宰后牦牛肉細胞凋亡對肌肉內環境與嫩度的影響

王琳琳 馬君義 余群力 韓 玲 郭宗林 石紅梅

(1．甘肅農業大學食品科學與工程學院，蘭州730070;2．青海百德投資發展有限公司，西寧810008; 3．甘南藏族自治州畜牧科學研究所，合作747000)

宰后牦牛肉細胞凋亡對肌肉內環境與嫩度的影響

王琳琳1馬君義2余群力1韓 玲1郭宗林1石紅梅3

(1．甘肅農業大學食品科學與工程學院，蘭州730070;2．青海百德投資發展有限公司，西寧810008; 3．甘南藏族自治州畜牧科學研究所，合作747000)

為探究牦牛肉宰后成熟過程中細胞凋亡對肌肉內環境、細胞凋亡因子及嫩度的影響，以經環孢菌素A(CsA)處理的牦牛背最長肌為研究對象，測定了成熟過程中肌肉內環境指標、凋亡因子及嫩度指標的變化。結果表明，24～120 h時間內，CsA組肌纖維直徑和肌纖維橫截面積均顯著(P＜0.05)或極顯著(P＜0.01)大于對照組;宰后6 h、72～120 h，CsA組pH值顯著低于對照組(P＜0.05)，宰后6～168 h，CsA組ATP含量均高于對照組，且在宰后12 h、72～168 h兩者之間ATP含量存在顯著差異(P＜0.05);成熟過程中CsA組MPTP開放程度極顯著低于對照組(P＜0.01);成熟前期CsA組胞漿中Cyt-c濃度顯著或極顯著低于對照組，成熟后期CsA組胞漿中Cyt-c濃度顯著或極顯著高于對照組;在整個成熟過程中(除72～120 h)，CsA組caspase-3活性均顯著或極顯著低于對照組，CsA組Hsp27表達量均顯著或極顯著低于對照組;12～24 h，CsA組剪切力顯著(P＜0.05)或極顯著(P＜0.01)高于對照組。表明CsA能夠通過抑制MPTP的開放而抑制細胞凋亡的發生并影響肌肉內環境、caspase-3活性、Hsp27表達，剪切力及肌原纖維微觀結構的變化，說明細胞凋亡的發生對肌肉內環境變化及宰后牦牛肉嫩化具有重要影響，且可以通過控制宰后肌肉細胞凋亡發生進程來調節肌肉內環境變化及肌肉嫩化程度。

耗牛肉;宰后成熟;細胞凋亡;肌肉內環境;環孢菌素A;微觀結構

引言

隨著國內外學者對肌肉成熟嫩化機制的不斷探究，研究的熱點逐漸由組織蛋白酶系和鈣激活酶系轉向細胞凋亡酶系對宰后肌肉嫩度的改善作用。細胞凋亡是指為維持內環境穩定，由基因控制的細胞自主、有序的細胞死亡形式［1－2］，分為外源死亡受體途徑及內源線粒體途徑，其中線粒體途徑被認為是哺乳動物及其他細胞模型發生凋亡的主要途徑，而Cyt-c從線粒體釋放到胞漿中這一關鍵步驟，是線粒體途徑發生的根本原因［3］。線粒體通透性轉換孔(MPTP)是位于線粒體內外膜之間由多種蛋白質共同組成的、具有非特異性、電壓依賴性的復合物孔道，眾多研究表明其與細胞凋亡密切相關，因各種因素導致的MPTP的開放，被認為是Cyt-c從線粒體釋放到胞漿中的直接原因［4］。同時，MPTP的專一性抑制劑CsA能夠有效抑制MPTP的開放及細胞凋亡的發生［5］。然而，關于在牦牛肉宰后成熟過程中，CsA是否通過抑制MPTP開放進而抑制細胞凋亡的發生，并對肌肉內環境及牦牛肉嫩度造成影響的研究，國內外尚未見報道。因此，有必要研究CsA處理對細胞凋亡的抑制作用及對肌肉內環境和嫩度的影響，為細胞凋亡改善牦牛肉嫩度機制提供理論依據。

細胞凋亡對肌肉的嫩化作用是近年來肉品科學研究的熱點，尤其在細胞凋亡對肌原纖維蛋白降解方面國內外學者做了大量研究。SENTANDREU等［6］于2002年首次將細胞凋亡及細胞凋亡酶引入到宰后肌肉的蛋白水解及嫩化過程中，認為在動物屠宰以后會發生細胞的死亡即細胞凋亡，而并非細胞壞死，這一理論為細胞凋亡嫩化機制提供了理論可行性及研究的必要性。KEMP等［7］研究發現宰后豬肉caspase-3活性與剪切力呈顯著相關性;孫志昶等［8］在研究宰后不同部位牦牛肉細胞凋亡與肉嫩度之間關系時，也發現caspase-3活性與剪切力呈顯著或極顯著的關系。CHEN等［9］研究指出凋亡誘導劑喜樹堿、依托泊苷及Ca2+均能提高肌原纖維的水解;HUANG等［10］利用 caspase-3的選擇性抑制劑DEVE-CHO處理宰后肉類時發現，細胞內的caspase-3選擇性抑制劑可以抑制肌肉骨架蛋白的降解，以上研究進一步說明細胞凋亡酶能夠降解肌細胞骨架蛋白進而改善肌肉嫩度。

近年來在細胞凋亡對肌肉的嫩化方面，國內外學者已作了大量的研究，然而關于肌肉在宰后成熟過程中細胞凋亡如何發生，及其與肌肉內環境的關系，以及進而改善肌肉嫩度方面的研究報道較少。本文以經CsA處理的牦牛肉為研究對象，測定成熟過程中肌肉內環境變化指標、細胞凋亡相關指標及嫩度相關指標，初步探索CsA處理對細胞凋亡的抑制作用及對肌肉內環境與嫩度的影響，最終明確細胞凋亡發生進程與肌肉內環境、肌肉嫩度變化的關系，以期為牦牛肉宰后實際生產嫩化過程提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料:牦牛由甘肅天瑪生態食品科技股份有限公司提供，選取在同一牧場，生長發育正常、健康無病、體重均勻、平均年齡2～4歲的甘南牦牛10頭，宰前禁食16～18 h，禁水2 h。

試驗試劑:環孢菌素A、蔗糖、甘露醇、EDTA、牛血清白蛋白、Hepes、二甲苯、連二亞硫酸鈉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、疊氮鈉、十二烷基硫酸鈉、丙烯酰胺、PVDF膜、免疫印跡化學發光試劑ECL、顯影粉、定影粉、Anti-Hsp27抗體;caspase-3活性測定試劑盒等。

1.2 主要儀器設備

Spectramax M2型酶標儀，美國美谷分子儀器有限公司;RF5301-PC型熒光分光光度計，日本島津公司;TGL-16M型高速臺式冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司;C-LM4型數顯式肌肉嫩度儀，上海精密科學儀器有限公司;XH-B型旋渦混合器，江蘇康健醫療用品有限公司;Tanon-5200型全自動化學發光分析儀，上海天能科技有限公司;SH-100型凝膠圖像分析系統，上海四星生物技術公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品采集和制備

以背最長肌(Longissimus dorsi)為試驗對象，從胴體上取下背最長肌約40 g，用錫箔紙包裹后立即放入液氮中作為0 h樣品。其余肉樣迅速切成小塊(40 g/塊)，隨機分成2組，1組不作任何處理為空白對照樣品，另1組注射200mmol/L的CsA溶液(料液比1 g/mL)，于4℃條件下，分別成熟6、12、24、72、120、168 h，并在相應時間點測定pH值和剪切力，對于caspase-3活力、Cyt-c含量等不便立即測定的指標，將肉樣在設計時間點采集并用液氮迅速冷卻后置于－80℃待測。

1.3.2 肌肉組織學觀察

將樣品切成長×寬 ×高為1.0 cm×0.5 cm× 0.5 cm的肉塊，用10%中性甲醛溶液浸泡48 h，然后將樣品放入70%、80%、90%、95%(體積分數)乙醇溶液中脫水1 h，100%乙醇Ⅰ、Ⅱ各10 min;二甲苯各透明15min后組織包埋、修片、切片、染色，中性樹膠封片后顯微拍照。然后用 Motic Images Advanced 3.2圖像處理系統軟件測量單根肌纖維直徑、肌細胞間距和肌纖維橫截面積，同時觀察細胞核的形態變化。

1.3.3 pH值測定

將便攜式pH計的探針插入肉樣中，使pH計的電極與肌肉組織充分接觸，讀數穩定后記錄，每個肉樣重復測定3次，取平均值。

1.3.4 ATP含量測定

參照南京建成生物工程研究所的ATP含量測定試劑盒說明書測定ATP含量(摩爾質量濃度)，用雙縮脲法測定樣品的蛋白含量，ATP含量的單位為μmol/g。

1.3.5 MPTP開放程度測定

參照LI等［11］及胡志剛等［12］研究方法，取牛背最長肌，剪碎后置于 10倍線粒體分離介質中(220mmol/L甘露醇、70mmol/L蔗糖和2.0mmol/L EDTA，5.0mmol/L 4-丙磺酸基嗎啉和0.5%牛血清白蛋白，pH值7.4)用勻漿機勻漿。勻漿液于4℃，1 000 g離心10 min，取上清1 000 g離心10 min，于4℃，8 000 g離心20min，所得沉淀為線粒體，上清液為胞漿。線粒體蛋白含量用雙縮脲法進行檢測，使用前用MPTP測試介質稀釋至0.3mg/mL蛋白質量濃度。MPTP測試介質(230 mmol/L甘露醇、70mmol/L蔗糖，3.0mmol/L Hepes，pH值7.4)。在石英杯中加入3mLMPTP測試介質，然后根據線粒體的蛋白濃度加入一定量的線粒體，用紫外分光光度計檢測540 nm處的吸光度，吸光度增大，表明孔的開放程度減小。

1.3.6 胞漿中Cyt-c濃度測定

參照辛國榮等［13］研究方法，取純化的1.5 mL胞漿，加少許連二亞硫酸鈉(0.025 g)，振搖后，在520 nm處測定吸光度，由標準曲線計算胞漿中Cyt-c的濃度。

1.3.7 caspase-3活性測定

按照caspase-3活性檢測試劑盒說明書并稍作改進對caspase-3的活性進行測定。取90 mg組織肉樣，剪碎后加入500μL caspase-3裂解液，用玻璃勻漿機于4℃勻漿30次。勻漿液于4℃，10 000 g離心10 min，離心完畢后取上清液待測。取85μL caspase-3反應緩沖液，10μL待測上清液，5μL 2mmol/L caspase-3反應底物DEVD-pNA，依次加入96孔酶標板中，對照孔加入95μL反應緩沖液，5μL caspase-3反應底物DEVD-pNA，用封口膜封住，置于37℃恒溫箱中反應1～2 h，取下封口膜，用酶標儀在405 nm處測定吸光度。

1.3.8 Hsp27蛋白表達量測定

采用12%的分離膠和5%濃縮膠，將變性蛋白樣品離心吸取上清上樣，每條泳道上樣100μg總蛋白，電泳分離后用轉膜儀將凝膠中的蛋白轉到PVDF膜上，轉印后的PVDF膜在含5%脫脂奶粉的TBST溶液中室溫(20℃)封閉1 h，在1.5 mL的EP管中加入1 mL的封閉液，再加入適量的一抗，于4℃冰箱中放置12 h;將膜取出放入TBST洗膜盒中，在室溫條件下清洗3次，每次10 min;之后用1∶4 000稀釋的過氧化物標記的羊抗兔免疫球蛋白抗體，室溫條件下孵育1 h，再次清洗，隨后將ECL發光試劑滴加到膜上，5 min后，用濾紙盡量吸去膜邊緣多余的ECL發光試劑，將膜平放到壓片暗盒中，進行壓片，5min后，在顯影液中顯影15 s，洗凈后將膜置于全自動化學發光分析儀中進行定影。使用Image J軟件進行灰度分析，目的條帶的灰度與0 h條帶灰度之比即為Hsp蛋白表達量的百分數。

1.3.9 剪切力

取厚約4 cm、質量100 g左右的肉樣(除去表面脂肪和結締組織)，裝入塑料薄膜袋，用夾子封口，放入80℃水浴鍋中，加熱到中心溫度為75℃，取出冷卻至室溫，然后用1.27 cm的取樣器沿肌纖維方向鉆取測定樣品，用剪切力儀測定剪切力，每組重復3次，取平均值。

1.3.10 肌原纖維及線粒體超微結構觀察

參照HORN等［14］研究方法，取尺寸為0.5 cm× 0.5 cm×0.5 cm的肉塊，用3%戊二醛磷酸鹽緩沖液固定，再用鋨酸固定，磷酸緩沖液沖洗，乙醇梯度脫水，環氧樹脂浸透包埋，超薄切片機切片，用Hitachi H-7650型透射電鏡進行成像觀察。

1.4 統計分析

試驗結果均采用平均值±標準差表示，數據均平行測定3次，用SPSS 19.0軟件進行方差分析(ANOVA，P＜0.01，P＜0.05)，多重比較采用新復極差法(P＜0.05)，用Origin 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 細胞核及骨骼肌細胞形態學變化

2.1.1 細胞核形態學變化

如圖1所示，宰后成熟過程中對照組與CsA組牦牛骨骼肌細胞核形態存在一定差異。宰后6～24 h，牦牛骨骼肌細胞核的結構完整(如箭頭所示)，輪廓清晰，并且核質分布均勻;但隨著成熟時間的延長，部分骨骼肌細胞核開始向邊緣遷移，同時細胞皺縮，細胞間距逐漸增大，這是典型的細胞凋亡特征。KWAK等［15］及孫志昶等［8］研究也證實細胞核向邊緣移動，發生邊緣化，肌肉發生了明顯的細胞凋亡現象。同時，在整個成熟過程中，CsA組骨骼肌細胞核形態較對照組骨骼肌細胞核結構完整，分布均勻，表明CsA組顯著抑制了骨骼肌細胞凋亡的發生程度。

圖1 CsA處理對牦牛肉成熟過程中細胞核形態學變化的影響Fig．1 Effect of CsA treatment on morphological changes of yak skeletalmuscle nucleus during postmortem aging

2.1.2 骨骼肌細胞形態學變化

成熟是肌肉宰后發生的一個復雜的生化反應過程，機體在缺血缺氧情況下，肌肉pH值、ATP含量、線粒體形態及功能、骨骼肌細胞形態等均會發生不同程度的改變甚至破壞，同時細胞也進入了一個不可逆的凋亡狀態［2］。肌纖維形態是評價肌肉嫩度的指標之一，肌纖維直徑越小，嫩度越好［16］。由表1和圖1可知，2組骨骼肌肌纖維直徑和肌纖維橫截面積均隨著成熟時間延長而減小，肌纖維間距隨時間延長而增大，且在成熟的中后期肌纖維形態皺縮較明顯，王莉［16］研究結果也表明隨著成熟時間延長，骨骼肌肌纖維直徑和橫截面積逐漸減小且肌纖維間距逐漸增大;同時，宰后6 h，24～120 h，CsA組肌纖維直徑顯著或極顯著大于對照組(P＜0.05，P＜0.01);12～120 h，CsA組橫截面積顯著或極顯著大于對照組(P＜0.05，P＜0.01)，宰后12 h、120～168 h，CsA組肌纖維間距顯著或極顯著小于對照組(P＜0.05，P＜0.01)，說明CsA組肌纖維皺縮速度較對照組慢，嫩度改善作用較弱，綜合上述指標說明，CsA處理顯著抑制了成熟過程中肌纖維的皺縮，進一步表明抑制細胞凋亡也可抑制骨骼肌細胞形態的改變。

表1 CsA處理對牦牛肉成熟過程中骨骼肌細胞形態學變化的影響Tab．1 Effect of CsA treatment on morphological changes of yak skeletalm uscle cells

2.2 肌肉內環境變化

2.2.1 pH值

宰后細胞缺血缺氧條件造成細胞內環境的酸化，這種變化有利于凋亡現象的發生，有研究表明，肌細胞內環境pH值在7.4以上時能夠嚴重抑制caspase-3酶原的活化，從而抑制caspase-3的激活，阻止細胞凋亡的發生［17］。由表2可知，對照組pH值在成熟過程中呈先下降后上升的變化，宰后24 h pH值顯著低于12 h(P＜0.05)，宰后168 h pH值較宰后0 h顯著降低14.58%(P＜0.05);宰后6 h、72～120 h，CsA組pH值顯著低于對照組(P＜0.05)，12～24 h時2組pH值無顯著差異，此研 究 結 果 與 賈 青［18］研 究 結 果 一 致，BOUDJELLAL等［19］研究發現pH值下降能夠導致線粒體釋放Cyt-c到胞漿中，啟動caspases級聯反應發生，也有研究發現pH值下降到6.3時，細胞凋亡發生，本研究指出宰后6 h、72～120 h，CsA組pH值顯著低于對照組，說明CsA處理能夠顯著影響肌肉內環境的變化，且隨著成熟時間的延長，CsA抑制作用減弱，pH值下降程度降低，此研究結果與賈青［18］研究結果不同，其研究表明宰后24 h后，抑制劑處理組pH值在72～120 h顯著高于對照組，造成此現象的原因可能是所用凋亡抑制劑的種類及作用機理不同。

2.2.2 ATP含量

ATP是caspases家族發生級聯反應的必要條件，有研究表明肝臟細胞凋亡的發生主要依賴ATP。由表2可知，隨著成熟時間的延長，對照組及CsA組中ATP含量呈不同程度的下降。宰后6～168 h，CsA組ATP含量均高于對照組，且在宰后12 h、72～168 h兩者之間ATP含量存在顯著差異(P＜0.05)，12 h時CsA組ATP含量比對照組高31.71%，說明CsA能夠抑制ATP含量的下降，ADRAIN等［20］研究指出ATP含量的降低會直接抑制caspases級聯反應，使caspases降解蛋白的作用減弱，且抑制細胞凋亡的發生也會抑制ATP含量的下降，與本研究的結果相似，說明宰后成熟過程中細胞凋亡的發生與ATP含量的變化密不可分。

表2 CsA處理對牦牛肉成熟過程中肌肉內環境變化的影響Tab．2 Effect of CsA treatment on internal environment changes of yak skeletalmuscle cells

2.3 MPTP開放程度及胞漿中Cyt-c濃度變化

2.3.1 MPTP開放程度

目前，關于線粒體凋亡途徑中Cyt-c的釋放機制主要有2種解釋:通過Bcl-2家族蛋白的調控;線粒體內、外膜之間的通透性轉換孔外膜特異性斷裂，導致Cyt-c的釋放，在多種細胞模型中都表明Cyt-c通過MPTP釋放［21］。在牦牛肉宰后成熟過程中關于Cyt-c的釋放機制相關研究不足，HUANG等［1］研究表明在牛肉宰后成熟過程中，抗凋亡因子Bcl-2表達量沒有顯著變化，而促凋亡因子Bax表達量顯著增加。由表3可知，對照組MPTP的開放程度呈先增大后減小的變化且隨著成熟時間的延長MPTP呈不可逆的開放狀態。在整個成熟過程中，CsA組MPTP開放程度極顯著低于對照組(P＜0.01)，說明CsA處理確實抑制了MPTP的開放，VALERY等［22］的研究也證實CsA能夠抑制血細胞MPTP的開放，間接抑制Cyt-c的釋放并影響細胞凋亡的發生。同時，在諸如腫瘤細胞等多種細胞模型中也證明CsA能夠抑制MPTP的開放，進而影響細胞凋亡級聯反應的發生，然而也有部分研究表明Cyt-c的釋放與MPTP無關，原因可能與所用細胞模型、MPTP的結構組成及功能有關。

表3 CsA處理對牦牛肉成熟過程中MPTP開放程度及胞漿中Cyt-c濃度的影響Tab．3 Effect of CsA treatment on MPTP opening and Cyt-c content

2.3.2 胞漿中Cyt-c濃度

Cyt-c在多種細胞的凋亡過程中起著關鍵的凋亡信號放大作用，Cyt-c從線粒體釋放到胞漿是細胞凋亡發生的關鍵步驟［7］。由表3可知，成熟前期CsA組胞漿中Cyt-c濃度顯著或極顯著低于對照組，而在成熟后期CsA組胞漿中Cyt-c濃度顯著或極顯著高于對照組，由此說明CsA處理抑制了線粒體中Cyt-c向胞漿中的釋放，但隨著CsA抑制作用的減弱，Cyt-c被抑制的程度也相應減弱，導致在成熟后期CsA組中Cyt-c被大量釋放到胞漿中，由此證明CsA通過抑制MPTP的開放間接抑制了Cyt-c的釋放及細胞凋亡的發生。HUANG等［1］研究表明，胞漿中Cyt-c呈先上升后下降的變化，與本研究對照組Cyt-c濃度變化趨勢一致，同時本研究結果與PETRONILLI等［23］及KUMARSWAMY等［24］的研究結果也一致，說明抑制MPTP開放能夠抑制線粒體Cyt-c釋放及細胞凋亡的發生。

2.4 細胞凋亡因子變化

caspases在細胞凋亡過程中的生物化學和形態學變化中起著至關重要的作用，有研究表明活化的caspase-3能介導多種細胞模型中蛋白的水解過程，也有研究表明宰后成熟過程中細胞骨架蛋白的降解主要由caspase-3來完成，具有不可替代的地位［25］。由圖2可知，在整個成熟過程中(除72～120 h)，CsA組caspase-3活性均顯著或極顯著低于對照組(P＜0.05，P＜0.01)，表明CsA通過抑制Cyt-c的釋放進而抑制下游caspase-3的激活，CHEN等［9］研究表明抑制細胞凋亡能夠顯著影響caspase-3的活性。PANDEY等［26］及FU等［27］研究表明caspase-9能夠激活下游的caspase-3發生細胞凋亡，也有研究指出在caspases蛋白酶水解的級聯放大反應中，細胞內的caspase-3酶原裂解成2種亞基，隨后這2種亞基異構聚合，使caspase-3活化［28］。

圖2 CsA處理對caspase-3活性的影響Fig．2 Effect of CsA treatment on caspase-3 activity

Hsp27是機體中細胞維持和修復的重要成分，能特異性抑制應激誘導的細胞凋亡，有研究者通過免疫共沉淀試驗證明，Hsp27可與Cyt-c和caspase-3的酶原結合，從而抑制細胞凋亡的發生［29］。圖3表明，對照組中Hsp27蛋白表達量隨著成熟時間的延長而顯著降低(P＜0.05)，72 h時達到最小值后又呈上升趨勢，此結果與李婕等［30］研究結果相一致; CsA組中，0～24 h時間內的Hsp27蛋白表達量顯著下降(P＜0.05)，說明在成熟過程中Hsp27蛋白表達量會受到成熟時間及CsA處理的影響，同時CsA組Hsp27蛋白表達量在整個成熟過程中均顯著或極顯著低于對照組(P＜0.05，P＜0.01)，表明細胞凋亡發生程度降低時，Hsp27蛋白表達量也會下降，說明CsA通過抑制細胞凋亡可以間接影響機體的某些應激反應。

圖3 CsA處理對Hsp27蛋白表達量的影響Fig．3 Effect of CsA treatment on Hsp27 expression amount

圖4 CsA處理對牦牛肉成熟過程中剪切力變化的影響Fig．4 Effect of CsA treatment on shear force

2.5 剪切力變化

嫩度是在成熟過程中評價肉質成熟程度的重要指標，主要決定于成熟過程中肌肉組織各組分及肌肉內部的生物化學變化對各組分特性的改變［2］。而剪切力是目前肉品研究中評價成熟過程中肌肉嫩度的代表性指標。由圖4可知，2組肉樣在成熟過程中剪切力都呈先上升后下降的變化，且因蛋白凝固、肌纖維硬化，肌肉進入僵直期，導致剪切力達到最大值，此研究結果與李婕等［30］的研究報道相一致;同時，在12～24 h時間內，CsA組剪切力顯著或極顯著高于對照組(P＜0.05，P＜0.01)，而在成熟72 h后，CsA組剪切力均顯著或極顯著低于對照組;以上研究結果表明，CsA通過抑制骨骼肌細胞凋亡級聯反應，間接抑制了凋亡效應酶對肌細胞骨架蛋白的降解，且隨著CsA抑制作用的減弱，肌肉嫩度得到改善，進一步證明細胞凋亡對宰后肌肉的嫩化起到非常重要的作用，CHEN等［9］的研究結果也支持此結論。

2.6 肌原纖維及線粒體超微結構

從圖5可以看出，2組牦牛肉肌原纖維超微結構在形態上基本一致，明帶中間的Z線清晰，每一條肌原纖維都呈現規則的明帶和暗帶。對照組牦牛肉在成熟過程中肌原纖維超微結構發生了明顯變化，宰后24 h，肌原纖維連接緊密，肌原纖維框架結構清晰，肌節完整且排列有序，同時，線粒體結構完整，輪廓清晰，線粒體的脊突明顯，隨著時間的延長，肌纖維的正常排列被破壞，肌間距離變寬，肌纖維發生皺縮，線粒體體積增大并發生腫脹，呈氣泡狀，宰后168 h，肌原纖維大面積斷裂、溶解，出現大量肌原纖維小片，Z線斷裂程度加重且部分線粒體溶解消失;CsA組中，宰后120～168 h，肌原纖維結構均較對照組完整，依然能夠看到肌原纖維超微結構變化不大，但是部分線粒體也呈空泡狀，脊突消失并發生了溶解;CsA組肌原纖維及線粒體超微結構破壞程度小于對照組，說明CsA通過抑制Cyt-c的釋放，間接抑制了成熟過程中細胞凋亡的發生，進而降低了細胞凋亡對嫩度的改善作用，降低了超微結構的破壞程度。

圖5 CsA處理對牦牛肉成熟過程中肌原纖維及線粒體超微結構的影響Fig．5 Effect of CsA treatment onmyofibrils and mitochondrial ultrastructure

3 結論

(1)CsA顯著抑制了牦牛肉宰后成熟過程中骨骼肌肌纖維的皺縮，影響肌肉內環境變化，抑制MPTP的開放程度、胞漿中Cyt-c的濃度及caspase-3活性變化，同時也抑制了成熟過程中Hsp27的表達、肌原纖維及線粒體微觀結構變化，且隨著成熟時間的延長，CsA的抑制作用減弱，細胞凋亡反應進程加快。

(2)CsA通過抑制MPTP開放程度間接抑制細胞凋亡的發生，并抑制凋亡效應酶對肌細胞骨架蛋白的降解，且隨著MPTP被抑制作用的降低，肌肉嫩度得到改善，說明細胞凋亡對牦牛肉宰后內環境變化及肌肉嫩化具有重要作用。

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Effects of Apoptosis on Muscle Internal Environment and Tenderness during Yak Meat Postmortem Aging

WANG Linlin1MA Junyi2YU Qunli1HAN Ling1GUO Zonglin1SHIHongmei3
(1．College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China 2．Qinghai Baide Investment Development Limited Company，Xining 810008，China 3．Gannan Institute of Animal Science and Veterinary，Hezuo 747000，China)

With the aim to explore the effects of apoptosis on muscle internal environment，apoptosis factors and tenderness during postmortem aging，the longissimus dorsi muscles injected with specific inhibitor cyclosporin A(CsA)of MPTP were taken as experiment objects．The muscle internal environment factors，apoptosis factors and tenderness index were measured．The results indicated that myofiber diameter and cross section area in the CsA group were significantly or extremely significantly larger than those in the control group(P＜0.05，P＜0.01);after 6 h and 72～120 h of postmortem，the pH value in the CsA group was lower than that in the control group(P＜0.05)，and at 6～168 h of postmortem，ATP contents in the CsA group were higher than those in control group，specially，after12 h and 72～168 h of postmortem，ATP contents in the two groups had significant difference(P＜0.05);the degree of MPTP opening in the CsA group was lower than that in the control group(P＜0.01);Cyt-c content in the cytoplasm was significantly or extremely significantly lower in the early aging stage，and the resultwas opposite in the late aging time;caspase-3 activities in the CsA group was lower than those in the control group during the whole time except after 72～120 h of postmortem;Hsp27 expression in the CsA group was lower than that in the control group，after 12～24 h of postmortem，the shear force of the CsA group was higher compared with the control group．Cyclosporin A could suppress the changes ofinternal environment，caspase-3 activities，Hsp27 expression level and the shear force and changes of myofibrils and mitochondrial ultrastructure by suppressing the opening of MPTP，the apoptotic process played a significant role in the changes of internal environment and yak meat tenderness during postmortem aging and the changes of internal environmentand tenderness could be adjusted by controlling the apoptosis process．

yak meat;postmortem aging;apoptosis;muscle internal environment;cyclosporine A; ultrastructure

TS251.1

A

1000-1298(2017)07-0317-08

2017-02-04

2017-04-05

青海省重點研發與轉化計劃項目(2017-NK-C6)、國家自然科學基金項目(31560463)、2015甘肅省財政廳專項和國家肉牛牦牛產業技術體系項目(CARS-38)

王琳琳(1988—)，女，博士生，主要從事畜產品加工研究，E-mail:jiayouwl123@163．com

余群力(1962—)，男，教授，博士生導師，主要從事畜產品加工研究，E-mail:yuqunlihl@163．com

10．6041/j．issn．1000-1298．2017．07．040