左旋多巴和氯碘羥喹治療對帕金森病獼猴血清抗氧化能力的影響

李立科，史良琴，劉 衡，羅啟慧,2，黃 超，劉文濤,2，陳曉林，陳正禮,2*

(1.四川農業大學動物醫學院，實驗動物疾病模型研究室，成都611130；2.四川農業大學實驗動物工程技術中心，四川雅安625014)

左旋多巴和氯碘羥喹治療對帕金森病獼猴血清抗氧化能力的影響

李立科1，史良琴1，劉 衡1，羅啟慧1,2，黃 超1，劉文濤1,2，陳曉林1，陳正禮1,2*

(1.四川農業大學動物醫學院，實驗動物疾病模型研究室，成都611130；2.四川農業大學實驗動物工程技術中心，四川雅安625014)

探討左旋多巴和氯碘羥喹對帕金森病（Parkinson’s disease，PD）獼猴的治療效果及血液抗氧化指標的影響，以期為PD藥物治療判定提供參考依據。利用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP）小劑量肌肉注射建立慢性PD獼猴模型，將8只PD獼猴隨機分為左旋多巴組（3只）、氯碘羥喹組（3只）和對照組（2只），連續4周分別經口給予左旋多巴+卡比多巴15 mg/kg、氯碘羥喹15 mg/kg和等量的生理鹽水，每天觀察記錄并運用PD評定量表進行行為評分；測定治療前后PD獼猴血清超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）、谷胱甘肽（glutathione,GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase,GPX）以及谷胱甘肽硫轉移酶（glutathione S-transferase,GST）的水平。結果發現：與同組治療前相比，左旋多巴組和氯碘羥喹組PD獼猴行為評分下降，差異有統計學意義，而對照組無明顯差異；左旋多巴組和氯碘羥喹組的SOD、GPX和GST活性和GSH含量均增加，MDA含量均降低，其中，左旋多巴組上述各指標的差異均有統計學意義（P＜0.05），氯碘羥喹組的GST活性和GSH含量差異也具有統計學意義（P＜0.05）。與僅注射生理鹽水的對照組相比，左旋多巴組的SOD和GST活性顯著增加，差異有高度統計學意義（P＜0.01），GPX活性和MDA含量降低（P＜0.05）；氯碘羥喹組的SOD活性和GSH含量顯著增加，差異有統計學意義（P＜0.05），GPX活性顯著降低（P＜0.01），其他各生化指標間差異無統計學意義。綜上表明，不同藥物治療通過提高PD獼猴血液中抗氧化酶的活性，降低脂質過氧化物的含量，增強機體的抗氧化能力，促進了獼猴臨床行為的恢復，從而對治療起到了積極作用。

帕金森病；恒河猴；1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶；左旋多巴；氯碘羥喹；行為評價；血清；抗氧化

Summary Parkinson’s disease(PD),characterized by progressive loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta ofthe brain，is the second mostcommon neurodegenerative disease.Itincludes the major motor symptoms ofakinesia, rigidity and tremor.Main mechanisms ofthe neuronaldegeneration ofPD include free radicals and oxidative stress,mitochondrial dysfunction,excitotoxicity,calcium cytotoxicity,trophic factor deficiency,inflammatory processes,genetic factors,environmental impactfactors,toxic action ofnitric oxide,and apoptosis,allofwhich may interactwith and amplify each other in a vicious cycleoftoxicity,leading to neuronaldysfunction,atrophy,and finally celldeath.

Eight healthy young rhesus monkeys were respectively daily injected a small dose of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine(MPTP)by intramuscular injection,then divided into a levodopa group(three rhesus monkeys),a clioquinol group(three rhesus monkeys)and a control group(two rhesus monkeys)randomly,and given 15 mg/kg levodopa+carbidopa, 15 mg/kg clioquinol and equal physiological saline by oral for 4 weeks respectively.The behavioral manifestations of all monkeys were evaluated,and their serum biochemical indices were measured before and after different drug treatments, including superoxide dismutase(SOD),glutathione peroxidase(GPX),glutathione S-transferase(GST),glutathione(GSH)and malondialdehyde(MDA).

With the continued injection of MPTP,the monkeys reached a state ofstable parkinsonism,which was firstobtained on the 62 days oftreatment.Since then,no significantvariation was observed.In addition,vocalization reduction was the firstsymptom, but it was indistinct;furthermore,we found that the monkeys became increasingly bradykinetic,and finally presented with tremors,which were strongerand earlier atthe arms than atthe legs.Otherearly phenotypes and long-lasting symptoms included a decrease in home cage activity and arm movement,and an increase of muscular rigidity and freeze.The behavior scores of the levodopa group and clioquinol group decreased after the treatment,and the difference was statistically significant,but the controlgroup showed no significantdifferences.The activities of SOD,GPX,GST and the GSH contentwere allincreased,while MDA concentration decreased in the levodopa group and clioquinol group;the above indexes in the levodopa group had statistical significance(P＜0.05),as well as the levels of GST and GSH in the clioquinol group(P＜0.05).Compared with the control group,the activities of SOD and GST increased significantly(P＜0.01),while the GPX activity and the MDA concentration decreased significantly(P＜0.05)in the levodopa group;the SOD activity and the GSH content increased significantly(P＜0.05),butthe GPX activity decreased significantly(P＜0.01)in the clioquinolgroup.

The above results show that levodopa and clioquinol can increase the blood antioxidant enzyme activity and decrease the lipid peroxide content,and then enhance the body’s antioxidant capacity and promote the recovery of clinical behavior,thus playing a positive role in PD monkeys.

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是繼阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease，AD）后的第二大神經退行性疾病，其發病率隨年齡增加而上升，影響全世界大約2%的60歲以上人口[1]。PD的主要病理特征是黑質致密部多巴胺神經元變性壞死，其病理組織學標志物為出現的路易小體；PD病人的臨床癥狀表現為運動遲緩、肌肉強直以及震顫[2]。引起PD神經變性的機制主要包括氧化應激、線粒體功能障礙、興奮性毒性、鈣的細胞毒性、營養因子缺乏、炎癥過程、遺傳因素、環境因素、一氧化氮毒性和細胞凋亡等[3]，所有這些因素都可能相互作用，從而放大毒性，形成惡性循環，最終導致神經功能障礙、萎縮以及細胞死亡。左旋多巴（levodopa，LD）作為臨床上應用最多且最有效的PD治療藥物[4]，能夠顯著改善PD病人臨床癥狀。但由于LD氧化代謝后會產生活性氧，可能對多巴胺神經元產生損傷，因此，目前對于LD的使用還存在爭議[5]。體外研究表明，LD會對神經細胞產生毒性[6-7]，但體內研究卻未見異常[8-10]。氯碘羥喹（clioquinol，CQ）原本是一種抗寄生蟲藥，后來發現它對PD動物模型和神經細胞能夠產生良好的治療效果，并可改善臨床病人的認知功能[11]。同時，CQ作為一種鐵離子螯合劑，能夠減少鐵離子在大腦關鍵核團的累積[12]，并在AD和PD臨床試驗中表現出良好的療效[13]，因此推斷CQ具有神經保護功能[14]。由于無法接觸到PD病人活體神經組織，不能對其大腦進行活體檢查，因而無法研究PD病人中樞神經系統的病變機制；因此，分析活體狀態下PD患者的腦脊液、血液、尿液以及唾液等體液樣本中相關物質的改變情況就變得尤為重要。在臨床研究中，由于腦脊液取樣需要腰椎穿刺，使健康患者的樣本獲取受限，而血液樣本相對容易獲取，使其成為研究的首選對象。因此，本文通過測定不同藥物治療后PD獼猴血液中抗氧化水平的變化，推斷其與藥效的關系，從而為臨床PD藥物治療效果判定提供較為科學的指導依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

健康恒河猴8只，雌雄各半，年齡3～4歲，體質量3～5 kg，由四川普萊美生物科技有限公司（國家實驗用獼猴種源基地）提供[動物生產許可證：SCXK (川)：2014-027]。

1.1.2 實驗試劑

1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫嘧啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP）、左旋多巴、卡比多巴、氯碘羥喹均購自美國Sigma公司；超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、丙二醛、谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽硫轉移酶等測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.1.3 實驗儀器設備

全波長讀數儀（Varioskan Flash，Thermo Scientific，美國），離心機（Sorvall Legend Micro 17/ 17R，Thermo Scientific，美國），攝像記錄儀（YHS-113，北京小米科技有限責任公司），恒溫水浴鍋（HH-42，江蘇常州國華電器有限公司），超凈工作臺（SW-CJ-1FD，江蘇蘇凈集團有限公司）等。

1.2 實驗方法

1.2.1 帕金森病動物模型建立

造模前動物先適應環境3個月，以減少應激并降低實驗誤差。供試動物在晝夜交替的自然光周期下飼養，自由飲水進食。按照m(MPTP)∶V(生理鹽水)=1 mg∶1.5 mL的比例溶解，在供試動物前臂肌肉發達處按0.2 mg/(kg·d)注射，每日上午9:00—9:30完成給藥；連續注射直到動物出現帕金森病主要體征狀態后，根據動物承受能力酌情繼續給藥。實驗中對動物的處置符合中華人民共和國科學技術部《關于善待實驗動物的指導性意見》的規定。

1.2.2 藥物治療

將成功建立的PD獼猴模型隨機分為3組：3只經口喂服配比為4∶1的左旋多巴+卡比多巴15 mg/kg；3只經口喂服氯碘羥喹15 mg/kg；2只經口喂服等量生理鹽水。每日上午9:00喂藥，連續4周。利用自身對照法對動物給藥前后相關指標進行比較研究。

1.2.3 行為評價

注射MPTP和給藥半小時后觀察動物，進行行為學評價。為減少實驗誤差，降低人為干擾因素，本實驗通過攝影方式記錄動物行為，借助帕金森病猴臨床行為評價量表[15]并結合自身的觀察進行少量修訂后，對PD獼猴模型以及藥物治療效果進行行為評分。評分細則如下：活動量0～3分，肌強直0～3分，運動遲緩0～3分，凍結0～2分，身體姿勢0～2分，震顫0～3分，采食0～3分，手臂移動0～2分，手臂姿勢0～2分。

1.2.4 生化測試

連續治療4周后，于每只獼猴前臂靜脈采血，血樣裝存于促凝管中。促凝管靜置一段時間后，以4℃、8 000 r/min離心5 min，取上清液，分裝，儲存于－80℃冰箱中備用，待測。樣品測定均嚴格按照試劑盒步驟進行。

1.2.5 數據處理

實驗數據均采用SPSS 20.0統計軟件進行分析，同組治療前后采用獨立方差t檢驗，治療后不同組之間的統計學差異利用單因素方差分析，并利用最小顯著差數法進行多重比較。柱狀圖上的數據以平均值±標準差表示，P＜0.05表示差異有統計學意義，P＜0.01表示差異有高度統計學意義。

2 結果與分析

2.1 PD獼猴模型的建立

獼猴造模前后的行為學評分結果（圖1）顯示：與自身對照相比，注射MPTP的獼猴在經歷7 d無癥狀后，其行為學評分開始逐步上升，并與MPTP在體內的累積劑量成正相關；在MPTP注射前期，獼猴未表現出明顯的行為差異，僅有部分出現發聲減少現象。獼猴早期行為變化包括活動量下降、手臂運動減少、肌肉僵直和凍結；隨著MPTP在體內的持續累積，獼猴運動越發遲緩，最終出現姿勢異常、肌肉強直和震顫等PD典型臨床癥狀并維持穩定。這表明PD獼猴模型建立成功。

2.2 藥物治療效果

停止注射MPTP并進行藥物治療后，獼猴行為評分均呈現下降趨勢（圖2）；與自身給藥前后對比發現，左旋多巴（LD）組（P＜0.01）和氯碘羥喹（CQ）組（P＜0.05）的獼猴行為評分均顯著下降，而對照組在統計學上無顯著差異。

圖1 慢性PD獼猴模型行為評分Fig.1 Behavior scores of the rhesus monkey models of chronic Parkinson’s disease

圖2 不同藥物治療后PD獼猴行為評分Fig.2 Behavior scores of PD rhesus monkey after treated with differentdrugs

2.3 藥物治療后獼猴抗氧化系統指標的變化

與同組治療前相比，LD組超氧化物歧化酶（SOD）活性增加（P＜0.05）；與僅注射生理鹽水的對照（CK）相比，LD組和CQ組的SOD活性升高，差異有統計學意義（圖3A）。如圖3B所示：與同組治療前相比，LD組和CK組的谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）活性增加（P＜0.05）；與CK相比，LD組和CQ組的GPX活性在統計學上顯著低于CK組。如圖3C所示：與同組治療前相比，LD組和CQ組的谷胱甘肽硫轉移酶（GST）活性增加（P＜0.05）,且LD組的GST活性在統計學上顯著高于CK組（P＜0.01）和CQ組（P＜0.05）。同樣，與同組治療前相比，LD組和CQ組的谷胱甘肽（GSH）含量均顯著增加，差異有統計學意義（P＜0.05）,且CQ組的GSH含量顯著高于CK組（P＜0.05）（圖3D）。與上述各指標變化相反，與同組治療前相比，LD組的丙二醛（MDA）含量顯著減少，且低于CK組和CQ組，差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖3E）。

3 討論

PD是一種由局部神經變性引起的疾病，雖然目前病因還不清楚，但研究表明，氧化應激在PD的發生發展過程中起到了關鍵作用[16-17]。研究表明，通過檢測外周血液能夠反映大腦黑質部氧化應激的水平[18]。因此，本研究通過測定不同藥物治療后PD獼猴血液中抗氧化水平的變化情況，并結合PD獼猴臨床行為癥狀，推斷其與藥效的關系。

研究發現，MPTP能選擇性損傷黑質部多巴胺神經元從而模擬PD癥狀[19-20]。同嚙齒類動物相比，靈長類動物在病理上與PD病人更加相似，因此，MPTP誘導的獼猴模型是研究PD的最佳動物模型。由于急性注射MPTP不能產生PD所有臨床癥狀[19]，因此，筆者嘗試通過肌肉注射MPTP，建立慢性PD獼猴模型。通過全身給藥，能更好地模擬人類臨床大腦雙側對稱性損傷的情況。由于不同獼猴對MPTP敏感程度不一，所以MPTP對大腦黑質部神經元損傷程度不同，獼猴也表現出不同的臨床行為癥狀，使得動物行為評分在前期波動特別大，并且只能產生輕度的PD癥狀；因此，本實驗在獼猴前期癥狀出現后繼續給予MPTP，以損傷更多的神經元來形成典型的PD癥狀。由于MPTP在多巴胺神經元中可以累積，本實驗通過持續注射MPTP，獼猴大腦黑質部多巴胺神經元受到不可逆的損傷，獼猴逐漸表現出穩定的PD癥狀，臨床行為評分趨于一致。

LD是目前治療PD最有效的藥物，作為多巴胺的天然前體，LD可以穿過血腦屏障，經神經元攝取轉運并進入黑質多巴胺細胞中脫羧轉變為多巴胺，從而改善PD病人的運動癥狀[21]。但在代謝過程中，LD會產生一定數量的活性氧，這可能會進一步加重內源性抗氧化能力下降的PD病人癥狀。體外研究表明，LD會對神經細胞產生損傷[6-7]，但在嚙齒類動物、非人類靈長類動物以及PD病人上并未發生；也有研究表明，LD能對神經細胞產生保護效果[4]。本研究發現，服用LD后，通過增強抗氧化酶的活力，加速清除機體內產生過多的自由基和過氧化物，重新維持了體內氧化劑與抗氧化劑之間的動態平衡。同時，通過補充LD還提高了腦內多巴胺的濃度，最終改善了PD獼猴的臨床行為癥狀。CQ作為一種鐵離子螯合劑，能夠降低腦內鐵離子濃度，增加酪氨酸羥化酶的活性[13]。由于大腦內酪氨酸羥化酶的活性受到鐵離子的調控[22]，因此，在CQ的作用下，通過減少腦內鐵離子的累積，增強酪氨酸羥化酶的活性，促進了多巴胺的合成，從而緩解了PD的臨床癥狀。同時，CQ通過螯合腦內的鐵離子，抑制了芬頓（Fenton）反應，減少了羥自由基在腦內的累積，從而增強了機體內源性抗氧化能力。對照組獼猴行為評分也出現了下降，這可能與獼猴大腦黑質紋狀體中多巴胺代償性增加有關[19]。同時，年齡也被認為是MPTP誘導PD行為恢復的一個潛在因素，并在小鼠[23]和靈長類動物[20]上得到證實。但對照組獼猴抗氧化酶活性與脂質過氧化物無顯著變化，說明獼猴行為雖有恢復但差異不顯著。

圖3 不同藥物治療后PD獼猴血液抗氧化水平變化Fig.3 Change ofantioxidation levelin blood ofPD rhesus monkey after treated with differentdrugs

4 結論

本實驗結果表明，PD獼猴服用LD和CQ后，通過提高血液中抗氧化酶活性，降低脂質過氧化物含量，重新維持了機體的氧化還原平衡狀態，從而減輕了PD獼猴的臨床癥狀。該結果為臨床PD藥物治療提供了參考依據。

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LI Like1,SHI Liangqin1,LIU Heng1,LUO Qihui1,2,HUANG Chao1,LIU Wentao1,2,CHEN Xiaolin1,CHEN Zhengli1,2*
(1.Laboratory of Animal Disease Model,College of Veterinary Medicine,Sichuan Agricultural University,Chengdu 611130,China; 2.Engineering and Technology Center for Laboratory Animals,Sichuan AgriculturalUniversity,Ya’an 625014,Sichuan,China)

Parkinson’s disease;rhesus monkey;1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine;levodopa;clioquinol;behavior evaluation;serum;antioxidation

Q 95-331;R-332

A

10.3785/j.issn.1008-9209.2016.05.251

國家科技支撐計劃（2014BAI03B01）；國家重大科學儀器設備開發專項（2013YQ49085906）。

陳正禮(http://orcid.org/0000-0002-9850-528X)，E-mail：chzhli75@163.com

（Firstauthor）：李立科（http://orcid.org/0000-0002-3641-5422），E-mail：394580507@qq.com

2016-05-25；接受日期(Accepted)：2016-08-02