木瓜黃精膏對衰老模型小鼠腎細胞凋亡的影響

郭芙蓮

（漯河醫學高等?？茖W校，河南漯河462002）

木瓜黃精膏對衰老模型小鼠腎細胞凋亡的影響

郭芙蓮

（漯河醫學高等?？茖W校，河南漯河462002）

目的探討木瓜黃精膏（PRO）對衰老模型小鼠組織勻漿中MDA含量、SOD活性以及腎細胞凋亡和凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2表達的影響。方法注射D-半乳糖造模，同時給予不同劑量的PRO，采用DNA末端標記法（TUNEL）以及免疫組化SP法觀察腎細胞凋亡與腎臟Bax和Bcl-2表達水平。結果40日后，PRO可顯著提高小鼠組織勻漿中SOD活性，顯著降低MDA含量，與衰老模型組相比有顯著性差異（P＜0.01）。PRO組腎臟細胞凋亡率明顯下降（P＜0.05或P＜0.01），Bcl-2表達增強，Bax表達及Bax/Bcl-2比值下調（P＜0.05或P＜0.01），尤以PRO大、中劑量組作用顯著。結論PRO具有較好的體內抗氧化作用。

木瓜黃精膏；抗氧化；SOD；MDA；Bax；Bcl-2

目前，我國已進入老齡化社會，截至2014年底，60歲以上老年人口達到2.1億，占全國總人口的15.5%，在這些老年人口中有將近4 000萬人失能、半失能。據有關部門預測，到2035年，我國的老年人口將達到4億。隨著老齡化的不斷加劇，人們越來越關心如何應對衰老以及怎樣延緩衰老。細胞的生理狀態和化學反應發生復雜變化導致衰老，最終影響到其形態、結構和功能。生物體內絕大多數細胞都會經歷未分化、分化、衰老、死亡幾個階段，衰老是一種正常生命現象。關于細胞衰老的原因，自由基學說認為：攻擊DNA引起基因突變或攻擊蛋白質引起蛋白質活性降低，從而導致組織器官功能衰退，機體進入衰老狀態。細胞死亡受細胞內某種由遺傳機制決定的“死亡程序”控制，稱為細胞程序性死亡（programmed cell death，PCD），又稱細胞凋亡。衰老就是細胞凋亡的過程，因此，抑制或減少衰老機體中細胞過度凋亡，可能有助于減緩機體衰老的發生和發展[1]。Bcl-2家族是細胞凋亡相關基因。Bcl-2是一種原癌基因，能夠抑制細胞凋亡并延長細胞生存時間。Bcl-2家族成員的基因中，常含有3個保守的Bcl-2同源區，是調節細胞凋亡及蛋白質相互作用所必需的。Bax是凋亡促進劑，Bcl-2是凋亡抑制劑，因此，檢測細胞中Bax、Bcl-2表達，可以判斷細胞凋亡的情況。研究表明，木瓜黃精膏（PRO）可以降低衰老模型小鼠血清及組織勻漿中MDA含量、提高SOD活性[2，3]。本實驗進一步觀察PRO對衰老模型小鼠腎細胞凋亡及凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2表達的影響，觀察其抗氧化功能并探討其作用機理，為解決衰老問題提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

昆明種小白鼠60只，2月齡，雌雄各半，體重（22±3）g，由鄭州大學實驗動物中心提供。

1.2 中藥及制備

所需中藥材均購自鄭州市藥材公司，由我校生藥教研室鑒定。由漯河市中醫院制劑室將木瓜、黃精、大棗、荷葉按比例制成生理鹽水混懸液后進行分裝，分別濃縮成生藥濃度5 g/m l，3 g/ml，2.5 g/m l。將配制好的藥液高壓滅菌，4℃冰箱保存。

1.3 主要試劑

D-半乳糖（上海試劑二廠）；原位缺口末端標記法（Tdtmediated d-UTP-biotin nick end labeling，TUNEL）細胞凋亡試劑盒（MK1020）、兔抗Bax和Bcl-2多克隆抗體及SP法二抗試劑盒（SA2015，SA1022），由武漢博士德生物工程有限公司提供；其余試劑均為分析純。

1.4 儀器

721-分光光度計（上海第三分析儀器廠），GL6-HPIAS高清晰度彩色病理圖文分析系統（東方德公司），小型高速離心機（美國ThermoMicroMax CL17），常溫冰箱（新鄉BCD－312KA），電子天平（梅特勒AL10401），超低溫冰箱（美國ThermoForma702），超純水儀（美國Milli-QAcademic），移液器（法國GILSON）。

1.5 實驗方法

1.5.1 分組及給藥將小白鼠置于（23±2）℃的動物室中自由進食水喂養7日后隨機分為5組，即空白對照組、衰老模型組、PRO大劑量組、PRO中劑量組、PRO小劑量組，每組12只?？瞻讓φ战M頸后皮下注射0.5m l生理鹽水，其余各組皮下注射5%D-半乳糖0.5m l，每日1次，連用4周。造模成功后，空白對照組和衰老模型組每只每天灌胃等容積生理鹽水，PRO大劑量組按30.0 g/kg·d劑量灌胃，PRO中劑量組按15.0 g/kg·d劑量灌胃，PRO小劑量組按7.5 g/kg·d劑量灌胃。連續給藥40天。

1.5.2 標本制備40天后將小白鼠處死，取各器官組織0.2 g制成10 g/100 ml的組織勻漿，4 000 r/min離心后取上清液待測。制作組織勻漿的同時將腎臟固定、脫水、石蠟包埋，檢測腎細胞凋亡及腎臟Bcl-2和Bax表達水平。

1.5.3 腎細胞凋亡檢測按試劑盒說明書進行腎組織石蠟切片，脫蠟入水，熒光素標記，之后用結合了過氧化物酶（POD）的抗熒光素抗體與熒光素結合，再與底物DAB進行顯色反應，蘇木素復染，常規脫水、透明、中性樹膠封片。胞核出現棕黃色顆粒的細胞為凋亡細胞。統計腎臟凋亡細胞數量，每組制作8張切片，在光鏡（400倍）下計數每張切片8個連續不重疊視野中的陽性細胞數，計算每100個細胞中平均陽性凋亡細胞數，即凋亡指數（Apoptosis Index，AI）。

1.5.4 免疫組化SP法檢測腎組織Bax和Bcl-2表達腎臟去除被膜取皮質，4%中性福爾馬林固定、脫水、浸蠟、包埋、切片，厚度4μm，常規脫蠟水洗，一抗為兔抗大鼠Bax或Bcl-2多克隆抗體（1∶50稀釋），標本置濕盒內4℃過夜，滴加生物素化羊抗兔二抗IgG（1∶100稀釋），滴加辣根過氧化物酶標記鏈霉素卵白素，DAB顯色，鏡下控制顯色時間，蘇木精復染細胞核，常規脫水、透明、中性樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對照，以博士德公司提供的扁桃腺切片作為陽性對照。胞質呈棕色顆粒的細胞為陽性表達細胞，光鏡觀察陽性信號。每組8張切片，每張切片在400倍視野下隨機選擇5個視野，采用GL6-HPIAS高清晰度彩色病理圖文分析系統檢測平均吸光度（A值），了解Bax和Bcl-2表達水平。

1.6 統計分析

采用Excel2007錄入和管理數據。數據資料用均值±標準差（±s）表示，用SPSS 19.0軟件統計分析，實驗結果用χ2檢驗。

2 結果

（1）PRO對衰老模型小鼠組織勻漿MDA及SOD的影響與相關研究一致[3]，衰老模型組與空白對照組比較，小鼠組織勻漿中MDA含量均顯著升高，SOD含量均減少，造模成功。

（2）PRO對衰老模型小鼠腎細胞凋亡的影響。光鏡下可見凋亡細胞胞核呈棕色或棕黑色，胞核略小或呈碎片狀，而正常細胞和壞死細胞的胞核則由蘇木素染藍紫色。本實驗中，空白對照組與PRO組小鼠細胞核大而清晰，大小一致，只偶見染棕褐色細胞；衰老模型組可見較多散在且大小不一的棕褐色胞核，分布于腎小管的多于腎小球；PRO大、中劑量組只見到少量棕褐色顆粒；PRO小劑量組棕褐色陽染顆粒數量與衰老模型組接近。PRO組凋亡指數顯著低于衰老模型組（P＜0.05或P＜0.01），尤以PRO大、中劑量組為著（見表1）。

表1 PRO對衰老模型小鼠腎細胞凋亡的影響（±s）

表1 PRO對衰老模型小鼠腎細胞凋亡的影響（±s）

注：與空白對照組比較，△P＜0.01；與衰老模型組比較,*P＜0.05，**P＜0.01

組別劑量0.5ml/只0.5ml/只7.5 g/kg·d 15.0 g/kg·d 30.0 g/kg·d凋亡指數0.33±0.14 6.25±2.13△4.82±1.52* 1.13±0.74** 0.52±0.23**空白對照組衰老模型組PRO小劑量組PRO中劑量組PRO大劑量組視野數（個）64 64 64 64 64

（3）PRO對衰老模型組小鼠腎細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax表達的影響。Bcl-2主要在腎小管表達，而Bax在腎小管和腎小球均有表達。二者都定位于胞漿，呈灶性分布，染成棕黃色。與空白對照組比較，衰老模型組Bax表達明顯增加，Bcl-2表達較弱，Bax/Bcl-2比值明顯升高（P＜0.01）；與衰老模型組比較，PRO組Bcl-2表達明顯增強而Bax表達減弱，Bax/Bcl-2比值顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），見表2。

表2 PRO對衰老模型組小鼠腎臟凋亡相關蛋白表達的影響（±s）

表2 PRO對衰老模型組小鼠腎臟凋亡相關蛋白表達的影響（±s）

注：與空白對照組比較，△P＜0.01；與衰老模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別劑量視野數（個）A值Bax/Bcl-2 Bax Bcl-2空白對照組衰老模型組PRO小劑量組PRO中劑量組PRO大劑量組0.5ml/只0.5m/只7.5g/kg·d 15.0g/kg·d 30.0g/kg·d 40 40 40 40 40 0.12±0.01 1.21±0.61△0.63±0.51* 0.31±0.72** 0.25±0.12** 0.24±0.01 0.13±0.12△0.51±0.32* 1.11±0.81** 1.42±1.25** 0.50±0.11 4.12±0.33△1.72±0.12* 0.83±0.21** 0.71±0.18**

3 討論

細胞凋亡是細胞的一種生理性調節機制，在控制細胞增殖和分化、腫瘤的發生和生長以及機體免疫調節中起著重要作用，腎小管上皮細胞過度凋亡是急性腎小管壞死中腎功能異常的重要原因之一。損傷較輕時，引起細胞凋亡；損傷較重時，使細胞壞死。如能通過藥物干預，減少細胞凋亡，就能使腎小管上皮細胞再生，從而減少該病發生[4]。Bcl-2家族分為抑凋亡基因（如：Bcl-2、Bcl-Xl等）和促凋亡基因（如Bax、Bcl-Xs等）。Bcl-2與Bax的比例是決定細胞凋亡敏感性的變阻器，Bax-Bax同源二聚體促進凋亡，Bcl-2-Bax異源二聚體抑制凋亡[5]。Bcl-2和Bax主要位于線粒體膜外側，僅用于凋亡的線粒體途徑。當凋亡發生時，Bax從胞漿移到線粒體并與線粒體膜結合，形成二聚體，導致線粒體功能紊亂，引起一系列改變：線粒體滲透性改變、氧化磷酸化和ATP合成功能破壞；細胞氧化還原作用改變及線粒體中ced-4同源體APaf-1從線粒體中釋放出來，與細胞色素C相互作用，激活Caspase，促進凋亡[6]。研究表明，Bcl-2過量表達能夠延長神經細胞生存時間。將表達Bcl-2基因的質粒顯微注入神經細胞可防止其凋亡，如用反義RNA降低Bcl-2表達，則加速無生長因子存在時的細胞死亡[7，8]。

木瓜黃精膏由木瓜、黃精、大棗、荷葉四味中藥組成，木瓜和胃健脾、美容養顏，富含17種氨基酸及鈣、鐵等，還含有木瓜蛋白酶、番木瓜堿等。木瓜在中國素有“萬壽果”之稱，顧名思義，多吃可延年益壽。荷葉活血化瘀，涼血止血，清心解暑，另外還有抗衰老、抗氧化之功效[9]。黃精味甘，性平，補脾益氣、滋腎潤肺，同時還可抗氧化及延緩衰老[10]。大棗在抗氧化、改善心血管系統及造血功能等方面有著明顯作用[11]。與空白對照組比較，衰老模型組小鼠組織勻漿中SOD活性明顯降低，MDA含量顯著升高。本研究觀察到，衰老模型組小鼠腎細胞凋亡相關蛋白Bax表達相對于正常組增高，Bcl-2表達下降、Bax/Bcl-2比例升高，表明衰老模型組細胞凋亡增加。不同劑量PRO均能上調Bcl-2蛋白表達，下調Bax蛋白表達，從而使Bax/Bcl-2比值下降，起到調控腎細胞凋亡的作用。實驗結果提示，PRO能明顯抑制衰老模型組小鼠腎細胞凋亡，且其延緩衰老作用呈一定的量效關系，高、中劑量組抑制細胞凋亡作用強于低劑量組。綜上所述，PRO能通過干預凋亡相關蛋白Bax/Bcl-2表達抑制腎細胞凋亡從而起到抗衰老作用，是一種具有良好應用前景的抗衰老藥物。今后我們還要進一步研究PRO的臨床治療效果和作用機理。

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G424.31

B

1671-1246（2017）13-0088-03

注：本文系河南省教育廳自然科學項目（2009C310008）