HPLC法測定八角蓮中3種活性成分含量的研究

徐怡++邱斌++熊永興++蘇鈦++李云

摘要：目的建立用高效液相色譜法測定八角蓮中槲皮素、鬼臼毒素、山柰素含量的方法，比較不同產地八角蓮藥材3種化合物的含量。方法色譜柱：Waters Sunfire C18柱（5 μm，46×150 mm）；流動相：甲醇-04%磷酸溶液（45：55）；流速：10 mL/min；檢測波長：290 nm；進樣量：10 μL；柱溫30℃。結果槲皮素、鬼臼毒素、山柰素的線性范圍分別為000973 μg-973 μg（r=09999）、001001 μg-1001 μg（r=09999）、000998 μg-998 μg（r=09999），平均回收率分別為9835%（RSD=26%）、10025%（RSD=23%）、10080%（RSD=27%）。結論該方法簡便可行，重復性好，可用于同時測定八角蓮藥材中槲皮素、鬼臼毒素、山柰素3種成分的含量，為八角蓮藥材的質量控制提供依據。

關鍵詞：八角蓮；槲皮素；鬼臼毒素；山柰素；高效液相色譜法

中圖分類號：R9272文獻標志碼：A文章編號：1007-2349（2017）07-0065-03

八角蓮（Dysosma versipellis Hance MCheng）隸屬于小檗科（Berberidaceae）八角蓮屬（Dysosma Woodson），為我國特有二級瀕危保護植物，主要分布在四川、云南、廣西和湖北神農架林區及周邊地區[1-2]，其根和根莖入藥，有清熱解毒、化痰散結、祛瘀消腫之功效。用于治療癰癤腫痛、毒蛇咬傷、風濕關節痛、半身不遂、氣管炎、乙型肝炎等，也可做殺蟲劑。其主要有效成分有木脂素類物質鬼臼毒素及其衍生物、黃酮類物質山柰素和槲皮素等?，F代藥理研究表明[3-6]，鬼臼毒素具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒和抗蛇毒等作用；黃酮類成分則在心血管系統、內分泌系統和抗腫瘤方面具有明顯的藥理作用。目前對八角蓮中有效成分的含量測定研究僅限于鬼臼毒素，且對不同產地八角蓮中鬼臼毒素、槲皮素、山柰素等三種有效成分的含量比較尚未見報道。本文采用高效液相色譜法同時測定八角蓮中三種成分的方法，為客觀評價八角蓮藥材質量提供了科學依據。

1儀器與試藥

11儀器美國Agilent 1100高效液相色譜儀（四元泵、DAD檢測器、自動進樣器、在線真空脫氣機、智能化柱溫箱及化學工作站）；恒溫水浴鍋；梅特勒-托利多AG285電子天平。

12試藥十二批八角蓮藥材由云南省藥物研究所收集，經中國科學院昆明植物研究所李恒研究員鑒定為小檗科植物八角蓮Dysosma versipellis（Hance）MCheng，見表1。

對照品槲皮素（批號：100081-200406，純度973%）、鬼臼毒素（批號：111645-200301）、山柰素（批號：110861-200304）均由中國藥品生物制品檢定所提供；所用流動相甲醇、磷酸為色譜純，處理樣品的甲醇為分析純，水為超純水。

2方法與結果

21色譜條件色譜柱：Wasters Sunfire C18柱（5 μm，46×150 mm）；流動相：甲醇-04%磷酸溶液（45：55）；流速：10 mL/min；檢測波長：290 nm；進樣量：10 μL；柱溫30℃，理論塔板按槲皮素計算不低于4000，在該色譜條件下，供試品、對照品分離較好，與其他雜質峰均能達到基線分離（見圖1）。

22溶液的制備

221對照品溶液的制備精密稱取對照品適量，加甲醇制成每1 mL中含槲皮素01 mg，鬼臼毒素01 mg，山柰素01 mg的溶液，作為對照品溶液。

222供試品溶液的制備取樣品05 g（過4號篩），精密稱定，置150 mL圓底燒瓶中，精密量取甲醇25 mL，稱重，80℃水浴回流30 min，放至室溫后，用甲醇補重，搖勻，用045 μm微孔濾膜濾過，取續濾液即得。

23線性關系考察精密稱取槲皮素1000 mg，鬼臼毒素1001 mg，山柰素998 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得濃度分別為0973 mg/mL、1001 mg/mL、0998 mg/mL的混合標準品儲備液。精密吸取此儲備液逐級稀釋，分別注入液相色譜儀中，以對照品含量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線。得回歸方程為：Y槲皮素=14109X+18353，r=09999；Y鬼臼毒素=4837X +9504，r=09999；Y山奈素=15916X+16558，r =09999。結果表明，在上述色譜條件下，槲皮素在000973μg～973μg，鬼臼毒素在001001μg～1001μg，山柰素在000998μg～998μg范圍內呈良好的線性關系。

24準確度試驗（加樣回收試驗）精密稱取9份樣品（已測槲皮素、鬼臼毒素、山柰素含量分別為00645%、0125%、0241%，每份約025 g），分別添加適量對照品（含量的50%、100%、150%），然后按供試品溶液處理方法同法處理，將處理好的供試品溶液按含量測定方法同法測定，計算：槲皮素平均回收率=9835%，RSD=26%（n=9）、鬼臼毒素平均回收率=10025%，RSD=23%（n=9）、山柰素平均回收率=10080%，RSD=27%（n=9）。

25精密度試驗

251儀器精密度取混合對照品溶液（槲皮素00973 mg/mL、鬼臼毒素01001 mg/mL、山柰素00998 mg/mL），按照“21”項色譜條件，連續進樣6次，進樣10μL，記錄峰面積，RSD%分別為11%、12%、082%（n=6），結果表明儀器精密度較好。

252重復性試驗取同一樣品按“222”項平行制備供試品6份，按照“21”項色譜條件進樣，測定結果，槲皮素、鬼臼毒素、山柰素含量的RSD分別為：29%、24%、22%，表明本法具有良好的重復性（RSD3%）。

26穩定性試驗取同一份樣品溶液，按“21”項色譜條件，分別于0、3、6、16、20h進樣，測定峰面積，槲皮素、鬼臼毒素、山柰素峰面積的RSD%（n=5）分別為：091%、079%、059%，結果表明供試品溶液在20 h內穩定。

27樣品測定取12批樣品按上述供試品制備方法制備，分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按上述“21”項色譜條件測定，記錄峰面積，以外標法計算樣品中槲皮素、鬼臼毒素、山柰素的含量，結果見表2。

3討論

本試驗參考了有關文獻[7-9]，對提取方法、提取溶劑、提取時間分別作單因素考察，最終確定了供試品溶液的制備方法為甲醇回流提取法。通過對三種成分的甲醇溶液進行全波長掃描，結果槲皮素、山柰素在254 nm、360 nm處有最大吸收，但鬼臼毒素的最大吸收波長為290 nm，考慮到槲皮素和山柰素的響應值偏高，且鬼臼毒素在其他兩個波長下吸收值均不理想，故選擇290 nm為檢測波長，實驗表明該波長檢測靈敏度高，雜質吸收峰少，干擾小，效果理想。

本研究建立了八角蓮中三個主要化學成分的高效液相色譜定量分析方法。該方法專屬性強，精密度、穩定性和重現性好，可為八角蓮質量標準的研究及種質資源評價建立基礎。

從12批不同產地的樣品測定結果可以看出，各地八角蓮三個成分含量存在較大差異。其中，湖北、江西、安徽等地的八角蓮樣品鬼臼毒素含量明顯高于云南、四川等地。影響藥材品質的因素很多，主要有產地、采收期、加工方法等。本文收集的樣品有限，一定程度上影響了研究的深度，后續將擴大樣本量，并對其他影響因素與含量間的相關性開展更深入研究。

參考文獻：

[1]中國科學院編輯委員會中國植物志[M].北京：科學出版社，2001：254

[2]陳毓亨我國鬼臼類植物資源的研究[J].藥學學報，1979，14（2）：101-107

[3]張艷君，馮川八角蓮活性成分鑒別及其抗癌活性研究[J].吉林醫藥學院學報，2013，34（4）：241

[4]姜飛，田海妍，張建龍，等八角蓮的化學成分研究[J].中草藥，2011，42（4）：634

[5]譚小明，余麗瑩，周雅琴瀕危藥用植物八角蓮內生真菌分離鑒定及抗菌活性研[J].中國藥學雜志，2014，49（5）：363

[6]張培楠，李朝峰，趙長琦鬼臼毒素及其衍生物[J].天然產物研究與開發，2004，16（1）：80

[7]雷震，楊光義，葉方，等UPLC法測定八角蓮藥材中鬼臼毒素的含量[J].中國藥師，2013，16（4）：548

[8]白吉慶，王小平，孫濤，等高效液相色譜法測定窩兒七中槲皮素、鬼臼毒素、山柰素[J].中國藥學雜志，2012，47（1）：69

[9]馬志剛，鄭永雯，馮益青，等八角蓮不同部位鬼臼毒素和4-去甲鬼臼毒素含量的測定[J].云南民族大學學報：自然科學版，2014，23（5）：317