地衣芽胞桿菌堿性蛋白酶嗜堿突變體的特征分析

黃磊，董自星，金鵬，王正祥，路福平*

1(天津科技大學 生物工程學院，工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津，300457)2(天津科技大學 化工與材料學院，生物化工系，天津，300457)

地衣芽胞桿菌堿性蛋白酶嗜堿突變體的特征分析

黃磊1，董自星2*，金鵬2，王正祥2，路福平1*

1(天津科技大學 生物工程學院，工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津，300457)2(天津科技大學 化工與材料學院，生物化工系，天津，300457)

地衣芽胞桿菌堿性蛋白酶是工業上重要的蛋白酶類，進一步提高其在堿性條件下的活力可改善其在洗滌劑工業方面的應用價值。該研究通過篩選獲得一種在堿性條件下酶活水平顯著提高的地衣芽胞桿菌B186來源的蛋白酶，并在枯草芽胞桿菌WB600中對其編碼基因進行了成功克隆與表達，獲得了重組菌WB600 (pHY-E209)。然后通過離子交換色譜和凝膠層析法，從重組菌的發酵液中純化獲得了重組堿性蛋白酶AprE209。對酶學性質的研究表明，重組酶AprE209的最適作用pH為11.0，最適作用溫度為50 ℃，在30～37 ℃下和pH 12.0時仍具有很高的活力。進一步通過生物信息學的手段對其耐堿機制進行了初步解析。該嗜堿突變體具有進一步用于洗滌劑的潛在研究價值。

蛋白酶；嗜堿性突變體；洗滌劑行業；酶學特征

堿性蛋白酶是指在pH偏堿性范圍內水解蛋白質肽鍵的一大酶類，是工業酶制劑中使用量最大的酶制劑之一，它在皮革、造紙、洗滌、化妝品、動物飼料等領域具有重要應用[1]。地衣芽胞桿菌堿性蛋白酶是工業上重要的蛋白酶，其中最具代表性的是地衣芽胞桿菌2709生產菌株生產的堿性蛋白酶(2709堿性蛋白酶)，它是我國最重要的堿性蛋白酶來源[2]。2709堿性蛋白酶的全部編碼序列長度為1140 bp，其中，信號肽、前導肽以及成熟肽的序列長度分別為87、228和825 bp，它是典型的Subtilisin Carlsberg類蛋白酶[3]。

地衣芽胞桿菌堿性蛋白酶曾經被成功應用于我國洗滌劑工業[2]。但其最適作用pH在9.5～10.0左右[4]，而國際上現階段則采用最適作用pH可以達到10.5～12.0或以上、其他細菌來源的堿性蛋白酶應用于洗滌劑工業[5]。與此同時，在相對較低溫度保持較高的酶活力，也是洗滌劑工業應用中需要考慮的因素[6]。TINDBAEK等[7]和SIDDIQUI等[8]通過對枯草桿菌蛋白酶(subtilisins)進行分子改造，成功獲得了適冷的堿性蛋白酶。除了對現有的蛋白酶進行分子改造，從嗜堿和適冷微生物中篩選新的蛋白酶也是目前研究的熱點之一[5]。

本研究通過對地衣芽胞桿菌分離菌株保藏物所產堿性蛋白酶的最適作用pH進行初篩，獲得1株能夠在更高堿性條件下保持較高蛋白酶活性的菌株；并對其堿性蛋白酶進行了分子克隆與表達、生化特征分析以及耐堿機制的初步解析。研究結果可為新型堿性蛋白酶的研制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 菌株、質粒及培養基

大腸桿菌(EscherichiacoliJM109)、枯草芽胞桿菌(BacillussubtilisWB600)和表達載體pHY-WZX[9]由本實驗室保藏。地衣芽胞桿菌分離菌株保藏物由中國高校工業微生物資源與信息中心(http://cicim-cu.jiangnan.edu.cn)提供。克隆載體T-Vector pMD19 (simple)購于寶生物工程(大連)有限公司。

微生物的常規培養采用LB培養基，加入2%瓊脂為固體培養基。必要時，添加100 μg/mL的氨芐青霉素或20 μg/mL卡那霉素。篩選培養基：以LB培養基為基礎，使用前添加5%的無菌脫脂牛奶和終質量濃度為20 μg/mL的卡那霉素。發酵培養基(g/L)：乳糖 40，玉米漿 30，豆餅粉 30，硫酸銨 5，pH 7.0。

1.2 主要試劑

LATaqDNA Polymerase和T4DNA ligase等為寶生物工程(大連)有限公司產品。質粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒等購于OMEGA Bio-Tek公司。蛋白分子量標準、限制性內切酶等由Thermo Fisher Scientific公司提供。2709堿性蛋白酶(20萬 U/g)購于天津諾奧科技有限公司。牛血清白蛋白V部分、氨芐青霉素、硫酸卡那霉素和引物等由生工生物工程(上海)股份有限公司提供；其他試劑均為國產分析純。

1.3 嗜堿性蛋白酶的篩選

將工業微生物菌種資源庫中的地衣芽胞桿菌保藏物(共350株)在LB固體培養基平板上進行三區劃線，37 ℃培養過夜。第2天，從平板上挑取單菌落并接種至含有20 mL LB液體培養基的250 mL三角瓶中，37 ℃、230 r/min培養12 h。然后按2%(v/v)的接種量接種至裝有50 mL發酵培養基的500 mL三角瓶中，于37 ℃和230 r/min下培養72 h。發酵結束后，離心(8 000 r/min，10 min)收集上清。按照1.4小節的酶活測定方法，在不同pH下進行酶活測定。

1.4 堿性蛋白酶酶活力的測定

蛋白酶酶活力測定使用福林法[10]。其基本步驟為：取1 mL酶液至1 mL 1%(w/v)酪蛋白溶液中，在40 ℃和pH 10.5條件下作用10 min后，加入等體積的0.4 mol/L三氯乙酸終止反應，在反應溫度下顯色20 min，并于680 nm處測OD值。1個蛋白酶的酶活力單位定義為：在40 ℃和pH 10.5條件下，1 min水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸所需的酶量，以U/mL表示。

蛋白質含量的測定參照Bradford法[11]，以牛血清白蛋白V部分為標準參照品。

1.5 嗜堿性蛋白酶的克隆與表達

1.5.1 嗜堿性蛋白酶基因的克隆

PCR產物和質粒的純化、酶切、連接、轉化以及轉化子的篩選等均按照實驗室常規方法進行[12]，使用試劑盒時按照試劑盒說明書進行。以篩選得到的地衣芽胞桿菌基因組DNA為模板，采用引物aprE-BL1(5’-AGCTCTAGAGCTCAGCCGGCGAAAAATG-3’)和aprE-BL2(5’-GGGTTATTGAGCGGCAGCTTCGACAT-3’)PCR擴增(下劃線部分為人工設計XbaI位點)。PCR反應條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 45 s，68 ℃ 1 min，30個循環；68 ℃ 10 min。將PCR產物連接到載體T-Vector pMD19 (simple)上，并轉化到大腸桿菌JM109中。通過藍白斑篩選陽性克隆，提取重組質粒酶切驗證后，采用雙脫氧核苷鏈終止法進行核苷酸序列測定[13]。

1.5.2 重組菌的構建

將PCR擴增獲得的堿性蛋白酶基因用XbaI進行酶切，并與經XbaI和SmaI酶切的載體pHY-WZX連接。然后采用更改的Spizizen方法[14]將連接產物轉化到枯草桿菌WB600中，利用篩選培養基篩選陽性重組菌。進一步通過限制性酶酶切驗證重組質粒的正確性。

1.5.3 嗜堿蛋白酶突變體的發酵制備

將重組菌接種于含20 μg/mL卡那霉素的50 mL LB液體培養基中。于37 ℃、220 r/min過夜培養后，取10 OD600nm菌體接種于50 mL發酵培養基中培養3～5 d，每隔24 h取樣進行酶活測定。發酵結束后，離心(4 ℃，8 000 r/min)取上清，經真空冷凍干燥后，于-20 ℃保藏備用。

1.6 重組堿性蛋白酶的分離純化與SDS-PAGE分析

將2709堿性蛋白酶(AprE2709)的分離純化方法[15]進行適當修飾后用于重組酶AprE209的純化，即采用鹽析(30%～60%硫酸銨)、透析、Mono Q 5/50 GL陰離子交換色譜和Sephadex G-75凝膠層析法對AprE209進行純化。通過酶活測定和SDS-PAGE分析蛋白的純化情況。SDS-PAGE參照文獻[16]進行，采用5%的濃縮膠，12%的分離膠。

1.7 酶學性質的分析與比較

1.7.1 最適反應pH和pH穩定性的測定

最適反應pH的測定：分別配制0.5 mol/L的乳酸-乳酸鈉緩沖液(pH 4.0、5.0和6.0)、檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH 7.0和8.0)和硼酸緩沖液(pH值分別為9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5和12.0)。分別用不同pH的緩沖液將酶粉進行適當稀釋，并用該緩沖液配制1%(w/v)的酪蛋白溶液。在50 ℃條件下，測定酶樣在不同pH值下的酶活，酶活數值最大者計為100%。

pH穩定性的確定：在上述不同pH值的緩沖液里和50 ℃恒溫水浴下保溫60 min，取出酶樣，調整pH至10.5，按照上述酶法測定方法在pH 10.5和50 ℃下進行酶活測定，以未經過上述不同pH下孵育的酶樣本酶活為100%進行計算。

1.7.2 最適反應溫度和熱穩定性的測定

最適反應溫度的確定：在最適pH條件下，分別測定酶樣在30、35、37、40、45、50、55和60 ℃下的酶活力，以酶活最高者計為100%。

熱穩定性的測定：首先將酶樣置于不同溫度下保溫不同時間，每隔30 min取樣，按照1.4的方法測定其酶活，以未經水浴處理的酶活為100%。

1.7.3 金屬離子和螯合劑對酶活的影響

在酶活測定反應體系中，分別加入終濃度為5 mmol/L或10 mmol/L的K+、Ca2+、Mg2+、Zn2 +、Mn2+、Co2+、Cu2 +、Fe3+和EDTA，然后按照1.4的方法進行酶活測定。以不加金屬離子和螯合劑的反應體系的酶活力為100%。

1.8 生物信息學分析

利用BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行核苷酸序列相似性比對，并采用Clustal X2和BioEdit 7.0.9對氨基酸序列進行比對與分析。然后通過在線軟件Swiss Model(http://swissmodel.expasy.org/)對嗜堿性蛋白酶和2709蛋白酶的3-D結構進行模擬，并利用軟件Discovery Studio 2.5對其進行分析和比較。疏水相互作用、二硫鍵及離子鍵由PIC在線服務器(http://pic.mbu.iisc.ernet.in/index.html)進行分析。

2 實驗結果

2.1 嗜堿性蛋白酶產生菌的篩選

對菌種庫中的350株地衣芽胞桿菌分離菌株的產蛋白酶的嗜堿性能進行篩選，在pH 11.0和pH 9.0酶活的比值(pH 11.0/pH 9.0)最高的10株菌的酶活測定結果匯總于表1。其中菌株B0209所產蛋白酶在pH 11.0下顯示較明顯的蛋白酶酶活，而且它在pH 11.0時的酶活是pH 9.0時酶活的1.25倍，高于其它菌株所產的蛋白酶。為此，選擇此菌株所產蛋白酶進行后續進一步研究。

表1 產堿性蛋白酶菌株的篩選

2.2 AprE209的分泌表達與分離純化

以上述篩選獲得的地衣芽胞桿菌B186的基因組DNA為模板，通過PCR擴增獲得蛋白酶編碼基因aprE209。進一步將aprE209克隆入表達質粒pHY-WZX，獲得重組表達質粒pHY-E209，將此重組表達質粒遺傳轉化入蛋白酶基因缺失的枯草桿菌WB600中，獲得重組菌WB600 (pHY-E209)。然后將重組菌進行搖瓶發酵，發酵結束后，發酵上清液中重組酶AprE209的酶活達到400 U/mL。再將發酵液中的AprE209凍干后，再經鹽析、透析、陰離子交換色譜和凝膠層析進行純化，并用SDS-PAGE分析純化效果，結果如圖1所示。由圖1可知，AprE209的分子量大小約為30 kDa，在SDS-PAGE中呈現為單一條帶，達到了電泳純。

M-蛋白分子量標準；1-純化獲得的AprE209圖1 SDS-PAGE分析重組酶AprE209的純化效果Fig.1 SDS-PAGE analysis of the purified recombinant enzyme AprE209

2.3 重組酶的酶學性質比較分析

2.3.1 最適反應pH

在不同pH反應條件下分析AprE209的酶活并與2709堿性蛋白酶進行比較，結果如圖2所示。AprE209在pH 11.0時表現出最高酶活，而2709堿性蛋白酶則在pH 10時呈現最高酶活力，二者的最適作用pH呈現顯著差異。AprE209在偏堿性的條件下仍具有較高酶活。

圖2 堿性蛋白酶AprE209和AprE2709的最適反應pHFig.2 pH optima of alkaline proteases AprE209 and AprE2709

2.3.2 pH穩定性

在不同pH條件下處理酶液，取樣恢復pH后分析此過程對酶活力的影響，結果見圖3。在pH 5.0～11.0范圍內，AprE209和2709堿性蛋白酶的穩定性皆很好，酶活保持率>80%。另外，我們也觀察到，AprE209在pH 12.0的條件下仍然具有很好的pH穩定性(殘留酶活>80%)，而2709堿性蛋白酶在此條件下的pH穩定性顯著變差。

2.3.3 最適反應溫度

分別在不同溫度下測定堿性蛋白酶AprE209的酶活并與2709堿性蛋白酶進行比較，結果見圖4。可以看出，AprE209和2709堿性蛋白酶的最適反應溫度存在差異性，AprE209的最適反應溫度為50 ℃，而2709堿性蛋白酶為55 ℃；在溫度下降到37 ℃時，兩者仍維持60%左右的酶活；在30 ℃范圍內仍保持有40 %左右的酶活。此外，在35～50 ℃范圍內，AprE209的相對酶活高于AprE2709。

圖4 堿性蛋白酶AprE209和AprE2709的最適溫度Fig.4 Optimum temperatures of alkaline proteases AprE209 and AprE2709

2.3.4 熱穩定性

將酶液在不同溫度下孵育90 min，定時取樣分析酶液的酶活，結果顯示， AprE209和2709堿性蛋白酶在耐熱性能上存在顯著差異(圖5)。AprE209在37 ℃時熱穩定性較好，90 min內相對酶活均保持在95%以上；45 ℃孵育30 min后，該堿性蛋白酶的相對酶活下降至50%左右，而當水浴60 min時，其殘余酶活僅剩30%左右。50 ℃孵育30 min時，殘留酶活小于10%(圖5a)。相對應地，2709堿性蛋白酶則具有更高的熱穩定性(圖5b)。熱不穩定的用途更多體現在酶發揮作用之后需要對殘余酶進行滅活。由此也表明，AprE209可能具有與2709堿性蛋白酶不同的應用溫度環境與應用領域。

a-AprE209;b-AprE2709圖5 堿性蛋白酶AprE209和AprE2709的熱穩定性Fig.5 Thermostability of alkaline proteases AprE209 and AprE2709

2.3.5 金屬離子對酶活的影響

在酶促反應體系中加入終濃度為5 mmol/L或10 mmol/L不同的金屬離子和EDTA，研究其對AprE209酶活的影響并與2709堿性蛋白酶進行比較，結果見表2。

表2 金屬離子對AprE209和2709堿性蛋白酶酶活的影響

表2中金屬離子對AprE209和2709堿性蛋白酶的影響具有一定的相似性，其中Ca2+、Zn2+對2種蛋白酶的酶活均沒有明顯影響；Mg2+對AprE209有一定的抑制作用，而對2709堿性蛋白酶無明顯影響；K+、Co+、Cu2+、Fe3+、EDTA對這2種蛋白酶均具有不同程度的抑制作用，且Cu2+的抑制作用非常顯著。Mn2+對AprE209和AprE2709的酶活具有顯著的激活作用。此外，這2種蛋白酶對EDTA均較為敏感。

2.4 重組酶AprE209耐堿機制的初步解析

為了初步解析嗜堿性蛋白酶AprE209的耐堿機制，將其核苷酸及其演繹的氨基酸序列與現在工業上使用的堿性蛋白酶2709(AprE2709)進行比對，結果如圖6所示。

圖6 AprE209和AprE2709的氨基酸序列比對Fig.6 Multiple sequence alignment of AprE209 and AprE2709

可以看出，AprE209前體與AprE2709的氨基酸序列相似度為98.29%。AprE209的氨基酸序列中有6個氨基酸殘基與蛋白酶2709存在差異，分別是Ile28、Ala124、Asn162、Pro204、Lys270和Ser287(圖6)。其中，Ile28位于蛋白酶的前肽序列中，會隨著AprE209前體的激活被切割掉[17]；而另外5個氨基酸位于成熟肽上，應該是該突變體酶AprE209的相關酶學特征發生變化的基礎。

a-AprE209; b-AprE2709；催化三聯體和發生突變的氨基酸殘基分別用黑色和深灰色標注；淺灰色標注的是其他氨基酸；虛線表示的氫鍵，數字表示的是距離圖7 突變的氨基酸殘基以及催化三聯體周圍的氫鍵作用Fig.7 Hydrogen-bonding network formed around mutated amino acids and catalytic triads

進一步對上述兩種堿性蛋白酶的三維結構進行模擬與分析，結果表明，在5個有差異的氨基酸殘基以及催化三聯體周圍，AprE209比AprE2709多了2個氫鍵(圖7)。接著采用PIC在線服務器對AprE209和AprE2709的分子間作用力(包括離子鍵、二硫鍵及疏水相互作用等)進行了分析，發現二者的離子鍵和二硫鍵沒有差異，但是AprE209比AprE2709多了兩對疏水相互作用力。

3 討論

由于可以大大縮短洗滌時間，提高洗滌效率，堿性蛋白酶已經作為添加劑廣泛應用于洗滌劑行業。第一代商業化的洗滌劑用蛋白酶主要是來源于地衣芽胞桿菌、解淀粉芽胞桿菌和史密斯芽胞桿菌液的堿性蛋白酶，其最適反應pH為9～10，如2709堿性蛋白酶、諾維信的Subtilisin Carlsberg以及Alcalase等[4]。由于這些堿性蛋白酶在洗滌衣物的環境中(pH 11.0)的酶活顯著下降，來源于嗜堿微生物的高堿性蛋白酶(最適反應pH大于10.5)成為第2代洗滌劑用蛋白酶[4]。而目前國內洗滌劑生產廠家采用的嗜堿性蛋白酶主要被國外企業壟斷。因此，獲得1株適用于工業化生產的嗜堿性蛋白酶的高產菌株，建立起具有我國自主知識產權的嗜堿性蛋白酶生產技術體系顯得非常必要和重要。

本研究通過菌株篩選以及基因的克隆與表達，獲得一個能在高堿性條件下保持較高活力的堿性蛋白酶嗜堿突變體AprE209。氨基酸序列比對的結果表明，該酶與2709堿性蛋白酶的氨基酸序列差異性僅為1.71%(圖6)，但二者的酶學特征卻有較大的差異。酶學性質的研究表明，AprE209的最適反應pH為11.0，高于2709堿性蛋白酶的最適反應pH(圖2)；并且，AprE209在pH 5.0～12.0的范圍內具有良好的穩定性，在pH 12.0的堿性條件下仍能保留80%以上的酶活，pH穩定性也優于2709堿性蛋白酶(圖3)。

分子間的相互作用力，如疏水相互作用、靜電相互作用以及氫鍵在穩定蛋白質結構及改變催化殘基的pKa值等方面發揮著重要的作用[18]。本文進一步通過生物信息學的研究發現，重組酶AprE209比AprE2709多了2對疏水相互作用力，這可能是其在堿性條件下仍具有良好的活性和穩定性的原因。嗜堿突變體AprE209中活性位點His139周圍比AprE2709多了1個氫鍵(圖7，His139與Asp135之間形成的氫鍵)，這可能也是其具有耐堿性的重要原因之一，因為絲氨酸蛋白酶對pH的依賴性與活性中心里組氨酸的pKa值有關[19]。此外，AprE209中Lys270比AprE2709的Glu270周圍多了2個氫鍵(圖7)，這也可能與其耐堿性有關。后續將通過定點突變，進一步確認這些氨基酸殘基在AprE209的耐堿性中發揮的作用。

此外，本研究獲得的AprE209在較低的溫度下(30～37 ℃)仍能保持相對較高的酶活，將它加入洗滌劑中清洗衣物時，不需要用40～60 ℃的熱水浸泡便能發揮其洗衣效力。這樣既避免了能源的浪費，也符合亞洲特別是發展中國家用自來水洗衣服的習慣，還將促進全球洗衣行業向著低溫、節水型發展。

綜上所述，本研究通過菌株篩選和分子克隆技術獲得了堿性蛋白酶嗜堿突變體AprE209，它在高堿性和低溫條件下能保持相對較高的活性，在洗滌劑、食品、化妝品以及水產飼料等行業具有潛在的應用價值。

[1] GUPTA R, BEG Q, LORENZ P. Bacterial alkaline proteases: molecular approaches and industrial applications[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2002, 59(1): 15-32.

[2] 孫倩. 高產堿性蛋白酶菌種的選育及發酵過程優化[D]. 鄭州：河南工業大學, 2012.

[3] 洪揚, 雷虹, 趙玉風, 等. 地衣芽孢桿菌2709堿性蛋白酶基因的克隆、序列測定及其表達[J]. 生物工程學報, 1994, 10(03): 271-276.

[4] FUJINAMI S, FUJISAWA M. Industrial applications of alkaliphiles and their enzymes——past, present and future[J]. Environmental Technology, 2010, 31(8-9): 845-856.

[5] LYLLOFF J E, HANSEN L B, JEPSEN M, et al. Genomic and exoproteomic analyses of cold- and alkaline-adapted bacteria reveal an abundance of secreted subtilisin-like proteases[J]. Microbial Biotechnology, 2016, 9(2): 245-256.

[6] SAEKI K, OZAKI K, KOBAYASHI T, et al. Detergent alkaline proteases: enzymatic properties, genes, and crystal structures[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2007, 103(6): 501-508.

[7] TINDBAEK N, SVENDSEN A, OESTERGAARD P R, et al. Engineering a substrate-specific cold-adapted subtilisin[J]. Protein Engineering, Design & Selection : PEDS, 2004, 17(2): 149-156.

[8] SIDDIQUI K S, PARKIN D M, CURMI P M, et al. A novel approach for enhancing the catalytic efficiency of a protease at low temperature: reduction in substrate inhibition by chemical modification[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2009, 103(4): 676-686.

[9] NIU Dan-dan, WANG Zheng-xiang. Development of a pair of bifunctional expression vectors forEscherichiacoliandBacilluslicheniformis[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2007, 34(5): 357-362.

[10] 中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會. GB/T 23527-2009蛋白酶制劑[S]. 北京: 中國標準出版社，2009.

[11] BRADFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry, 1976, 72: 248-254.

[12] 諸葛健, 王正祥. 工業微生物實驗技術手冊[M]. 北京: 中國輕工業出版社, 1994: 413-450.

[13] SANGER F, NICKLEN S, COULSON A R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1977, 74(12): 5463-5467.

[14] 夏雨. 枯草芽孢桿菌食品級表達系統的構建和分泌表達研究[D]. 無錫： 江南大學, 2007.

[15] 馬永強, 張浩, 楊春華, 等. 地衣芽孢桿菌2709蛋白酶分離純化研究[J]. 食品科學, 2010,31 (11): 141-146.

[16] 奧斯伯 F M, 金斯頓 R E, 塞德曼 J G, 等. 精編分子生物學實驗指南[M]. 北京: 科學出版社, 2008: 42-50.

[17] 令楨民. Streptomyces griseus胰蛋白酶的分子改造[D]. 無錫：江南大學, 2013.

[18] TIWARI M K, SINGH R K, SINGH R, et al. Role of conserved glycine in zinc-dependent medium chain dehydrogenase/reductase superfamily[J]. The Journal of Biological Chemistry, 2012, 287(23): 19 429-19 439.

[19] RUSSELL A J, FERSHT A R. Rational modification of enzyme catalysis by engineering surface charge[J]. Nature, 1987, 328(6 130): 496-500.

Biochemical characterization of alkalophilic mutant ofBacilluslicheniformisprotease

HUANG Lei1，DONG Zi-xing2*，JIN Peng2，WANG Zheng-xiang2，LU Fu-ping1*

1(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457,China)2(Department of Biochemical Engineering，College of Chemical Engineering and Materials Science，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457,China)

Alkaline protease fromBacilluslicheniformisis an important protease in the industry. Improving its activity and stability under alkaline pH conditions can broaden the range of applications in detergent industry. In this study, a high-alkaline protease fromB.licheniformisB186 was screened, and its encoding gene was successfully cloned and expressed inB.subtilisWB600 to generate the recombinant bacterium WB600 (pHY-E209). Recombinant alkaline protease AprE209 was then purified to apparent homogeneity from the supernatant of the recombinant bacterium using ion exchange chromatography and filtration chromatography. The optimum pH and temperature of recombinant enzyme AprE209 were 11.0 and 50 ℃, respectively. This recombinant enzyme also retained high activities at temperatures of 30-37 ℃ or pH 12.0. Furthermore, the mechanism of alkali-tolerance of AprE209 was analyzed by bioinformatics tools. The alkalophilic mutant ofB.licheniformisprotease obtained in this study had potential applications in detergent industry.

protease；alkalophilic mutant；detergent industry；enzymatic properties

碩士研究生(董自星博士、路福平教授為共同通訊作者，E-mail: dzx@tust.edu.cn; lfp@tust.edu.cn)。

國家自然科學基金面上項目(31370076)；福建省自然科學基金(2016J01157)

2016-12-15,改回日期：2017-01-04

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201706006