miRNA-34a和miRNA-29b在非小細胞肺癌中的表達及意義

趙淑燦 鄭定容

·論著·

miRNA-34a和miRNA-29b在非小細胞肺癌中的表達及意義

趙淑燦 鄭定容

目的 探討非小細胞肺癌(NSCLC)患者肺癌組織標本中miRNA-34a和miRNA-29b基因的表達與臨床特征及化療療效的相關性。方法 將已確診的80例NSCLC患者腫瘤肺組織作為試驗組(并按病理類型及TNM分期分組)，同期隨機選擇肺部為良性疾病肺組織100例作為對照組，通過實時熒光聚合酶鏈反應(RT-PCR)法檢測 miRNA-34a和miRNA-29b基因表達水平，并回顧性分析miRNA-34a和miRNA-29b基因表達與化療療效情況。結果 miRNA-34a在試驗組的組織表達水平高于對照組(P<0.05)；miRNA-29b在試驗組的組織表達水平低于對照組(P<0.05)；miRNA-34a在腺癌組與鱗癌組均明顯高于其他型肺癌組(P<0.05)，在腺癌組組中的表達高于鱗癌組(P<0.05)，miRNA-29b在腺癌組與鱗癌組均明顯低于其他型肺癌組，在腺癌組中的表達低于鱗癌組(P<0.05)，miRNA-34a和miRNA-29b在肺癌組織分級、TNM分期及淋巴結轉移呈密切相關性(P<0.05)。miRNA-34a高表達組患者化療有效率顯著低于低表達組患者(P<0.05)；miRNA-29b低表達組患者化療有效率顯著低于高表達組患者(P<0.05)。NSCLC組織中miRNA-34a的表達和 miRNA-29b的表達之間呈負相關(r=-0.79，P<0.01)。結論 miRNA-34a的基因表達在NSCLC中高表達，miRNA-29b的基因表達在NSCLC中低表達，它們表達水平有助于臨床分期組、織學分級和淋巴結轉移的判斷，并且miRNA-34a低表達或者miRNA-29b高表達的患者化療有效率高，是化療受益的指標之一。

非小細胞肺癌；mRNAs；療效；miRNA-34a；miRNA-29b；臨床意義

肺癌是嚴重威脅人類健康與生命的非常常見的惡性腫瘤之一，隨著大氣污染的加重，其發病率和病死率均是最高，其中非小細胞肺癌(NSCLC)約占的肺癌患者的85%，發病較隱匿，并且50%的NSCLC患者確診時即為晚期肺癌患者[1],存在不同程度轉移情況,從而喪失根治手術的機會，晚期NSCLC化療效果多不滿意[2]，這使得NSCLC的早期診斷顯得尤為重要。研究表明，腫瘤患者癌組織中可檢測到miRNAs表達異常，這讓癌組織中miRNAs成為一種非侵入性的腫瘤標志物提供了方向[3]。我們通過檢測并比較NSCLC患者腫瘤肺組織以及健康者肺組織中miRNA-34a和miRNA-29b的表達情況，并回顧性分析miRNA-34a和miRNA-29b基因表達與化療療效情況，以期為NSCLC的診斷及治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取汕頭市中心醫院于2014年12月至2015年7月確診的80例NSCLC患者為研究對象，所有病例均符合《原發性肺癌診療規范(2011年版)》中關于“NSCLC的診斷標準”[4]；所有入選病例有完整的臨床病例資料，既往無其他惡性腫瘤病史，排除有化療禁忌證的患者，排除合并終末期肝病或腎病及其他部位惡性腫瘤患者，入院之前未接受過化療和放療；其中男42例,女38例；年齡26～80歲，平均年齡(50.7±12.6)歲。80例NSCLC患者腫瘤肺組織為試驗組，其中肺鱗癌30例為鱗癌組，肺腺癌35例為腺癌組，其他型肺癌15例為其他型肺癌組，淋巴結轉移42例為轉移組，無淋巴結轉移者38例為無轉移組，TNM分期按照國際肺癌研究會(IASLC)公布的標準[5]，TNM Ⅰ期20例為Ⅰ組、TNM Ⅱ期22例為Ⅱ組，TNM Ⅲ期19為Ⅲ組、TNM Ⅳ期19例為Ⅳ期，同期隨機選擇肺部為良性疾病肺組織100例作為對照組，患者家屬均知情，依從性良好并簽署化療知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 治療:試驗組患者化療30 min前均給予甲氧氯普胺與昂丹司瓊進行止吐治療,化療治療在第1天和第8天均給予吉西他濱(ELI LILLY AND COMPANY)1 000 mg/m2靜脈滴注,順鉑(齊魯制藥有限公司)75 mg/m2，給予吉西他濱靜滴后再給予順鉑滴注，分4～5 d靜脈滴注。21～28 d為1個療程，治療2個療程后評價療效；并按照世界衛生組織規定的評價標準評估患者的治療效果[6]。

1.2.2 試劑及儀器:Taq酶、dNTP和2×緩沖液購自廣州康遂生物科技有限公司；QIAamp DNA minikit DNA提取試劑盒購自北京中天經緯科技有限公司；總RNA提取試劑盒(TRIzol法)購自南京生興生物技術有限公司；實時熒光聚合酶鏈反應(RT-PCR)儀器采用上海宏石醫療科技有限公司SLAN-96P實時熒光PCR分析儀，嚴格按照說明書進行操作。

1.2.3 PCR引物序列:參照Tsuyoshi等[7]方法設計正反及探針義鏈，內參基因為β-actin均由FAM標記，由廣州中山大學達安基因有限公司合成，miRNA-34a引物序列，miRNA-29b引物序列。見圖1、2，表1。

圖1 miRNA-34a引物序列

圖2 miRNA-29b引物序列

引物名稱基因序列產物長度(bp)miRNA?34a 正義鏈P1：5’?TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGTTGTGAGTATTAGCTAAGGAAGCAATCAGCAAGTATACTGCCCT?3’141 反義鏈P2：5’?ACCGTCACAGAATCGACCAACAACACTCATAATCGATTCCTTCGTTAGTCGTTCATATGACGGGA?3’miRNA?29b 正義鏈P1：5’?CGACCAAAGTATACCACCAAATCTAAATTTATCACTAACAGATCGTGGTAAACTTTAGTCACAA?3’112 反義鏈P2：5’?GCTGGTTTCATATGGTGGTTTAGATTTAAATAGTGATTGTCTAGCACCATTTGAAATCAGTGTT?3＇β?actin 正義鏈P1：5’?ACCATGGATGATGATATCGCC?3’436 反義鏈P2：5’?GCCTTGCACATGCCGG?3’

1.3 RNA抽提 用胰酶消化液(由北京百奧萊博科技有限公司提供)消化各組份研究對象組織并收集細胞，吸取5×106細胞使用磷酸緩沖鹽溶液(PBS，南京森貝伽生物公司提供)清洗1次，加入1 ml TRIzol，靜置后加入 200 ml氯仿，混勻，離心。取上清液加入500 μl 預冷的異丙醇(由濟南德厚化工有限公司提供)沉淀RNA，再用預冷的75%乙醇(由上海勵致化工有限公司提供)洗2次，自然干燥后加入50 μl焦碳酸二乙酯(DEPC，由臨沂市利興化工有限公司提供)水，用SMA2000Thermo超微量分光光度計(由北京中科科方技術開發有限公司提供)定量。

1.4 PCR檢測 反應體系：2×緩沖液10.0 μl，10.0 μmol/L的引物P1 1.0 μl，10.0 μmol/L引物P2 1.0 μl，模板DNA 1.0 μl，ddH2O7.0 μl。PCR反應條件及循環：93℃變性2 min，95℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 1 min，35個循環，75℃延伸5min，基因分析采用上海宏石醫療科技有限公司SLAN-96P實時熒光PCR分析儀自帶的基因分析應用軟件及Gen Bank對比分析基因序列同源性，嚴格按照說明書進行操作及判定結果，結果表達量采用2-ΔΔCT表示[8]，再進行各組肺組織中miRNA-34a和miRNA-29b的基因表達水平的比較。

2 結果

2.1 2組患者的組織miRNA-34a和miRNA-29b表達比較 miRNA-34a在試驗組的組織表達水平高于對照組(P<0.05)；miRNA-29b在試驗組的組織表達水平低于對照組(P<0.05)。見表2。

組別miRNA?29bmiRNA?34a試驗組(n=80)0．86±0．246．68±2．63對照組(n=100)3．61±0．831．23±1．64t值25．7634．87P值<0．05<0．05

2.2 不同類型癌組織miRNA-34a和miRNA-29b表達比較 miRNA-34a在腺癌組與鱗癌組均有明顯高于其他型肺癌組(P<0.05)，在腺癌組中的表達高于鱗癌組(P<0.05)，miRNA-29b在腺癌組與鱗癌組均有顯低于其他型肺癌組(P<0.05)，在腺癌組組中的表達低于鱗癌組(P<0.05)，miRNA-34a和miRNA-29b在肺癌組織分級、TNM分期及淋巴結轉移呈密切相關性(P<0.05)。見表3～5。

組別miRNA?29bmiRNA?34a鱗癌組(n=30) 2．16±0．538．31±2．82腺癌組(n=35) 3．29±0．75?6．27±1．83?其他型肺癌(n=15)4．71±1．32?#4．22±1．31?#F值26．7434．84P值<0．05<0．05

注：與鱗癌組比較，*P<0.05；與腺癌組比較，#P<0.05

2.3 miRNA-34a和miRNA-29b表達與化療有效率比較 miRNA-34a高表達組患者化療有效率顯著低于低表達組患者(P<0.05)；miRNA-29b低表達組患者化療有效率顯著低于高表達組患者(P<0.05)。見表6。

組別miRNA?29bmiRNA?34aⅠ組(n=20)4．72±1．424．24±1．30Ⅱ組(n=22)3．49±1．21?6．54±1．82?Ⅲ組(n=19)3．56±0．72?#7．14±2．31?#Ⅳ組(n=19)2．74±0．42?#△8．93±2．86?#△F值26．9642．54P值<0．05<0．05

注：與Ⅰ組比較，*P<0.05；與Ⅱ組比較，#P<0.05;與Ⅲ組比較，△P<0.05

組別miRNA?29bmiRNA?34a轉移組(n=42) 2．91±0．637．51±3．31無轉移組(n=38)4．28±1．635．80±1．56t值29．6218．84P值<0．05<0．05

表6 miRNA-34a和miRNA-29b表達與NSCLC化療療效的關系 例(%)

2.4 miRNA-34a的表達和miRNA-29b基因表達的相關性 miRNA-34a和 miRNA-29b在NSCLC細胞中多異步表達，經Spearman等級相關性檢驗分析，結果表明原發性肺癌組織中miRNA-34a基因的表達和miRNA-29b基因的表達之間呈負相關(r=-0.79，P<0.01)。

3 討論

miRNAs是一個長度為21～25個核苷酸非編碼的小RNA大家族，miRNAs在細胞內具有多種重要的調節作用，它調節著人類1/3的基因，研究表明，許多miRNAs直接參與人類腫瘤(包括結腸癌、肝癌、乳腺癌和肺癌等)的形成，miRNAs在調節腫瘤相關基因表達的同時，其本身也具有癌基因或抑癌基因的特點[9]。約50%有注釋的人類miRNAs集中于基因組的脆性位點，隨著研究技術的不斷發展，越來越多新的miRNAs不斷被發現，其中某些miRNA-125b、miRNA-21、miRNA-31、miRNA-34、miRNA-29、miRNA-133和miRNA-294和miRNA-155-5p在大多數腫瘤中呈現高水平表達，并充當癌基因的角色[10]。miRNAs將來是腫瘤治療的一個非常有效的新靶點之一。miRNAs表達調控的機制十分復雜，主要表現在轉錄、轉錄后調控以及基因所在的位置，因此，研究miRNAs和NSCLC癌細胞相關表達是建立更好治療方法的關鍵，隨著NSCLC癌干細胞與對應的miRNAs表達譜的建立，將對NSCLC的預防與治療開辟出新的領域。

腫瘤的發生是一個多因素參與、多基因突變、多步驟、多階段進展的復雜事件；miRNA-29b是一種腫瘤抑制性miRNAs，通過調節多種靶基因參與腫瘤的發生發展及凋亡過程[11]，miRNA-34a與多種癌癥發生發展密切相關的miRNA[12]；本研究結果發現，miRNA-29b在NSCLC癌組織標本中低表達，miRNA-34a在NSCLC癌組織標本中高表達，miRNA-34a和 miRNA-29b在NSCLC細胞中多異步表達，臨床病理分析，NSCLC癌組織中miRNA-29b表達水平與瘤內微血管密度(MVD)呈負相關，NSCLC癌組織中miRNA-34a表達水平與MVD呈正相關，NSCLC癌組織中miRNA-34a表達水平與miRNA-29b表達水平呈負相關，miR-29b通過抑制血管內皮生長因子-A(VEGF-A)VEGF-A的表達而發揮抑癌作用[13]。我們研究結果發現，鱗癌患者miRNA-34a表達明顯高于腺癌患者，鱗癌患者miRNA-29b表達明顯低于腺癌患者，提示miRNA-34a水平隨疾病進展而升高，miRNA-29b水平隨疾病進展而下降，并且與其表達高低與患者的TNM分期及淋巴結轉移呈密切相關性，由此可見，miRNA-34a和miRNA-29b水平與腫瘤血管密度和惡性生物學行為明顯相關，miRNA-34a過高表達則可能提示腫瘤發生或預示腫瘤的不良轉歸，其機制可能是miRNA-34a高表達直接引起了肺癌細胞轉化，導致肺癌的發生；miRNA-34a是NSCLC的癌基因控制細胞分化促進腫瘤的發展，miRNA-34a 可促進肺癌細胞的浸潤及轉移。本研究結果又表明，miRNA-29b在NSCLC癌組織內的低表達，可促進NSCLC癌的發生發展，miRNA-29b表達水平越低，則預后越差，根據miRNA沉默基因表達的原理[14]，結合miRNA-29b在肺癌細胞中的低表達，推斷miRNA-29b是NSCLC的抑癌基因；miRNA-34a在NSCLC癌組織中高表達能促進腫瘤淋巴結轉移進而使臨床化療預后差，多項研究證實miRNA-29b及miRNA-34a與癌細胞的耐藥性相關[15]。miRNA-34a與miRNA-29b表達水平能成為反映肺癌生物學行為及侵襲性的重要指標，miRNA-34a與miRNA-29b是NSCLC診斷與預后判斷中最具潛力的新型生物標志物之一，通過檢miRNA-34a與miRNA-29b表達水平可以對肺癌預后效果進行一定的判斷，以更好的指導臨床治療。

綜上所述，miRNA-34a的基因表達在NSCLC中高表達，miRNA-29b的基因表達在NSCLC中低表達，它們表達水平有助于臨床分期組、織學分級和淋巴結轉移的判斷，并且miRNA-34a低表達或者miRNA-29b高表達的患者化療有效率高，是化療受益的指標之一。

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Expression and clinical significance of miRNA-34a and miRNA-29b in non-small cell lung cancer

ZHAOShucan*,ZHENGDingrong.

*DepartmentofInternalMedicine,CentralHospitalofShantouCity,Guangdong,Shantou515031,China

Objective To investigate the expression and clinical significance of miRNA-34a and miRNA-29b gene in non-small cell lung cancer (NSCLC),and to explore the correlation between the expressions and clinical features as well as chemotherapy efficacy in patients with NSCLC.Methods Eighty patients with NSCLC who were diagnosed definitely in our hospital were served as experimental group,at the same time, the other 100 patients with lung benign diseases were served as control group. The expression levels of miRNA-34a and miRNA-29b gene were detected by RT-PCR, moreover,the expressions of miRNA-34a and miRNA-29b gene as well as the therapeutic effects of chemotherapy were retrospectively analyzed.Results The expression levels of miRNA-34a in experimental group were significantly higher than those in control group (P<0.05),however, the expression levels of miRNA-29b in experimental group were significantly lower than those in control group (P<0.05). The expression levels of miRNA-34a in adenocarcinoma group and in squamous-cell carcinoma group were significantly higher than those in the other types of lung cancers (P<0.05).Moreover the expression levels of miRNA-34a in adenocarcinoma group were significantly higher than those in squamous-cell carcinoma group (P<0.05), however, the expression levels of miRNA-29b in adenocarcinoma group and in squamous-cell carcinoma group were significantly lower than those in the other types of lung cancers (P<0.05),furthermore,which in adenocarcinoma group were significantly lower than those in squamous-cell carcinoma group (P<0.05). The expressions of miRNA-34a and miRNA-29b were closely correlated with lung tissue grade,TNM stage and lymph node metastasis (P<0.05). The effective rates of chemotherapy in patients with high-expression of miRNA-34a were significantly lower than those of patients with low-expression of miRNA-34a (P<0.05), moreover, the effective rates of chemotherapy in patients with low-expression of miRNA-29b were significantly lower than those of patients with high-expression of miRNA-34a (P<0.05). Besides the expression of miRNA-34a in lung cancer tissues was negatively correlated with that of miRNA-29b (r=-0.79,P<0.01).Conclusion The high-expression of miRNA-34a exists in NSCLC,however,the low-expression of miRNA-29b exists in NSCLC,and their expression levels contribute to the clinical stage,histological grade and lymph node metastasis evaluation,moreover, the patients with low-expression of miRNA-34a and high-expression of miRNA-29b have higher effective rates of chemotherapy,which is regarded as one of the indexes of benefiting from chemotherapy.

non-small cell lung cancer; mRNAs; curative effect; miRNA-34a; miRNA-29b; clinical significance

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.16.008

515031 廣東省汕頭市中心醫院內科綜合病區(趙淑燦);廣東省深圳市寶安區中心醫院社區健康服務管理中心(鄭定容)

R 734.2

A

1002-7386(2017)16-2436-04

2017-01-10)