野生郁金香種子無菌萌發及小鱗莖形成

李 岳,吳 昀,ELMONGY Mohamed,2,呂學思,任梓銘,孫敏譯,夏宜平*

（1.浙江大學農業與生物技術學院園藝系，杭州310058；2.曼蘇爾大學農學院園藝系，埃及曼蘇爾35516）

野生郁金香種子無菌萌發及小鱗莖形成

李 岳11,吳 昀1,ELMONGY Mohamed1,2,呂學思1,任梓銘1,孫敏譯1,夏宜平1*

（1.浙江大學農業與生物技術學院園藝系，杭州310058；2.曼蘇爾大學農學院園藝系，埃及曼蘇爾35516）

以野生新疆郁金香（Tulipa sinkiangensi）種子為材料，比較了不同消毒方式、是否剝皮、赤霉素預處理質量濃度、基本培養基、培養溫度對種子無菌萌發及鱗莖形成的影響。無菌播種試驗結果表明：75%乙醇處理30 s結合2%次氯酸鈉消毒10 min是種子的最佳消毒方式，污染率為0%；未剝去種皮的種子在4℃下發芽率較高，而剝去種皮后在25℃下發芽率較高。4℃有利于打破種子休眠，而25℃更適宜種子萌發和生長，結合采用600 mg/L赤霉素預處理24 h，1/2MS為基本培養基，是新疆郁金香種子無菌萌發的最佳條件，在此條件下發芽率達96.7%，且芽生長勢強。試驗還發現：剝皮處理不會顯著提高萌發率，但可顯著縮短種子萌發時間，使芽生長更健壯，且約有80%以上能形成離體小鱗莖，成球率顯著高于土壤播種試驗；不剝皮會導致萌發的芽細長柔弱，逐漸死亡或生長畸形，且不能形成離體小鱗莖。本試驗建立的新疆郁金香無菌播種和鱗莖形成體系，為野生郁金香的離體資源保存和實現我國野生郁金香資源的保護及利用提供了理論依據。

野生郁金香；無菌播種；資源保存；萌發率；鱗莖形成

Summary Wild tulips in Xinjiang Uygur Autonomous Region are unique and elite germplasm resources,which are widely distributed in China.Itis ofgreatnecessity to protect,develop,and fully utilize those valuable materials for species diversity and breeding regimes mainly due to the destruction of primitive habitat.These wild species are often characterized numerous outstanding horticultural traits(e.g.,resistance and ornamental values)with great potential in breeding.Due to changeable climatic conditions,as well as the influence of diseases,it still has many problems in overcoming the degeneration of bulbs throughout the hot summer in some regions like Zhejiang Province.Tissue culture is an effective alternative method to preserve germplasm resources compared with the conventional ways.However,the survival rate of plantlets after transplanting is much higher than the bulblets formed in vitro.Therefore,tulip bulblets in vitro obtained through the sterile sowing technology are easier to achieve the successfulconservation and propagation ofwild tulip under non-primitive habitat.Itis ofgreatimportance forthe preservation and utilization ofwild tulips with excellenttraits in China.

The study aims to screen out the optimal conditions for the seed germination of Tulipa sinkiangensi native to Xinjiang, including sterilization method(ethanol,2%NaClO or 0.1%HgCl2),peeling or not,gibberellin(GA3)pretreatmentconcentration (0,300,600 mg/L),basalmedium(MS,1/2MS)and culture temperature(4℃,25℃).

The results showed that 75%ethanoltreatment for 30 seconds and 2%sodium hypochlorite for 10 minutes were the best sterilization method for tulip seeds,with the contamination rate of0%.The germination rate was higher at4℃withoutpeeling off the seed coat,while itwas higher at25℃with peeling offseed coat.Four degrees celsius was necessary for breaking dormancy, whereas 25℃was more suitable for seed germination and growth.The optimalconditions for seed germination ofwild tulips were pretreatment with 600 mg/L GA3for 24 hours before sowing,and 1/2MS basal medium at 25℃.Under these conditions,the germination rate ofwild tulips reached 96.67%with strong growth potential.We also found thatpeeling offthe seed coatcould not significantly increase the germination rate,butcould significantly shorten the seed germination time,resulting in more robustshoot growth.Eventually,aboutmore than 80%sprouted seeds formed smallbulblets in vitro,while the seeds withoutpeeling offthe seed coatfailed.Meanwhile,the formation rate ofthe bulblets in the aseptic sowing was significantly higherthan thatin the soilsowing.

This study provides an experimental basis for in vitro conservation of wild tulips and helps to enhance the protection and utilization ofwild tulip resources in China.

郁金香為百合科（Liliaceae）郁金香屬（Tulipa）多年生球根花卉，在世界球根產業中位列第一[1]。郁金香是我國重要的野生種質資源，起源于西藏、天山西部和帕米爾-阿賴以及喜馬拉雅山脈地區，至今，40%的野生郁金香仍生長在該區域。新疆的野生郁金香具很強的抗逆（寒冷、干旱、炎熱）性，且花多色艷，花形獨特，是獲得抗性高、觀賞性強的雜交新品種的優良種質資源[2]。新疆郁金香（Tulipa sinkiangensi）屬于無毛組中的多花品種。目前，國內外對我國野生郁金香的研究還較少，但國內不少學者已開始意識到保護和利用我國野生郁金香資源的重要性，加快相關研究可為國內郁金香育種奠定理論基礎。研究表明，組織培養技術可有效穩定地保存種質資源，通過無菌播種獲得組培苗是其中一條途徑。

本實驗室（浙江大學觀賞植物組培實驗室）近年來建立了藥百合（Lilium speciosum var.gloriosoides）[3]和巨球百合（L.brownii var.giganteum）[4]的無菌播種體系，并得出細胞分裂素與生長素比值較高有利于百合屬種子無菌萌發的結論，這與在蘭屬植物中的發現相同[5]。有研究表明，外源生長調節劑加入與否對野生郁金香萌發無顯著影響[6]。因此，本試驗確定了培養基配方為1.0 mg/L 6-芐氨基腺嘌呤（6?BA）+0.1 mg/L萘乙酸（NAA）+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂，pH值為5.7。陳芳等[7]和TANG等[8]報道，低溫是伊犁郁金香(T.iliensis)種子萌發的首要條件。赤霉素（gibberellin,GA3）處理可顯著提高雜種郁金香種子的發芽率和發芽勢；聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）處理也有一定作用，但效果不如GA3[9]。吳昀等[3]研究表明，種皮是制約百合種子萌發的關鍵因素，進行剝皮處理或采取其他物理措施破壞種皮可有效提高其萌發率。到目前為止，還未見種皮對野生郁金香種子離體萌發影響的相關報道，也未見野生郁金香種子消毒方式和基本培養基的比較研究。此外，相關研究表明，當球根植物鱗莖離體成球時，移栽成活率更高[10]。

本研究從消毒方式、剝皮與否、GA3預處理濃度、基本培養基、培養溫度等方面系統研究了相關因子對野生郁金香種子無菌萌發及離體鱗莖形成的影響。此外，為驗證無菌播種的優勢，還進行了土壤播種試驗比較。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為2015年9月于新疆采集的野生郁金香種子（T.sinkiangensi）。接種前在4℃冰箱中保存8周以打破休眠，選擇飽滿、胚清晰（胚長≥1/2種長）的種子為試驗材料（圖1）。種子千粒質量為5.65 g。

圖1 新疆野生郁金香種子Fig.1 Seeds ofwild T.sinkiangensi from Xinjiang

1.2 方法

試驗于2015年12月至2016年6月在浙江大學觀賞植物組培實驗室進行。無菌培養室光強為60μmol/ (m2·s)，溫度為(25±2)℃。

無菌播種：試驗參考吳昀等[3]藥百合種子無菌播種的方法并做少量改動。將種子置于加有吐溫-20及洗潔精各1～2滴的水溶液中浸泡30 min，流水沖洗2 h，再用不同質量濃度的GA3浸泡24 h；接種前，在超凈工作臺上用75%乙醇振蕩消毒30 s，繼而采用質量體積分數為0.1%的氯化汞（HgCl2）處理5 min或有效氯質量體積分數為2%的次氯酸鈉（NaClO）處理10 min，無菌水沖洗3～5次；再分別置于25℃和4℃下培養，對應的消毒處理方式（S1～S4）見表1。用手術刀輕輕刮掉種皮，接種于培養基上，在室溫或4℃冷柜中黑暗培養；共12種培養條件（C1～C12），具體見表2。60 d后將發芽的郁金香種子接種到蔗糖質量濃度為60 g/L的MS基本培養基中進行增殖成球培養。

土壤播種：播種前用溫水催芽［V（開水）∶V（冷水）= 3∶1］，用多菌靈浸泡15 min，然后播種于穴盤中，基質為m［加拿大進口泥炭土（Fafard）］∶m（珍珠巖）∶m（黃沙）=4∶1∶1，常規管理。

表1 消毒方式和培養溫度Table1 Sterilization methods and culture temperature

表2 培養條件Table2 Culture conditions

1.3 觀察與統計

每組處理接種10粒種子，4個重復。萌發前每天觀察，以胚根或幼芽突破種皮為準，記錄開始萌發日；萌發后每3 d觀察1次。60 d后統計污染率、萌發高峰期、萌發率、生長勢等。轉接60 d后記錄增殖成球情況，并拍照記錄。其中：發芽高峰期為發芽種子數超過發芽種子總數1/2的階段；污染率=污染種子數/種子總數×100%；萌發率=發芽種子數/種子總數×100%。

1.4 數據處理

試驗數據用平均值±標準誤表示，采用Excel2007和SPSS 20.0對數據進行方差分析和因素內多重比較，并制圖。

2 結果與分析

2.1 消毒方式和溫度對種子萌發的影響

以未經GA3浸泡的種子為材料，MS為基本培養基，進行不同消毒方式和在25℃及4℃下的培養，具體處理方式見表1，發芽情況見圖2。試驗結果表明：2種消毒方式的殺菌效果都較好，污染率均為0%；在相同溫度下，經2%NaClO消毒處理后種子萌發率比0.1%HgCl2處理的種子更高，且當培養溫度為4℃時，這種差異達到統計學上的顯著水平（表3）。試驗也嘗試了僅使用75%乙醇消毒，并延長消毒時間，發現無論剝皮與否，乙醇消毒超過15 min會造成種子難以發芽，試驗觀察到只有零星幾粒發芽，芽短而且弱（數據未顯示），這可能與乙醇的強滲透性相關。

在相同消毒方式、不同接種溫度條件下，開始萌發時間不同，萌發率差異顯著，以4℃更佳，發芽率平均為81.25%；在25℃條件下則發芽困難，平均僅為6.28%（表3）。初步推測低溫更利于郁金香種子發芽。

總體而言，S4處理效果最佳，18 d時開始萌發，污染率為0%，萌發率達97.5%（表3）。在此試驗條件下雖消毒效果良好，萌發率亦較高，但后期發芽緩慢，且芽較細長，難以形成小鱗莖。推測主要原因是種皮的抑制作用，因此，為排除該影響，后續進行了去除種皮試驗。

圖2 消毒方式和溫度對種子發芽的影響Fig.2 Effects ofsterilization method and temperature on seed germination

表3 不同消毒方式和溫度下的種子萌發Table3 Seed germination atdifferentsterilization methods and temperatures

2.2 剝皮處理對種子萌發的影響

在12種培養條件下，選擇在4℃下進行剝皮與不剝皮對比試驗，即編號C2、C4、C6、C8、C10、C12處理（表2）。

由表4可見：在6種培養條件下，未剝皮種子的萌發時間均滯后于剝皮處理的種子，且差異有統計學意義；在萌發率上，剝皮處理與不剝皮處理僅在2種培養條件下（C4和C8）差異顯著，均為剝皮處理的萌發率較高，雖然在部分培養條件下不剝皮處理的萌發率也較高，但未達到統計學上的顯著水平，且在試驗中發現，在不剝皮條件下萌發率不穩定。從圖3可見，雖然不剝皮處理的發芽率也較高，但芽多細長柔弱，難以培養形成小鱗莖。因此，剝去野生郁金香的種皮更利于種子萌發，且可顯著縮短種子萌發時間。

表4 4℃時剝皮與不剝皮處理的種子萌發Table4 Seed germination underpeeled and unpeeled treatments at4℃

圖3 剝皮處理對種子發芽的影響Fig.3 Effects ofpeeling on seed germination

2.3 培養條件對種子萌發的影響

本試驗對GA3質量濃度（0、300、600 mg/L）、基本培養基（MS、1/2MS）、培養溫度（4℃、25℃）進行均勻試驗設計，共得出12種組合，即12種培養條件（表2）。經過記錄和統計，在C11號培養條件下萌發高峰期較集中，發芽率和芽長最高，顯著高于其余11個處理，芽寬均值最高；除C2、C4號培養條件外，開始萌發時間在各培養條件間差異不大（表5）。綜上表明，處理C11為野生郁金香種子的最佳萌發條件，即GA3預處理質量濃度為600 mg/L，1/2MS為基本培養基，25℃培養，在此條件下發芽率接近100%，并且出芽強壯（圖4）。

表5 不同培養條件下的種子萌發Table5 Seed germination underdifferentculture conditions

圖4 培養條件對種子發芽的影響Fig.4 Effects ofculture conditions on seed germination

2.3.1 溫度對野生郁金香種子萌發率的影響

由圖5A可以看出：除C1、C2號培養條件外，其余均是在25℃下的萌發率較高；C1號萌發率雖然低于C2號，但差異無統計學意義，并且C1號的芽長和芽寬均高于C2號（表5）。說明25℃的培養條件更有利于郁金香種子的發芽。這與2.1節基于NaClO的消毒方式、MS為基本培養基、未剝皮的試驗中初步顯示的4℃更有利于郁金香種子萌發的結果相悖。根據現有的試驗結果推測是溫度和剝皮處理之間有制約關系，在未剝去種皮時，4℃下發芽率高，而在剝去種皮后，25℃下發芽率高，其原因包括：種子本身可能存在的抑制機制；或是低溫條件下種皮對發芽的阻礙作用較小；也可能是種皮內的某些物質在發揮作用；在25℃條件下，種皮抑制種子發芽的作用較大，或是由于接種前已經過冷藏處理打破休眠，所以在培養時較高溫度適宜發芽。

2.3.2 基本培養基對野生郁金香種子萌發率的影響

由圖5B可以看出，在6種GA3質量濃度和溫度的組合中，使用1/2MS作為基本培養基的萌發率均高于使用MS作為基本培養基的萌發率。說明1/2MS是更適宜郁金香種子萌發的基本培養基。這是有關野生郁金香種子無菌萌發基本培養基的首次報道。

2.3.3 GA3預處理質量濃度對野生郁金香種子萌發率的影響

GA3有助于打破休眠，可提高種子發芽率和發芽勢。由圖5C可以看出，除了培養條件C2、C6、C10，隨著GA3預處理質量濃度的升高，野生郁金香種子萌發率基本呈逐漸升高的趨勢。說明使用較高質量濃度的GA3浸泡郁金香種子有助于種子發芽。而MS培養基及4℃是制約性培養條件，萌發率均較低，因此在C2、C6、C10培養條件下，萌發率均較低，且隨著GA3質量濃度的增加而遞減，但未形成顯著差異。因此，在本試驗中，600 mg/L GA3浸泡處理可促進野生郁金香種子萌發。這也說明低溫處理和GA3處理種子有疊加作用，兩者結合可更有效地打破休眠，促進種子萌發。

2.4 離體小鱗莖形成

將萌發的郁金香種子轉移到僅含60 g/L蔗糖及8 g/L瓊脂的MS基本培養基中，在60 d和90 d時觀察郁金香芽的生長情況。

由圖6可以看出，培養60 d后，郁金香小芽的形態差異較大，相對于本實驗室建立的百合體系而言，郁金香生長較緩慢。不剝皮處理形成的芽細長柔弱，生長畸形，而剝皮處理形成的芽較健壯，可以看出小鱗莖的初級形態。

圖5 不同培養條件對種子發芽的影響Fig.5 Effects ofdifferentculture conditions on seed germination

從圖7可以看出，培養90 d后，部分芽形成了小鱗莖，初期選用健壯芽可更好地在后期發育為鱗莖，未剝皮處理的種子形成的芽細長柔弱，基本不能形成小鱗莖，而經剝皮處理的種子形成的較健壯芽，經過持續培養，80%以上可以形成小鱗莖，成球率顯著高于未剝皮處理。因此，獲得長度和寬度比例適宜的壯芽非常必要，即剝皮處理是小鱗莖形成的重要前提。在篩選出的最佳萌發條件（C11號處理）下，萌發率、芽長、芽寬均達到最大值，小鱗莖形成的數量亦最多，也最強壯；因此，試驗篩選出的最佳種子萌發條件對于后續獲得野生郁金香離體小鱗莖同樣有持續影響。

綜上所述，本研究建立了新疆野生郁金香（T. sinkiangensi）的無菌萌發和小鱗莖形成體系：首先采用4℃冷藏8周以打破休眠，接種前用600 mg/L的GA3浸泡24 h，接種時用75%乙醇消毒30 s后，用2%的NaClO振蕩消毒10 min，并用手術刀剝去種皮，接種在1/2MS基本培養基上，于25℃下遮光培養，60 d后移出到僅含60 g/L蔗糖及8 g/L瓊脂的MS基本培養基上。

圖6 增殖培養60 d后芽的不同狀態Fig.6 Differentstatuses ofbuds aftercultured for 60 days

圖7 增殖培養90 d后小鱗莖的不同狀態Fig.7 Differentbulbletstatuses ofshoots aftercultured for 90 days

3 討論

成功的離體組織培養具有以下優點：能夠在短時間內獲得大批量的植物材料[11]，并且所需空間較小,可大大節省人力、物力及土地；保存期可避免由病原菌引起的退化、絕種；不經檢疫便可直接進行種質發放或國際的種質交換；也使所保存的離體種質能用于生產和研究[12]。新疆野生郁金香是我國特有的優質種植資源，雖然種類多，分布廣，但是由于放牧，牛羊啃食以及農田、林場的改造等原因，其生境遭到破壞，因此野生郁金香的保護、開發及利用等問題已經迫在眉睫。并且由于氣候條件的局限和病害的影響，除北方一些地區自然條件較適合外，在一些夏季濕熱的地區,在克服種球退化、種球越夏管理等方面還存在一些問題[13]。由于受到采樣與觀察條件的限制，對一些園藝性狀優良、具潛在育種價值的野生郁金香的研究也還無人涉及[14]。因此，野生郁金香的離體保存一方面對其資源保護和開發利用具有重要意義，另一方面，也為利用我國重要野生資源進行雜交育種和種球繁殖提供了可能。

本試驗采用2%的NaClO處理10 min，獲得了比HgCl2消毒更高的發芽率。因此，在除菌效果均較好的情況下，使用NaClO消毒更有利于郁金香種子發芽。原因可能是NaClO具有軟化種皮的作用，也可能是NaCIO相對HgCl2而言毒性較低，對種子的傷害小，因此更利于種子萌發。由于消毒方式篩選和最佳培養條件試驗同時進行，篩選最佳條件時采取的依舊是HgCl2消毒，若采用NaCIO消毒，可能會獲得更高的發芽率。盡管如此，利用HgCl2消毒亦獲得了較高的萌發率。目前，在郁金香鱗莖類觀賞植物的無菌播種研究中，未見消毒方式優化的報道。

陳芳等[7]研究表明，低溫（7℃）是野生郁金香種子萌發的首要條件，在低溫條件下用GA3浸種處理可顯著提高發芽率，并且發芽日期也縮短。在低溫條件下郁金香種子發芽時間過長，新疆郁金香和伊犁郁金香的適宜萌發溫度均為10℃，GA3處理可以替代層積作用[15]。郁金香雜交種子在15℃和24℃下暗培養或12 h/d光照培養均不萌發，只有在4℃條件下接種36～67 d才能萌發[6]。塔城郁金香（T.tarbagataica）和伊犁郁金香種子在室溫條件下均不發芽，GA3對解除種子休眠效果顯著，但不能代替低溫，兩者結合效果好[16]。張愛勤等[17]在探討常溫條件下種子萌發情況時發現，在4℃條件下刺破種子，500 mg/L GA3處理對打破郁金香休眠有效，培養基可提供充足營養，相對紙床而言又有較低的污染率。本試驗也表明，較高質量濃度的GA3處理（600 mg/L）對野生郁金香發芽有促進作用，試驗所用的野生郁金香種子在接種前均在4℃下冷藏了8周來打破休眠，然后在室溫下培養，因此試驗結論是室溫條件較適宜野生郁金香種子的萌發，不同于已有研究。這表明，雖然4℃條件是發芽的必要條件，但發芽率仍舊不高，并且萌發時間過長。說明低溫的作用主要為打破休眠，并不適宜郁金香種子的芽生長；因此，本試驗采取先冷藏打破休眠，再在室溫下培養獲得了較好的效果，且在生產中利于節能。

在對蘭科種子的無菌播種研究中發現，相對于MS和1/3MS，以1/2MS為基本培養基時獲得的原球莖增殖量最多，生長快而健壯[18]。本試驗也首次對比了MS和1/2MS 2種基本培養基對郁金香種子萌發的影響。結果表明，1/2MS對野生郁金香種子發芽更有效，優化了萌發條件。

王彩霞等[6]研究表明，在培養基中添加外源生長調節物質對提高野生雜交郁金香種子的萌發率無顯著效果，但對促進鱗莖增殖和誘導畸形芽形成鱗莖有一定作用。本試驗在使用僅含有60 g/L蔗糖、不含激素的培養基中獲得了小鱗莖，但生長較慢，部分形成的細弱芽畸形，難以辨別狀態。因此，在后續研究中可考慮添加外源生長調節劑以促進鱗莖的增殖和狀態保持。在室外播種試驗中，雖然獲得了較高的發芽率，但未見鱗莖形成：表明組織培養是獲得郁金香小鱗莖的一種穩定有效的手段。此外，我們也進行了室外土壤播種試驗，發現2月播種后，4月出葉約1 cm，發芽整齊，發芽率高，但生長至5月份，葉子相繼掉落，直至9月未見鱗莖形成，初步判定種子死亡。可能是由于小苗柔弱，難以適應露地環境，并且不耐高溫。具體原因尚不明確，需要進一步探究。

4 結論

本試驗篩選出了新疆野生郁金香種子接種前的最佳處理方式和最佳培養條件，證明了首先采用4℃冷藏打破休眠，再置于25℃下培養比其他研究中的直接置于低溫下培養效果好。郁金香種子剝皮處理是形成健壯芽的必要條件，而健壯芽又是離體小鱗莖形成的必要條件。試驗通過建立的無菌萌發體系，成功獲得了離體小鱗莖，實現了野生郁金香非原生生境的保存及擴繁。

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LIYue1,WU Yun1,ELMONGY Mohamed1,2,LüXuesi1,REN Ziming1,SUN Minyi1,XIA Yiping1*
(1.Department of Horticulture, College of Agriculture and Biotechnology,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China;2.Department of Horticulture,Faculty of Agriculture,Mansoura University,Mansoura 35516，Egypt)

wild tulip(Tulipa sinkiangensi);sterile sowing;resource preservation;germination rate;bulbletformation

S 682.2

A

10.3785/j.issn.1008-9209.2016.11.041

浙江省自然科學基金“換錦花小鱗莖發生方式比較及調控路徑研究”（LY17C150002）。

*通信作者(Corresponding author)：夏宜平(http://orcid.org/0000-0003-1335-2593)，E-mail：ypxia@zju.edu.cn

李岳（http://orcid.org/0000-0002-8529-8103），E-mail：ylly@zju.edu.cn

2016-11-04;接受日期(Accepted):2016-11-21