J]. 水生態學雜志，2013，34（2）：80-84.

責任編輯：張愛婷

Effective of Temperature and Illumination on Extraction of Chlorophyll a in Phytoplankton

CAO Xin-sheng1, WU Jun-jun2, SUN Cheng-bo1,CorrespondingAuthor
（1. National Experimental Teaching Demonstration Center of Aquatic Ecology and Breeding Key Laboratory, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. Shanghai Sisailu Aquatic Science & Technology Development Co. Ltd,Shanghai 200433, China）

The spectrophotometric method in different conditions of light and temperature, extraction of phytoplankton chlorophyll a determined, to study the different illumination and temperature on the extraction of phytoplankton chlorophyll a and determine phytoplankton chlorophyll a in the optimum conditions of extraction. Strictly avoid light in the filtration process,and use the ice water mixture is cooled to 0 ℃ preservation, water filtration. Leaching provided to avoid light（less than 200 lx refrigerated（-1-1 ℃）group, light（1 100-1 700 lx）cold（-1-1 ℃）group, evades the light（less than 200 lx）at room temperature（26-30 ℃）group and light（1 100-1 700 lx）at room temperature（26-30 ℃）group, each group into the 90% acetone solution extraction 19 h. The average extraction amounts of the four groups were as follows: 155.73 μg/L of the cold storage group and 136.24 μg/L in the light cold storage group, 116.67 μg/L in the ambient temperature group and 89.85 μg/L in the normal temperature group. The results showed that the optimal extraction conditions of phytoplankton chlorophyll a were cold storage and light avoidance.

chlorophyll a; extraction; temperature; illumination

X832

：A

2016-03-08

國家星火計劃項目“水產品健康養殖、加工與質量安全控制產業化示范——南美白對蝦健康養殖技術示范與推廣”（S2011A100020）

曹鑫盛（1993-），男，廣西桂林人，本科在讀，主要從事水產科學方面的研究。E-mail：wamlybh@163.com。

孫成渤（1957-），男，山東長島人，教授，學士，主要從事水生生物學和養殖水域生態系統修復技術的研究。E-mail：sunchengbo2003@sohu.com。

1008-5394（2017）02-0049-04