NK細胞在多發性骨髓瘤ASCT圍移植期的應用

劉媛媛, 鮑揚漪

(1.安徽省合肥市第一人民醫院血液科， 安徽 合肥 230031 2.暨南大學附屬江門中醫院， 廣東 江門 529000 3.廣東省深圳市漢科生物工程有限公司， 廣東 深圳 518000 4.廣東省廣州市珠江醫院血液科， 廣東 廣州 510280)

NK細胞在多發性骨髓瘤ASCT圍移植期的應用

劉媛媛1, 鮑揚漪2

(1.安徽省合肥市第一人民醫院血液科， 安徽 合肥 230031 2.暨南大學附屬江門中醫院， 廣東 江門 529000 3.廣東省深圳市漢科生物工程有限公司， 廣東 深圳 518000 4.廣東省廣州市珠江醫院血液科， 廣東 廣州 510280)

目的：本研究通過自體NK細胞在MMASCT圍移植期的應用，觀察該技術的安全性及有效性。方法：8例MM患者，其中男性7例，女性1例，年齡42～62歲，中位年齡51歲，移植前CR2例，PR6例。NK細胞培養方法：膜嵌合活性因子培養體系。預處理方案以標準的馬法蘭或白消安或氟達拉濱為主的方案。2例NK細胞于干細胞輸注后6～7d回輸，6例NK細胞作為移植預處理方案的一部分，在化療后48h、干細胞回輸前24～48h應用。干細胞輸注量：CD34+細胞數2.2～4.0×106/kg，單個核細胞數4.3～5.8×108/kg。NK細胞輸注量：16～160×106/kg。觀察其不良反應，血細胞恢復時間及療效。結果：8例患者中6例出現發熱，體溫38～39℃，臨床考慮肺部感染，1例出現口腔黏膜炎(Ⅱ級)，經抗感染對癥處理后緩解，無皮疹、腹瀉等其他不良反應。造血細胞恢復時間分別為：粒細胞(大于0.5×109/L連續3d)7～14d，中位時間9d，血小板(大于30×109/L連續3d)9～34d，中位時間11d。8例患者均順利完成ASCT。移植后3個月評價療效，3例CR，5例PR。8例患者均給予沙利度胺維持治療。隨訪時間3～29個月，中位隨訪時間11月，隨訪期間無死亡病例。結論：自體NK細胞在MMASCT圍移植期應用，無炎癥因子風暴效應出現，回輸安全，治療有效。擬擴大病例數進一步臨床研究，以觀察其長期的不良反應及療效。

NK細胞； 多發性骨髓瘤； 自體造血干細胞移植； 圍移植期； 安全性

在我國多發性骨髓瘤(Multiple myeloma/MM)發病率約1/10萬，呈現逐年上升趨勢[1～3]。近年來，多自體造血干細胞移植(ASCT)使多發性骨髓瘤(MM)治療取得了顯著進展。但由于移植物存在瘤細胞污染，且無移植物抗骨髓瘤效應，移植后復發仍是目前的主要問題。通過增加預處理方案中細胞毒藥物的劑量，雖然可減少殘余骨髓瘤細胞，但由于相關毒副作用及并發癥的發生，反而提增加了干細胞移植相關死亡率。因此迫切需要尋找新的，副作用小，又可以提高療效的預處理技術。正常人體免疫系統中，作為主要效應細胞的自然殺傷(naturalkiller/NK)細胞可以清除腫瘤細胞，同時還具有抗病毒等多種生物學作用。本研究將NK細胞加入MMASCT中，期望在不增加副作用的前提下，清除化療藥物未殺滅的骨髓瘤細胞，減少移植期間感染，從而提高ASCT治療MM的療效、減少復發率。2012年1月至2015年12月，我們對8例MM患者ASCT圍移植期聯合自體NK細胞的應用，觀察該技術的安全性及有效性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料:8例多發性骨髓瘤患者(multiple myeloma)MM患者入組，其中男性7例，女性1例，年齡42～62歲，中位年齡51歲，移植前CR2例，PR6例。免疫類型:IgG型3例，IgA型2例，IgD型1例，κ-輕鏈型2例。國際分期系統分期:Ⅰ期1例，Ⅱ期4例，Ⅲ期3例。均符合2001年WHO的多發性骨髓瘤診斷標準。

1.2 移植預處理及移植后治療預處理方案：8例均行誘導治療，2例患者完全緩解(Complete response，CR)；其余6例患者部分緩解(Partial response PR)。預處理方案：馬法蘭100～200mg/m2，白消安2.4g/kg連續2d，或氟達拉濱50mg連續3d，2例NK細胞于干細胞輸注后6～7d回輸，6例NK細胞作為移植預處理方案的一部分，在化療后48h、干細胞回輸前24～48h應用。干細胞輸注量：CD34+細胞數2.2～4.0×106/kg，單個核細胞數4.3～5.8×108/kg。NK細胞輸注量：16～160×106/kg。自體干細胞在采集前需給予受試者環磷酰胺(CY)4g/m2進行化療，待白細胞降至最低，采用重組人粒細胞集落刺激因子注射液300μg q12h進行動員，骨髓恢復造血后(白細胞在4×109L-1以上，且外周血單個核細胞PBMNC達到30%以上)，通過血細胞分離機采集外周造血干細胞(APBSC)，APBSC懸液中加入等量由血漿和二甲基亞砜組成的保護液，使二甲基亞砜終濃度為10%，采用程序降溫，于-196℃下置液氮保存；采集PBMNC細胞在(4.3～5.8)×108/kg范圍內，其中CD34陽性細胞約為(2.2～4.0)×106/kg。

1.3 自體NK制備與檢測：對所采集的PBMNC進行以下項目的檢定：①有核細胞計數:每療程成人體內采集的有核細胞個數約為4～10×109；②活性細胞比例應達到90%以上。應用BD流式細胞儀對NK細胞免疫表型進行檢測：CD3-、CD16+、CD56+等分子，CD56+CD3-≥80%；③內毒素≤5.0EU/m；④活性≥80%(K562靶細胞，E:T=20:1)。

1.4 NK細胞培養：收集患者外周血，分離單核細胞；以CD3+磁珠去除外周單核細胞中的CD3+T細胞；剩余細胞以表達IL-15的K562滋養細胞聯合IL-2進行體外擴增培養；培養過程第7d、14d、21d分別進行細胞計數、活性分析及NK細胞表型鑒定，同時收集上清及細胞做細胞因子及NK細胞殺傷能力檢測。

1.5 治療方法：患者接受以馬法蘭或白消安或福達拉濱為主預處理聯合NK細胞輸注進行自體造血干細胞的移植，結果以達到PR及以上者有效。治療前、后分別對骨髓細胞形態學、血常規與肝功腎功、免疫固定電泳及外周血清β2微球蛋白(β2-MG)進行定期檢查。療效標準參照IWMG 2014年MM新版療效標準，不良反應按NCI-CTCAE4.0標準進行判斷。

1.6 評估小組分別在治療前、治療后3個月兩個時間點，參照在腫瘤界受到學者普遍認可的體力狀況標準(performance status，PS)對受試者生活質量進行評價，分值與結果呈負相關，同時統計患者的血液學恢復正常的時間，并對不良反應事件實時記錄與分析。

1.7 實驗室指標分別在治療前、治療后3個月兩個時間點，對患者以下實驗室指標進行檢測：①骨髓瘤細胞百分比；②β2-MG含量；③外周血血清中M蛋白。

1.8 臨床療效參照2014年歐洲血液和骨髓移植協作組的制定標準，對所有患者接受治療后12個月的臨床療效進行評價，分級如下：①CR；②接近完全緩解(nearCR,nCR)；③PR；④輕微反應(MR)；⑤疾病進展(PD)；死亡。同時進行長期隨訪，并對所有受試者中位總生存期、中位無進展生存期進行實時記錄與整理。

表1 治療前后患者PS評分和免疫學指標±s)

注：☆與治療前比較P≤0.05

1.9 統計學處理：應用SPSS19.0軟件對所有研究數據進行分析，其中計量資料用均數標±準差或中位數(四分位數間距)描述，后比較采用配對t檢驗，符號秩和檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 NK細胞誘導前后對比：誘導后NK細胞表面CD3-CD16+、CD3-CD56+細胞的陽性率明顯增高，滿足過繼回輸治療的需要。

2.2 療效觀察:治療后，患者的PS評分、骨髓瘤細胞比和外周血M蛋白和治療前相比，均顯著下降，差異均有統計學意義(P<0.05)，β2-MG雖有較下降趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)結果見表1。造血細胞恢復時間分別為：粒細胞(大于0.5×109L-1連續3d)7～14d，中位時間9d，血小板(大于30×109L-1連續3d)9～34d，中位時間11d。8例患者均順利完成ASCT。移植后3個月評價療效，3例CR，5例PR。8例患者均給予沙利度胺維持治療。隨訪時間3～29個月，中位隨訪時間11月，隨訪期內無死亡病例。

表2 外周血單個核細胞、CD34+細胞回輸數量及ANC、PLT恢復時間

2.3 不良反應:8例患者中6例出現發熱，體溫38～39℃，臨床考慮肺部感染，1例出現口腔黏膜炎(Ⅱ級)，經抗感染對癥處理后緩解，無皮疹、腹瀉等其他不良反應。無出血性膀胱炎等，經過積極對癥處理后好轉。

3 討 論

在臨床上，多發性骨髓瘤是一種惡性的漿細胞或血管增生性的惡性血液系統疾病疾病[4]，多數在50～60歲左右發病，大約5%左右的患者會發展成漿細胞白血病[5]，目前，臨床以自體造血干細胞移植(AHSCT)作為治療MM的首選方案[6]。由于MM的特殊優勢，如其腫瘤細胞倍增時間耗時較長，且造血干細胞也易采集和動員等，使得AHSCT治療更為成熟[7,8]。據報道，歐洲接受AHSCT治療的MM患者已達1.5萬例以上[9]。國外學者也證實，相比于常規治療，MM患者尤其是年齡在65歲以下的中老年患者通過AHSCT治療后生存率更高[10,11]，同時也有報道AHSCT治療后患者移植后中位生存期為4.3年，復發后中位生存期為1.2年，明顯優于單純化療[12]。雖然AHSCT在療效與生存率上普遍得到臨床認可，但是通過治療后患者的生存曲線始終達不到平臺期，這成為困擾國內外學者的最大問題[13]。

近年來，雖然大劑量化療誘導緩解后再進行APBSCT的治療策略使MM的臨床療效得到了明顯提高，但是移植后MM殘留病灶和免疫失衡制約了MM的遠期臨床療效[14]。目前預處理方案的進展主要局限在細胞毒藥物的更新和已有藥物的劑量調整，而如何革新現有的誘導方案是實現MM療效質的突破的關鍵。

作為人體天然免疫的主要效應細胞以及三大類淋巴樣細胞之一，NK細胞具有抗病毒、清腫瘤等外來入侵物體的天然生物活性。NK細胞不需要預先接受刺激即可產生，即通過細胞毒作用和分泌細胞因子，識別各種病毒和腫瘤感染的細胞，來抵御感染和惡變細胞。經過活化的NK細胞可以同時分泌細胞因子及趨化因子，與此同時產生強大的細胞毒活性，并通過分泌顆粒達到對靶細胞的殺傷作用。

由于NK細胞具有抗感染、預防正常人體細胞惡性轉化等生物作用，使得國內外學者逐步將研究重點趨于其與造血干細胞移植之前的聯系上[15,16]。Krre[17]以NK細胞作為研究對象，對其在促進造血干細胞植入以及抗移植物抗白血病(GVL)效應等方面進行了詳細報道，不論安全性及療效均得到了肯定。而將NK細胞作為多發性骨髓瘤自體干細胞移植預處理技術的研究報道則未見。Harrison等[18]報道了隨著MM患者體內活化的NK細胞的增加，其對骨髓瘤細胞細胞毒作用也相應增強。Frohn等[17]研究同樣證實，由于骨髓瘤細胞上大量表達HLA-I分子，使得NK細胞更容易發揮其抗腫瘤作用，因而具有速效溶解MM細胞的作用。NK細胞有望成為腫瘤免疫治療的靶點。我們推測，細胞毒藥物一方面可以直接攻擊骨髓瘤細胞，另一方面可以使殘余骨髓瘤細胞的腫瘤抗原暴露，從而使其更容易被NK細胞識別與殺滅，并產生連續持久的免疫殺傷效應。同時NK細胞還可以殺滅輸入污染于自體造血干細胞中的骨髓瘤細胞，起到凈化移植物的作用。此外NK細胞還能夠通過細胞毒作用和分泌細胞因子來抵御移植期間的感染。因此，將NK細胞加入MM自體造血干細胞移植預處理方案中，在不增加副作用的前提下，可以清除細胞毒藥物未殺滅的骨髓瘤細胞，凈化移植物，減少移植期間感染的并發癥，從而提高自體造血干細胞移植治療MM的療效、減少復發率。

本研究開展NK細胞在多發性骨髓瘤自體造血干細胞圍移植期應用。結果顯示，聯合治療后，患者的生活質量(PS評分)、骨髓瘤細胞百分比、M蛋白較治療前降低，差異有統計學意義(P<0.05)，而β2微球蛋白也有改善的趨勢。8例患者ANC和Plt的恢復時間也優于常規治療，其總生存顯示了良好的趨勢。客觀數據初步顯示了NK在多發性骨髓瘤自體造血干細胞圍移植期應用的可行性。然而，由于本研究病例樣本數較少，NK細胞移植患者在無病進展生存期于總生存期、不良反應等方面還需更大樣本量的支持和更長時間的臨床研究進行觀察。本研究將繼續為MM的預處理方案作出有益探索。

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Application of NK cells in Transplantation of Multiple Myeloma ASCT

LIUYuanyuan，etal

(TheFirstPeople'sHospitalofHefei,AnhuiHefei230031,China)

Objective:To observe the safety and efficacy through the application of autologous NK cells in MMASCT transplantation. Methods: 8 cases of MM patients, including 7 males and 1 female, aged 42-62 years, the median age of 51 years, before transplantation CR2 cases, PR6 cases. NK cell culture method: Membrane chimeric activity factor culture system. The pretreatment program is based on the standard melphalan or Baihuaan or fludarabine-based regimen. Two of the NK cells were transfused 6-7 days after stem cell infusion, and six of the NK cells were used as part of the transplant pretreatment program, 48 hours after chemotherapy and 24 to 48 hours before the stem cell was returned. Stem cell infusion: CD34 + cells 2.2-4.0x10 ^ 6 / kg, mononuclear cells 4.3-5.8x10 ^ 8 / kg. NK cell infusion: 16-160 * 10 ^ 6 / kg. Observe the adverse reactions, blood cell recovery time and efficacy .Results: 8 cases of fever in 6 patients, body temperature 38-39 degrees, the clinical consideration of lung infection, 1 case of oral mucositis (grade II), anti-infection symptomatic treatment after remission, no rash, diarrhea and other adverse reactions The recovery time of hematopoietic cells were as follows: granulocyte (more than 0.5 * 10 ^ 9 / L continuous 3d) 7-14d, median time 9 days, platelet (greater than 30 * 10 ^ 9 / L continuous 3d) 9-34 days Bit time 11 days. 8 patients were successfully completed ASCT. 3 months after transplantation, 3 cases of CR, 5 cases of PR. Eight patients were given thalidomide maintenance therapy. The follow-up period was 3 to 29 months, with a median follow-up of 11 months and no deaths during follow-up. Conclusion: Autologous NK cells in the MMASCT transplantation during the application, no inflammatory factor storm effect occurs, return safety, the treatment is effective. To further expand the number of cases of clinical studies to observe its long-term adverse reactions and efficacy.

NK cells; Multiple myeloma; Autologous hematopoietic stem cell transplantation; Implant transplantation; Safety

1006-6233(2017)07-1139-05

合肥市自主創新項目，(編號：合政【2011】54號)

鮑揚漪, 曾志堅2, 吳建偉2, 車 速3, 張明杰3, 郭坤元4

A

10.3969/j.issn.1006-6233.2017.07.025