魚肽的制備及其對鹽脅迫下3種蔬菜種子萌發的影響

劉金龍+辛寒曉+范學明+劉麗英+孫中濤

摘要：采用復合酶法水解低值魚下腳料制備魚肽，并探討魚肽對鹽脅迫下辣椒、番茄和茄子種子萌發的影響。結果表明，中性蛋白酶和風味蛋白酶對低值魚下腳料具有較強的水解能力，二者以1∶3的比例對低值魚下腳料水解時，最佳水解條件為加酶量3.7%（E/S）、pH值6.8、酶解溫度52℃。在此條件下，酶解360 min，水解度可達41.41%，此時魚肽的得率為78.73%，純度為76.82%。在鹽脅迫下，以0.1%～0.7% 的魚肽溶液對辣椒、番茄和茄子進行浸種處理，其發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數均有不同程度提高，且均以0.5%的魚肽溶液處理效果最佳。說明適宜濃度的魚肽用于蔬菜浸種，能夠有效減輕鹽脅迫對種子的傷害。

關鍵詞：魚肽；鹽脅迫；蔬菜種子；發芽特性

中圖分類號：S641.01 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2017）07-0059-07

Abstract The fish peptide was produced through hydrolyzing low-value fish wastes using multi-enzyme method. And the effects of fish peptide on seed germination of pepper， tomato and brinjaul under salt stress were explored. The results showed that neutral protease and flavourzyme had stronger hydrolyzing ability on fish wastes. When neutral protease and flavourzyme were adopted together at the ratio of 1∶3， the optimal technology conditions were multi-enzyme of 3.7% （E/S）， pH value of 6.8 and temperature of 52℃. Under these conditions， after hydrolyzing for 360 minutes， the hydrolyzing degree reached 41.41%， the fish peptide yield was 78.73% with the purity of 76.82%. When three kinds of vegetable seeds were soaked with 0.1%～0.7% fish peptide， the germination rate， germination energy， germination index and vigor index showed rising trends in varying degrees under salt stress. Among which， the remission effects of 0.5% fish peptide were the best. These results indicated that pretreating vegetable seeds with the suitable concentration of fish peptide could effectively ease the damage caused by salt stress.

Keywords Fish peptide； Salt stress； Vegetable seed； Germination trait

近年來，隨著水產加工業的迅猛發展，帶魚、小黃魚等低值魚下腳料的產量日益增加。低值魚下腳料蛋白質含量較高，價格低廉，是一類優質的蛋白資源。目前，低值魚下腳料除部分用于生產生物飼料與復合調味料外[1，2]，大部分未能進行綜合利用，被當作廢棄物處理[3]。采用蛋白酶對低值魚下腳料進行水解，生產魚肽，可以提高低值魚下腳料的綜合利用水平[4，5]。大量研究證實，多肽作為五大植物激素以外的又一類新型植物生長調節物質，在促進植物生長[6]、提高作物產量和改善果實品質[7]、增強作物抗逆性[8]等方面發揮著重要作用。因此，酶法水解低值魚下腳料制備魚肽，并將其應用于農業生產具有重要意義。

據統計，我國鹽堿地面積近3 600萬公頃，約占總耕地面積的10%[9]。除此之外， 由于近年來大量施用化學肥料，土壤理化性狀及生物學特性都發生了很大變化，致使土壤次生鹽漬化問題突出，在蔬菜育苗時常出現萌發時間延遲、缺苗斷壟、生長不整齊等現象[10]。鹽脅迫已成為我國農業健康發展的限制性因素之一，如何減輕鹽害對植物生長的抑制已成為國內外研究的熱點。研究發現，種子在萌發階段對鹽脅迫十分敏感[11]，施用大豆肽等肽類物質可有效減輕鹽分對作物生長的脅迫效應[12]，但有關魚肽對鹽脅迫下蔬菜種子萌發的研究鮮見報道。

外源多肽的生物活性與其分子量大小有關，優化酶解工藝，提高蛋白質的水解度，降低肽的分子量，不僅可以提高肽的得率，還可提高其應用效果[13-16]。因此，本研究優化復合酶法水解帶魚、小黃魚等低值魚下腳料制備魚肽的生產工藝，并探討其對鹽脅迫下辣椒、番茄和茄子種子萌發的影響，以期為鹽漬地推廣應用魚肽提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低值魚下腳料系小黃魚深加工副產品，蛋白質含量14.82%，購自泰安農貿市場；辣椒（特大羊角椒）、番茄（中蔬四號）、茄子（早熟京茄一號）種子購自泰安市泰山區農大種業；酸性蛋白酶（1.6×105 U/g）和風味蛋白酶（Flavourzyme 500 MG）制劑購于諾維信（中國）投資有限公司；菠蘿蛋白酶（0.8×105 U/g）、木瓜蛋白酶（2×105 U/g）和中性蛋白酶（2×105 U/g）制劑購于南寧龐博生物工程有限公司；胰蛋白酶（2×105 U/g）購于南京奧多福尼生物科技有限公司；D-果糖購于Solarbio公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 蛋白酶種類的篩選

參考陳季旺等[17]的方法并改進：精確稱取10 g低值魚下腳料（脫脂），置于250 mL 具塞三角瓶中，加入50 mL蒸餾水，混勻，分別添加3%（E/S，以底物重量計）的酸性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶、風味蛋白酶，并調至各酶的最適pH值，在50℃恒溫振蕩器中酶解240 min，然后95℃水浴滅酶10 min，冷卻至室溫，抽濾，計算酶解液水解度（degree of hydrolysis，DH），篩選出適宜的蛋白酶。

1.3 復合酶配比篩選

將10 g低值魚下腳料與50 mL蒸餾水置于250 mL具塞三角瓶中，添加3%（E/S，以底物重量計）的復合酶，混勻。復合酶由兩種水解效果最佳的蛋白酶以不同的比例復配而成，其配比分別為1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1。在50℃恒溫振蕩器中酶解240 min，水解完成后，于95℃滅酶10 min，冷卻至室溫，抽濾，計算DH，以確定最佳配比。

1.4 加酶量、溫度、pH值、時間等酶解條件的單因素試驗

分別控制不同的加酶量（1%～5%）、溫度（40～60℃）、pH值（5.0～8.5）和酶解時間（60～600 min），按1.3步驟進行單因素試驗，測定上清液的DH。

1.5 Box-Behnken試驗

在單因素試驗基礎上，僅考慮對水解度影響顯著的因素，設計Box-Behnken試驗，試驗因素與水平見表1。

1.6 種子萌發試驗

根據前期3種蔬菜種子耐鹽性預試驗的結果，本研究在中度（100 mmol/L NaCl）鹽脅迫下進行種子萌發試驗。將辣椒、番茄和茄子等種子用5%的次氯酸鈉處理10 min，用蒸餾水沖洗干凈，自然晾干，分別用不同濃度的魚肽溶液和去離子水浸種處理。試驗共設6個處理，如表2所示。浸種24 h后，以蒸餾水清洗種子，并將其置于鋪有2層濾紙的培養皿（直徑為12 cm）內，分別加入100 mmol/L NaCl溶液10 mL，對照組加入等量去離子水。番茄和茄子種子置于（25±1）℃避光培養，辣椒種子置于（28±1）℃避光培養。每處理重復4次，每皿60粒種子。萌發期間定時定量補充NaCl溶液或去離子水保持濾紙濕潤。番茄萌發到第4 d時測定種子發芽勢，第7 d時統計種子的發芽率、發芽指數和活力指數；辣椒和茄子萌發到第7 d時分別測定種子發芽勢，第14 d時統計種子的發芽率、發芽指數和活力指數。

1.7 測定項目與方法

1.7.1 魚肽常規指標的測定 參照王國強等[18]的方法，采用凱氏定氮法測定可溶性氮含量；采用雙縮脲法測定肽含量；采用索氏提取法測定脂肪含量；采用105℃恒重法測定水分含量；采用550℃灼燒法測定灰分含量。參照張雪等[19]的方法，采用重量法計算酶解后魚肽得率。

1.7.2 水解度的測定 參照馬艷芳等[20]的方法測定，水解度（%）=水解后生成的α-氨基態氮含量/樣品總氮含量×100；茚三酮法測定α-氨基態氮含量；凱氏定氮法測定樣品總氮含量。

1.7.3 種子萌發指標的測定 參照趙艷艷等[21]的方法測定，發芽勢（GE，%）=規定天數內發芽種子數/T×100；發芽率（GR，%）=試驗結束后的發芽種子數/T×100；發芽指數（GI）=∑（Gt/Dt）；活力指數（VI）=GI×S。式中Gt表示在t時間內發芽數；Dt表示相應的發芽天數，T表示供試種子總數，S為幼苗平均鮮重。

1.8 數據處理

試驗數據采用Design-Expert 8.0.6和SPSS 19.0等軟件進行分析處理，采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶種類對魚蛋白水解度的影響

由圖1可知，中性蛋白酶水解度最大，達到28.87%；風味蛋白酶水解度次之，達到26.85%。6種蛋白酶對魚蛋白的水解能力從強到弱依次為：中性蛋白酶>風味蛋白酶>木瓜蛋白酶>胰蛋白酶>菠蘿蛋白酶>酸性蛋白酶。從水解效果考慮，選取中性蛋白酶與風味蛋白酶組成復合酶較為適宜。

2.2 復合酶配比及其添加量對魚蛋白水解度的影響

由圖2a可知，魚蛋白水解度隨著中性蛋白酶與風味蛋白酶配比的不同而不同，當中性蛋白酶∶風味蛋白酶=1∶3時，水解度最大，達到34.16%，比中性蛋白酶和風味蛋白酶的單酶水解度分別提高了18.32%、27.23%，為最佳復合酶配比。

復合酶（中性蛋白酶與風味蛋白酶）添加量在1%～3%范圍內，魚蛋白水解度隨加酶量的增加而增大，3%時達到最大，為35.18%（圖2b）；之后水解度基本不變，這可能是因為酶與底物的結合基本處于飽和狀態。因此復合酶的最適添加量為3%。

2.3 溫度與pH值對魚蛋白水解度的影響

如圖3a所示，40～50℃時，魚蛋白水解度隨著溫度的升高而增大；50～60℃時，蛋白酶活性因酶解溫度升高受到抑制，水解度降低。50℃時水解度最大，達到36.01%，為復合酶的最適酶解溫度。

如圖3b所示，魚蛋白的水解度隨pH值的增加呈先升高后降低趨勢，pH值6.5時水解度最大，達到38.13%，為最適pH值。

2.4 酶解時間對魚蛋白水解度的影響

如圖4所示，酶解60～360 min內，隨著酶解時間的延長，魚蛋白的水解度呈上升趨勢，360 min時最大，達到40.39%；繼續延長酶解時間，水解度基本不變。為節約成本和時間，宜選取360 min為最佳酶解時間。

2.5 Box-Behnken試驗結果與分析

在單因素試驗的基礎上利用Design-Expert 8.0.6 軟件對試驗數據進行響應面分析（見表3）。根據水解度（Y）對加酶量（X1）、溫度（X2）和pH值（X3）3個因素的影響建立回歸方程Y=41.05+0.60X1+2.23X2+0.89X3+0.16X1X2+0.48X1X3-0.045X2X3-0.71X12-2.54X22-0.97X32。

由表4可以看出，此模型的P<0.0001，達到極顯著水平，失擬項的P=0.3287>0.05，擬合度較好。模型相關系數R2=0.9820，表明響應值的變化有98.20%來源于所選變量，說明該模型很好地反映了加酶量、溫度、pH值等因素對水解度的影響，能夠準確描述與預測魚蛋白的酶解過程。從模型系數的顯著性檢驗結果可以看出，模型的自變量一次項X1、X2、X3和二次項X22、X32對水解度的影響均達極顯著水平（P<0.01）；二次項X12影響顯著（P<0.05），其余各項對水解度的影響不顯著（P>0.05）。利用Design-Expert 8.0.6軟件繪制加酶量、溫度與pH值3個因素對魚蛋白水解度的響應面圖（圖5）。模型預測的3個因素的值分別為：加酶量3.69%、溫度52.27℃、pH值6.81，在此條件下，預測的水解度最大值為42.05%。在驗證試驗中，考慮到實際操作方便，將酶解工藝參數調整為：加酶量3.7%，溫度52℃，pH值6.8，以此工藝條件平行試驗3次，水解度的實際值為41.41%±0.42%。此時魚肽的得率為78.73%。

2.6 魚肽成分的測定

魚肽成分的測定結果表明，其可溶性氮含量85.34%，肽含量76.82%，水分含量4.17%，脂肪含量0.31%，灰分含量6.31%。可見采用該酶解法水解低值魚下腳料中的魚蛋白，肽含量較高，能夠有效提高原料中多肽的轉化率，該方法可行。

2.7 魚肽對鹽脅迫下蔬菜種子萌發的影響

由表5可知，與CK相比，在鹽脅迫下（T1～T5），辣椒、番茄和茄子種子的發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數均顯著降低，表明鹽脅迫明顯抑制了3種蔬菜種子的萌發。與T1相比，采用0.1%～0.7%魚肽溶液對3種蔬菜種子進行浸種處理，其發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數均有不同程度提高，且均以0.5%魚肽溶液處理的效果最佳，均顯著高于T1，增幅分別為23.05%、52.17%、42.89%、72.31%（辣椒），41.65%、59.23%、70.60%、77.78%（番茄），54.06%、54.99%、75.17%、81.82%（茄子）。

3 討論與結論

本研究選用中性蛋白酶與風味蛋白酶協同方式水解低值魚下腳料，通過單因素試驗和響應面法確定魚肽的最佳工藝參數為：中性蛋白酶與風味蛋白酶配比為1∶3、加酶量3.7%（E/S）、酶解溫度52℃、pH值6.8，在此條件下酶解360 min，水解度可達41.41%，此時魚肽的得率為78.73%，純度為76.82%。

種子萌發是植物發育的起點，也是衡量作物耐鹽性強弱的關鍵時期。鹽脅迫直接影響種子的萌發，是制約蔬菜產業發展的關鍵因素之一。發芽率、發芽勢、發芽指數及活力指數能潛在地反映種子萌發速率、發芽整齊度和出苗健壯等特點，是衡量種子萌發、植物生長的重要依據[22]。本研究結果表明，在100 mmol/L NaCl脅迫下，辣椒、番茄和茄子種子的發芽率、發芽勢、發芽指數及活力指數顯著低于對照，即種子的萌發明顯受到抑制，這與趙艷艷[21]、吳雪霞[22]和閆芳[23]等的研究結果一致，表明種子在萌發階段對鹽脅迫敏感。有研究表明，多肽是一類新型植物生長調節物質，在增強植物抗逆脅迫方面發揮著重要作用[8，12，24]。本研究采用0.1%～0.7%的魚肽溶液對3種蔬菜種子浸種處理，其發芽率、發芽勢、發芽指數及活力指數均有不同程度提高，其中用0.5%魚肽溶液處理的效果最佳，3種蔬菜種子的發芽率、發芽勢、發芽指數及活力指數顯著提高，表明適宜濃度的魚肽能夠有效減輕鹽脅迫對辣椒、番茄和茄子種子萌發造成的傷害。這與宋麗華[25]和馬光恕[26]等的研究結果相似，說明魚肽在種子萌發、抗逆等方面發揮著重要作用。本試驗初步研究了魚肽對鹽脅迫下蔬菜種子萌發的影響，而對于蔬菜幼苗抗鹽性的作用機制，后續試驗將進一步深入研究。

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