基于在線參數動態調控的雙酶法生產葡萄糖酸鈉新工藝

蘇立宇，趙偉，杭海峰*，儲炬*

1(華東理工大學，生物反應器工程國家重點實驗室，上海，200237) 2(山東福洋生物科技有限公司，山東 德州，253100)

基于在線參數動態調控的雙酶法生產葡萄糖酸鈉新工藝

蘇立宇1，趙偉2，杭海峰1*，儲炬1*

1(華東理工大學，生物反應器工程國家重點實驗室，上海，200237) 2(山東福洋生物科技有限公司，山東 德州，253100)

采用葡萄糖酸鈉生產過程中在線參數氧消耗速率(OUR)和溶氧(DO)作為調控參數，開發出階段性實時動態補加葡萄糖氧化酶的雙酶法生產葡萄糖酸鈉新型工藝，酶催化過程中葡萄糖氧化酶酶活始終不是限制因素。50 L反應器初始葡萄糖濃度在330 g/L條件下，能夠有效將生產時間從原始工藝的17.0 h縮短至11.6 h，得率由1.167(g/g)提高至1.176(g/g)，最終消耗的葡萄糖氧化酶的量也由2 100 U/g葡萄糖縮減到1 444 U/g葡萄糖。與生物發酵相比，改進后的酶法工藝也更具優越性，生產時間縮短了42.85%，得率提升了4.91%。改進后的雙酶法生產葡萄糖酸鈉新工藝具有更廣闊的市場應用前景。

葡萄糖氧化酶；葡萄糖酸鈉；在線參數；工藝優化

葡萄糖酸鈉(Sodium Gluconate, SG)是一種易溶于水，微溶于醇，不溶于醚的多羥基羧酸鈉[1]，它作為葡萄糖酸的重要衍生物之一，在建筑、醫藥、食品、化工等行業都發揮著的重要作用[2-5]?，F今葡萄糖酸鈉的生產方法大致可分為5類：多相催化氧化法、均相氧化法、電催化方法、生物發酵法和酶催化法[6-8]。現今工業上大批量生產葡萄糖酸鈉大多采用的是生物發酵法(主要以黑曲霉深層發酵為主)和雙酶法直接催化。生物發酵和雙酶法涉及的反應機理可簡化如圖1所示。

圖1 葡萄糖酸合成途徑Fig.1 Gluconic acid synthesis pathway

葡萄糖氧化酶催化葡萄糖脫氫生成1分子葡萄糖-δ-內酯和1分子過氧化氫。過氧化氫在過氧化氫酶作用下分解成水和氧氣，葡萄糖-δ-內酯則在內脂酶作用下或自發水解形成葡萄糖酸[9]。最后通過流加氫氧化鈉溶液調節pH，同時也生成葡萄糖酸鈉。

相比于黑曲霉生物發酵而言，雙酶法直接催化具有如下優勢：1.由于沒有了制備種子的時間，且酶促反應快速高效，可以顯著縮短生產所用時間。2.由于雙酶法沒有菌體生長，且副產物少，所以得率相對更高[10]。3.最終產品白度好、質量高且穩定[11]。但是雙酶法同時也存在以下的缺陷，導致了它還未大規模取代黑曲霉深層發酵成為葡萄糖酸鈉發酵的首選：1.酶法生產所用的關鍵酶，葡萄糖氧化酶的價格始終居高不下，這就導致了最終生產成本高于黑曲霉深層發酵。而成本因素在工業生產上是判斷一項工藝好壞的重要指標之一。2.由于酶本質上是蛋白質，不能夠進行高溫滅菌操作，所以染菌問題也是困擾雙酶法的問題之一。雙酶法不適宜進行多次帶放或者不滅罐的多次反應。

現階段采用酶法生產葡萄糖酸鈉的操作過程是在開始時向原料液內投加所有的葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶，中途不進行任何補料補加酶的舉措，等生產結束時進行放罐到下游分離提取葡萄糖酸鈉[12]。本研究以生產過程中在線攝氧率(Oxygen uptake rate，OUR)、溶氧(Dissolved oxygen, DO)的相關性變化為依據，研究并開發了階段性實時動態補加葡萄糖氧化酶的新型雙酶法生產葡萄糖酸鈉新工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究所用黑曲霉(Aspergillusniger)由山東福洋生物科技有限公司提供。

葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase, GOD)，過氧化氫酶(Catalase, CAT,)均為工業級液態粗酶液，購自諾維信(中國)有限公司。其中葡萄糖氧化酶酶活為6.5×105U/mL。

1.2 儀器與設備

本實驗采用上海國強生化裝備有限公司的15 L和50 L攪拌式生物反應器，同時配備有Omega公司的溫度電極和Mettler公司的溶氧及pH電極。發酵尾氣通過尾氣質譜儀(MAX300-LG，Extrel，USA)進行在線檢測。所有的數據處理及相關分析通過華東理工大學國家生化工程技術研究中心(上海)自行開發的上位機軟件包《發酵過程檢測系統BIORADR 2.0》完成。

1.3 培養基

菌種活化培養基(g/L)：葡萄糖60，尿素0.2，KH2PO40.13，MgSO40.15，玉米漿1.0，CaCO35.0，瓊脂1.0。

15 L種子培養基(g/L):葡萄糖250，KH2PO40.5，(NH4)2HPO41.8，MgSO40.19，玉米漿2.1。消泡劑0.2ml/L。

50 L發酵培養基(g/L):葡萄糖330，KH2PO40.17，(NH4)2HPO40.25，MgSO40.2。消泡劑0.2ml/L。

50 L酶法培養基(g/L)：葡萄糖330，消泡劑0.2 ml/L。

所有培養基在配制完成后用1 mol/L NaOH溶液將pH調節至pH7.0,115℃高溫滅菌20 min。

1.4 發酵方法

1.4.1 生物發酵

用50 mL無菌水洗下茄子瓶培養好的黑曲霉孢子斜面，接種到含有9 L培養基的15 L發酵罐中，發酵18 h。過程中通氣比、攪拌轉速、溫度、罐壓分別控制在0.8 vvm，500 r/min, 38 ℃, 0.1 MPa，pH通過流加7.5 mol/L NaOH溶液維持在pH5.8。

在種子培養18.0 h之后，將4.5 L的種子培養液轉接到含有30.0 L新鮮培養基的50 L發酵罐中，維持通氣量、攪拌轉速、溫度、罐壓分別在1.2 vvm，550 r/min，38.0 ℃，0.1 MPa，pH通過流加7.5 mol/L NaOH溶液維持在pH5.2。當發酵液中檢測出的殘余葡萄糖濃度低于10.0 g/L時，發酵結束。

1.4.2 原工藝雙酶法生產

50 L發酵罐工作體積30 L，初始葡萄糖濃度控制在330 g/L。初期加入9.25×106U過氧化氫酶粗酶液(950 U/g葡萄糖)，2.02×107U葡萄糖氧化酶粗酶液(2100 U/g葡萄糖)，過程中不再補入酶液。過程中控制條件與生物發酵法相同。

1.4.3 根據在線參數變化趨勢實時階段性補入酶液的雙酶法工藝

50 L發酵罐工作體積30 L，初始葡萄糖濃度控制在330 g/L。發酵初期加入1.11×107U過氧化氫酶粗酶液之后過程中不再補加，再加入7.8×106U葡萄糖氧化酶粗酶液，過程中出現OUR下降，DO上升時，及時補加6.5×105U葡萄糖氧化酶酶液。其他的控制條件與初始酶法發酵相同。

1.5 分析檢測方法

1.5.1 葡萄糖濃度檢測

取發酵液過濾所得清液，稀釋到適當濃度，用試劑盒對殘糖含量進行測定[13]。

1.5.2 葡萄糖酸鈉(SG)濃度檢測

SG濃度通過高效液相色譜(HPLC)法測定。具體測定條件為：色譜分離柱為C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm) ；流動相V(甲醇)∶V(磷酸)=1∶1(10%甲醇，2.4%磷酸);檢測波長為210 nm；流速為1 mL/min；柱溫為26 ℃；進樣量為20 μL[14]。

1.5.3 葡萄糖氧化酶酶活檢測

在反應試管中依次加入2.4 mL 0.21 mol/L的鄰聯茴香胺，0.5 mL 0.1%的葡萄糖溶液以及0.1 mL 0.1 mg/mL的辣根過氧化物酶。待溶液充分混勻之后，放置于35 ℃恒溫水浴鍋內加熱保溫5 min。測樣時取提前預熱的0.1 mL 待測樣品加入到保溫試管內，迅速混勻后倒入比色皿中。每隔30 s記錄下紫外分光光度計A500 nm下的吸光度數值。最后用吸光度對時間作圖，找出其斜率ΔA/min。根據公式(1)計算葡萄糖氧化酶的酶活。

定義葡萄糖氧化酶在1 h內催化生成1 μL氧氣為1個酶活單位(U)。

葡萄糖氧化酶活性(U·mL-1)=

(1)

其中，7.5為氧化型鄰聯茴香胺的消光系數。ΔA/min為吸光度對時間作圖所得斜率。

1.6 二氧化碳消耗速率CER和攝氧率OUR的檢測及呼吸商RQ的計算

在線生理參數CER、OUR通過過程質譜儀對發酵尾氣進行檢測，并由BioStar軟件依據公式(2)、(3)、(4)進行計算[15]：

(2)

(3)

(4)

上述方程中，Fin為進氣的流量,mmol/L;V為發酵罐的體積，L;CCO2in為進氣中氧氣濃度(20.95%);CO2in是進氣中二氧化碳的濃度(0.03%);Cinertin是進氣中惰性氣體氮氣的濃度;CO2out為尾氣中氧氣濃度;CCO2out為尾氣中二氧化碳的濃度;Tin是溫度;h是尾氣的濕度;Pin是進氣的壓力。

2 結果分析

2.1 黑曲霉深層分批發酵法生產SG

常規的SG發酵工藝以黑曲霉作為生產菌株。經過多次參數優化后黑曲霉深層發酵生產SG的過程如圖2所示。整個發酵過程持續20.5 h 左右。在發酵初期，CER、OUR隨著菌體生長逐漸升高，DO也在這一階段快速下降，前期限制反應速度的因素可能是菌體濃度。菌體量不夠導致了無法合成足量的發酵過程所需要的3種關鍵酶葡萄糖氧化酶(GOD)、過氧化氫酶(CAT)和內脂酶(LAC)。氧氣在黑曲霉深層發酵中主要有兩個去處，參與呼吸作用和生成產物SG。在呼吸作用中，1分子葡萄糖經呼吸鏈徹底氧化需要6分子氧氣，同時生成6分子二氧化碳。所以菌體呼吸作用耗氧速率在數值上應該與二氧化碳生成速率相等。在圖2發酵過程初期，與CER相比OUR數值始終較高，說明此時氧氣除了用作菌體呼吸之外，也已經開始參與產物SG的合成[16]。而合成所需要的3種酶，GOD，LAC和LAC在種子罐階段就已經開始合成并糖基化附著在黑曲霉菌體細胞壁上[17],隨著種子液進入發酵罐直接開始利用葡萄糖進行發酵生產。當發酵進行到5 h左右，CER開始出現回落，但是OUR和DO并未受到影響依舊分別持續上升和下降，說明原先用于菌體呼吸的那部分氧氣此時已經被用來生成SG。當DO跌落到30%左右時，此時OUR也達到了整個過程中的最大值不再上升，說明DO可能已經達到了臨界氧濃度。同時可以看出，在高的OUR條件下葡萄糖濃度下降很快，而SG濃度也提升迅速。基于以上實驗結果，可以得出以下結論：當菌體量足夠可以合成過量的3種關鍵酶GOD，CAT和LAC，限制反應的因素就是設備的供氧能力OTR。任何能夠提高OTR水平的操作都能夠增加產物的合成[18]。最終整個發酵過程在初始葡萄糖330 g/L濃度下轉化生成了327.7 g/L SG，最大OUR達到了54.53 mmol/(L·h)，平均耗糖速率16.1 g/(L·h)，平均SG成速率15.9 g/(L·h),得率為 1.141(g/g)。

圖2 黑曲霉深層發酵生產葡萄糖酸鈉參數圖Fig.2 Time course of on-line and off-line data of the SG fermentations process by Aspergillus niger

2.2 原始雙酶法(GOD和CAT)生產SG

由于SG的生產過程本質上就胞外酶促反應，所以為直接利用葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶進行生產SG提供了可能。按照所用酶使用說明，初始雙酶法工藝保證在初期投加完所有酶液之后，能消耗完反應器內所有的葡萄糖，同時在反應結束時，關鍵的葡萄糖氧化酶的酶活也接近于零。反應初期，在50 L的發酵體系內初期一次性加入2.02×107U的葡萄糖氧化酶粗酶液和9.25×106U過氧化氫酶粗酶液，反應過程中不再補加任何粗酶液。整個生產過程中參數變化如圖3所示。由于過程中過氧化氫酶量始終處于過量的狀態，所以在整個過程中過氧化氫酶始終不是限制反應的因素。整個生產周期約為17.0 h，較圖2過程縮短了3.0 h。

與黑曲霉深層發酵生產SG不同，利用雙酶法生產SG不需要利用任何菌體。在反應初期加入過量的2種粗酶液之后，發酵液中所測得的酶活達到了過程的最大值，約為6 800.0 U/mL。同時OUR也升至72.7 mmol/L/h。在高的OUR條件下，反應器內底物葡萄糖快速消耗，分解成葡萄糖內酯并水解成葡萄糖酸。相應地，由于OUR數值很高，所以DO降到了整個過程的最低點，約在20.0%左右?？梢宰⒁獾降氖牵c圖2黑曲霉深層發酵過程相比，雙酶法所能達到的DO的最低值更小(20.0%比30.0%)，最大OUR更高(72.7 mmol/(L·h)比55.1 mmol/(L·h))，表明直接利用雙酶法生產葡萄糖酸鈉的臨界氧濃度更低，過程中的OTR與黑曲霉深層發酵相比更高。這可能是由于直接加入反應體系內的酶蛋白在發酵液中均勻分散，而且它們直接與發酵液中的氧氣接觸，這大大提升了液固兩相的接觸面積，從而提高了過程的OTR水平[19]。

圖3 原始雙酶法(GOD和CAT)生產葡萄糖酸鈉參數圖Fig.3 Time course of comparative data of initial SG production using enzymes of GOD and CAT

如圖3所示，在初期一次性加入生產所需的全部粗酶液之后，DO、OUR和酶活均達到了整個過程的最值。隨著時間的推移，酶活水平不斷降低，當酶活下降到2 500.0 U/mL至3 000.0 U/mL范圍時，OUR開始逐漸下降，DO也逐步回升。這說明在此時的反應條件下，葡萄糖氧化酶的酶量已經開始成為了此時反應的限制性因素。而且從圖3看出，當酶活成為限制性因素之后，底物葡萄糖的消耗速率以及產物SG的合成速率均有所放緩。以上幾點說明，在反應初期一次性投加的葡萄糖氧化酶的酶量是過量的，大部分酶因為氧氣限制并沒有參與反應但是隨著時間推移酶活也逐步降低，這就不可避免地造成了葡萄糖氧化酶的浪費。而酶活與OUR和DO存在一定的相互對應關系，所以提出以在線參數OUR和DO為參考標準的過程補加葡萄糖氧化酶粗酶液的雙酶法生產新工藝。

2.3 利用在線參數階段性加入葡萄糖氧化酶生產SG的雙酶法新工藝

在圖3所示的原始雙酶法生產SG過程中，反應初期一次性投加所有的葡萄糖氧化酶，過程中前期葡萄糖氧化酶是過量的，隨時間推移酶活逐漸降低，當酶活降低到一定程度時葡萄糖氧化酶的酶活會成為限制酶反應的因素。此時OUR出現回落，DO開始逐步上升。基于此點，開發了以在線參數OUR和DO為調控指標的階段性加入葡萄糖氧化酶的雙酶法生產SG的新工藝。由于現在市場過氧化氫酶價格低廉，所以在反應初期一次性加入過量的過氧化氫酶，保證在整個生產過程中過氧化氫酶不會成為反應的限制因素。而初期選擇加入適量的葡萄糖氧化酶，保證在當前操作參數條件下加入葡萄糖氧化酶的量能夠使OUR升至的最高點，DO跌至最低點。這時候限制反應的條件是OTR而非葡萄糖氧化酶的酶量。隨著生產的進行葡萄糖氧化酶逐漸失活，OUR回落而DO上升，此時表明葡萄糖氧化酶酶活成為了反應的限制條件，此時應及時補加適量的葡萄糖氧化酶，來保證在當前設備所能提供的最大OTR條件下，最大限度達到高的OUR。

在圖3中明顯看出酶活低于2 500 U/mL時OUR開始明顯下降，那么只要將初始酶活保持在3 000 U/mL左右就不會出現酶量限制。因此反應初期一次性添加GOD酶液7.8×106U，使初期酶活達到3 000 U/mL左右。此時可保證反應一開始便是處于供氧限制。在生產過程中出現DO逐步回升、OUR開始下降時，補充6.5×105U葡萄糖氧化酶至反應器中，隨后OUR和DO快速響應，恢復至與初期相當的水平。完整生產過程如圖4所示。

圖4 利用在線參數階段性加入GOD的葡萄糖酸鈉生產過程Fig.4 Enzyme reaction for SG production bystepwiseaddition of GOD solution based on on-line parameters

整個反應過程中OUR始終維持在70.0 mmol/(L·h)左右，DO也穩定在20.0%上下，酶活水平始終高于2 500 U/mL?？梢哉J為在這種操作模式下，SG始終是以當前設備供氧條件下最大的速率合成。最終整個生產過程持續12.0 h。且過程中所添加了葡萄糖氧化酶的量由原先酶法的2 100 U/g葡萄糖縮減到1 444 U/g葡萄糖，減少了31.2%。顯然，改進后的雙酶法生產工藝較之前的原始工藝更具優勢。同時，此新工藝也已經成功推廣到了工業規模，最終效果與上述結果相差無幾，與生物發酵和原始酶法相比，縮短了發酵時間，提高了最終SG的得率。

2.4 生物發酵、原始雙酶法和改進雙酶法生產SG結果對比

3種不同的生產工藝對比如表1所示。新工藝雙酶法相較于原工藝雙酶法和生物發酵法，優勢巨大。生產時間降低至(11.6±0.5) h，而原工藝酶法生產和生物發酵分別需要(17±0.5) h和(20.3±0.4) h，對比生產時間分別降低了31.67%和42.85%。雙酶法生產中葡萄糖氧化酶均勻分撒在發酵液中，提高了液固之間傳質的面積，從而提高了反應過程的OTR水平，使最大OUR能夠達到72.70 mmol/(L·h)左右，而相比之下生物發酵法最大OUR只能夠達到55.12 mmol/(L·h)，比雙酶法低了24.18%。新工藝雙酶法由于始終處于操作參數條件下最大的反應速率，因此耗糖速率和產物生成速率均是3者中最高。值得注意的是，雖然2種雙酶法工藝OUR峰值基本相同，但是原先工藝初期所添加的葡萄糖氧化酶是過量的，在初始葡萄糖濃度330 g/L條件下，通過合理調節過程中葡萄糖氧化酶的添加量添加時間，所需的葡萄糖氧化酶的量由原先的2 100 U/g葡萄糖縮減到1 444 U/g葡萄糖，用量減少了31.2%。由于生物發酵法中葡萄糖不僅作為底物生成葡萄糖酸，而且還要被菌體利用維持自身基本的生理代謝，所以最終得率較原始雙酶法和新工藝雙酶法，分別低了3.94%和4.68%。

表1 不同工藝計算的參數對比

注：發酵液的體積變化已經計算在內。

3 討論

本文主要研究了利用在線參數OUR和DO的相關性變化，在生產過程中實時階段性加入葡萄糖氧化酶生產葡萄糖酸鈉的雙酶法新工藝。新工藝避免了初期過多的葡萄糖氧化酶的浪費，階段性地補加酶液也使整個過程酶活始終不受限，在過程中始終維持了穩定快速的耗糖速率。在50L體系初始葡萄糖濃度為330 g/L條件下，生產時間由原先酶法的17±0.5h縮短到(11.6±0.5) h，縮短了31.76%。添加葡萄糖氧化酶酶量也能由2 100 U/g葡萄糖縮減到1 444 U/g葡萄糖。過程中耗糖速率、SG生成速率和得率分別為28.55±0.70 g/(L·h)、30.66 g/(L·h)和1.176±0.009 (g/g),較原先工藝分別提高了48.31%、52.08%和0.77%。而與生物發酵相比，新工藝酶法也更有優勢。整個生產時間縮短42.85%，過程中耗糖速率、SG生成速率和得率分別提高了78.55%、92.59%和4.91%。

雙酶法生產SG的可行性已經得到驗證，較之原生的生物發酵更具有應用前景。同時利用在線參數的相關性變化，實現了對整個生產過程實時理性的控制優化。但是現今酶液價格居高不下，成為雙酶法應用到大規模工業生產中的最大障礙。生產過程階段改善葡萄糖氧化酶的添加量和添加時間只是雙酶法工藝優化中的一個方面，而過程中葡萄糖氧化酶的失活機理是一個值得關注的焦點，具有繼續探究的價值。

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A novel approach for sodium gluconate production using two-enzyme method by on-line parameter monitoring and dynamic regulation

SU Li-yu1, ZHAO Wei2, HANG Hai-feng1*, CHU Ju1*

1(State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China)2(Shandong Fuyang Biological Technology Company, Dezhou 253100, China)

In this paper, much attention was paid on the on-line parameters oxygen uptake rate (OUR) and dissolved oxygen (DO) monitoring and control. Based on the changing trends of these parameters, a novel approach of sodium gluconate production was proposed by stepwise addition of glucose oxidase solution dynamically, and the activity of glucose oxidase was kept at an unlimited level during the whole production period. The results showed that in the 50 L reactor with 330 g/L initial glucose concentration, the production time was shortened form 17.0 h to 11.6 h, the yield was enhanced from 1.167 g/g to 1.176 g/g and the overall dosage of used glucose oxidase declined from 2 100 U/g glucose to 1 444 U/g glucose respectively. Compared to the biological fermentation, the novel direct enzymatic reaction displayed significant advantages. The production time was cut down by 42.85% and the yield was 4.91% higher than the traditional biological fermentation. The improved direct enzymatic production had more potential value in the further industrial application.

glucose oxidase; sodium gluconate; on-line parameters; process optimization

碩士研究生(杭海峰、儲炬為通訊作者,E-mail:hanghaifeng@ecust.edu.cn;juchu@eucst.edu.cn)。

國家重點基礎研究發展計劃(2013CB733600)；國家高技術研究發展計劃(2015AA021005)

2016-12-28，改回日期：2017-02-04

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201706004