調控NADH/NAD+對重組谷氨酸棒桿菌產L-絲氨酸的影響

朱加粉，陳紫薇，張曉梅，史勁松，許正宏

1(江南大學 藥學院，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

谷氨酸棒桿菌；L-絲氨酸；NADH氧化酶；NADH；NAD+

調控NADH/NAD+對重組谷氨酸棒桿菌產L-絲氨酸的影響

朱加粉1，陳紫薇1，張曉梅1，史勁松1，許正宏2*

1(江南大學 藥學院，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

在谷氨酸棒桿菌中，L-絲氨酸由糖酵解中間產物3-磷酸甘油酸經過3步反應生成，這個過程產生2個NADH，而L-絲氨酸的合成過程并不涉及NAD+的生成，多余的NADH是否會影響菌株的生長及產L-絲氨酸？該研究通過外源添加NAD+的前體物質煙酸，內源表達NADH氧化酶編碼基因noxA，考察調控NADH/NAD+對CorynbacteriumglutamicumSYPS-062 33aΔSSAAI生長和產L-絲氨酸的影響。結果表明，添加不同濃度煙酸，菌株的L-絲氨酸產量、生物量及糖耗較未添加時略有提高。而通過加強表達NADH氧化酶編碼基因noxA，構建重組菌CorynbacteriumglutamicumSYPS-062 33aΔSSAAI-noxA，重組菌中NADH氧化酶比酶活是出發菌的11.6倍，L-絲氨酸產量達到28.93 g/L，較出發菌提高9.0%，糖酸轉化率達到0.29 g/g蔗糖，較出發菌提高7.4%，OD562最大值為51.38，較出發菌提高6.6%，說明NADH氧化酶的過表達能夠促進重組菌株的生長及碳源利用，提高菌株的L-絲氨酸產量。

L-絲氨酸屬于非必需氨基酸，有多種重要的生理功能和價值，廣泛應用于醫藥、食品、化妝品等領域。L-絲氨酸處于胞內代謝的中間位置，是生物體內一碳單位的重要來源，參與許多物質甘氨酸、蛋氨酸、嘌呤、嘧啶等物質的合成，代謝轉運速度極快[1-2]。目前，L-絲氨酸的生產方法主要有化學合成法、蛋白質水解法、酶法轉化法和微生物發酵法。其中，微生物發酵法具有綠色環保、高效、可持續發展等優點，成為國內外研究的熱點[3]。

近年來，微生物發酵法生產L-絲氨酸主要集中于谷氨酸棒桿菌和大腸桿菌[4-5]。其中谷氨酸棒桿菌屬于革蘭氏陽性菌，是美國FDA認證的氨基酸生產菌，被廣泛應用于L-谷氨酸、L-賴氨酸、L-纈氨酸等氨基酸的生產[6]。谷氨酸棒桿菌中L-絲氨酸的代謝途徑如圖1所示，L-絲氨酸由糖酵解中間產物3-磷酸甘油酸經3-磷酸甘油酸脫氫酶(PGDH)、磷酸絲氨酸轉氨酶(PSAT)和磷酸絲氨酸磷酸酶(PSP) 3個酶催化生成L-絲氨酸。L-絲氨酸在絲氨酸羥甲基轉移酶(SHMT)和L-絲氨酸脫氨酶(L-serDH)作用下分別降解為甘氨酸和丙酮酸[5]。目前，對谷氨酸棒桿菌產L-絲氨酸的研究主要集中于L-絲氨酸的降解途徑和合成途徑。SOTLZ等[7]等過表達C.glutamicumATCC13032L-絲氨酸合成途徑中關鍵酶，敲除或弱化L-絲氨酸降解途徑的酶，構建的菌株通過培養基優化、補料分批發酵，在20 L的發酵罐上L-絲氨酸的產量為36.26 g/L。

圖1 谷氨酸棒桿菌中L-絲氨酸的代謝途徑Fig.1 Metabolic pathway of L-serine in Corynebacterium glutamicum

本課題組前期從土壤中篩選出1株能直接利用糖質原料積累L-絲氨酸的谷氨酸棒桿菌C.glutamicumSYPS-062，并通過逐級誘變、代謝工程改造，最終構建的C.glutamicumSYPS-062 33aΔSSAAI在搖瓶發酵中L-絲氨酸的產量為26.23 g/L，在5 L發酵罐上補料分批發酵，L-絲氨酸的產量達到42.62 g/L[8-9]，是目前文獻報道利用糖質原料產L-絲氨酸的最高水平，但是菌株仍舊存在生長緩慢的問題。在微生物細胞內，NADH通過氧化磷酸化途徑代謝為NAD+，這一過程中產生大量的ATP，變構抑制糖酵解途徑的關鍵酶，降低糖的消耗速度，因此，一條加快糖酵解速率的策略是：過量的NADH在充分氧化為NAD+的同時，盡量減少ATP的合成。HEUX等[10]在Saccharomycescerevisiae過量表達編碼NADH氧化酶基因，導致胞內NADH含量下降，糖的消耗速度增加10%。董志姚等[11]通過過表達NADH氧化酶編碼基因，能夠直接將NADH轉化成NAD+，減少ATP的合成，重組菌葡萄糖消耗速度和目標產物產量均得到大幅提高。而PARK等[12]報道，在谷氨酸棒桿菌中，noxA所表達的蛋白具有氧化NADH的能力。谷氨酸棒桿菌在利用糖產L-絲氨酸過程中產生多余的NADH，是否多余的NADH導致C.glutamicumSYPS-062 33a△SSAAI生長緩慢？調控NADH/NAD+對谷氨酸棒桿菌生長及產L-絲氨酸是否會有影響，目前未見這方面的研究報道。

本文首先通過外源添加不同濃度的NAD+前體物質煙酸，考察其對谷氨酸棒桿菌C.glutamicumSYPS-062 33a△SSAAI菌株生長、碳源利用及L-絲氨酸產量的影響。隨后在C.glutamicumSYPS-062 33a△SSAAI中過表達NADH氧化酶編碼基因noxA，考察其對菌株生長、碳源利用及L-絲氨酸產量的影響，為菌株高產L-絲氨酸代謝改造提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和引物

CorynbacteriumglutamicumSYPS-062 33aΔSSAAI(縮寫為ΔSSAAI)為江南大學藥學院制藥工程研究室前期構建并保藏；大腸桿菌JM109為實驗室保藏；大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭表達質粒pDXW-10為王小元實驗室饋贈[13]。實驗涉及引物見表1。

表1 實驗中用到的引物

注：酶切位點用下劃線表示。

1.1.2 試劑

細菌基因組提取試劑盒、凝膠Clean柱回收試劑盒、質粒小量提取試劑盒及PCR引物均購自上海捷瑞生物工程有限公司；PrimeSTAR聚合酶、T4DNA連接酶等購自TaKaRa生物公司；限制性內切酶購自Fermentas公司；NADH氧化酶酶活相關檢測試劑購自sigma公司；蔗糖、磷酸二氫鈉、瓊脂粉等均為分析純，均購于國藥試劑有限公司；腦心浸液(BHI)、原兒茶酸、生物素等購于sigma公司；硫酸卡那霉素購于上海生物工程有限公司。

1.1.3 培養基

(1)LB 培養基(g/L)：蛋白胨 10，酵母粉 5，NaCl 10(固體培養基，瓊脂粉 20)；121℃滅菌20 min；

(2)種子培養基(g/L)：腦心浸液 37，葡萄糖 20，(NH4)2SO410，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO40.2，NaH2PO40.3；

(3)發酵培養基(g/L)：蔗糖 100，CaCO360，KH2PO43，(NH4)2SO430，MgSO4·7H2O 0.5，FeSO4·7H2O 0.02，MnSO4·H2O 0.02，原兒茶酸 0.03，生物素 5×10-5，鹽酸硫胺素 4.5×10-4；115 ℃滅菌7 min；

(4)谷氨酸棒桿菌感受態培養基(g/L)：蛋白胨 10，酵母粉 5，NaCl 10，吐溫 80 1，甘氨酸 25；121 ℃滅菌20 min；

(5)谷氨酸棒桿菌電轉化培養基(g/L)：蛋白胨 5，酵母粉 2.5，NaCl 5，腦心浸液 18.5，山梨醇 91；121 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒的構建

以谷氨酸棒桿菌ΔSSAAI基因組為模板，利用引物noxA-F和noxA-R擴增NADH氧化酶編碼基因noxA(582 bp)用限制性內切酶EcoRI、XhoI雙酶切目的基因和質粒載體pDXW-10，利用T4DNA ligase連接經過雙酶切的目的片段和質粒載體。

1.2.2 重組菌的構建

制備ΔSSAAI電轉化感受態細胞，將重組質粒pDXW-10-noxA電轉入ΔSSAAI感受態細胞，電轉化條件1.8 kV、5 ms，在谷氨酸棒桿菌電轉化培養基中加入適量的硫酸卡那霉素(50 mg/mL)篩選陽性轉化子，最終提取質粒，通過PCR及雙酶切驗證，得到重組菌C.glutamicumSYPS-062 33aΔSSAAI-noxA(縮寫為ΔSSAAI-noxA)。

1.2.3 重組質粒穩定性分析

質粒穩定性分析參照諸葛鑫[14]的方法。將重組菌接種至不含卡那抗性的液體種子培養基中，30 ℃培養24 h，以1%的接種量進行傳代培養。將菌液稀釋一定倍數涂布在種子平板和含有抗性的平板上，統計菌落數。

1.2.4 NADH氧化酶酶活力的測定

取對數生長期的細胞，4 000 r/min，離心10 min收集菌體。用pH 7.0 的磷酸鉀緩沖液洗滌3次，用磷酸鉀緩沖液適當稀釋菌體，在冰浴條件下，超聲破碎菌體細胞，工作4 s間歇6 s，99個循環，破碎3輪。離心取上清即為細胞總蛋白的粗提液。采用Bradford方法測定蛋白濃度。

酶活檢測方法參照PARK等[12]，配制磷酸鉀反應體系，包含50 mmol/L磷酸鹽；0.3 mmol/L EDTA；0.3 mmol/L NADH；50 μmol/L FAD。其中NADH作為反應電子的供體，在340 nm處有吸收峰，FAD則作為反應電子的受體。取1 mL的磷酸鉀反應液，加入50 μL總蛋白提取液，記錄3 min內吸光度變化。每分鐘氧化1 μmol NADH 所需的酶量為1個單位。

1.2.5 發酵參數的測定

生物量的測定：發酵液用1 mol/L HCl稀釋至一定濃度，紫外分光光度計檢測OD562。

L-絲氨酸和糖濃度的測定：采用HPLC測定發酵液中糖及L-絲氨酸產量[8]。

2 結果與分析

2.1 添加不同濃度的煙酸對ΔSSAAI發酵的影響

微生物中的磷酸核糖轉移酶能夠將培養基中的煙酸催化生成NAD+，劉杰等[15]在光滑球擬酵母發酵培養基中添加8 mg/L煙酸(NAD+合成前體)后，使得在發酵生產丙酮酸的過程中的葡萄糖消耗速度加快48.4%且丙酮酸產量增加29%。本文中添加0、16、24、32、40 mg/L煙酸，考察煙酸添加對出發菌ΔSSAAI發酵性能的影響。添加不同濃度煙酸菌株發酵96 h，相關發酵參數如表2所示。

表2 煙酸添加量對菌株ΔSSAAI發酵性能影響

從表2可以看出，添加不同濃度煙酸的發酵培養基中，發酵96 h，L-絲氨酸的產量較未添加有所提高，添加32 mg/L煙酸對菌株生長糖耗產酸最有利，L-絲氨酸產量最高達到27.75 g/L，比對照提高4.5%；菌株最大OD562達到49.24，比對照提高了2.1%；圖2為菌株ΔSSAAI添加32 mg/L煙酸的發酵過程曲線，從研究結果可以看出，外源添加煙酸菌株的生長及產酸略有提高，分析原因可能是由煙酸反應合成NAD+過程中，將煙酸催化生產煙酸單核苷酸的煙酸磷酸核糖轉移酶是其中的關鍵限速酶，在大腸桿菌中過量表達煙酸磷酸核糖轉移酶編碼基因可以有效地提高胞內的NAD+的含量[16]。

圖2 添加32 mg/L煙酸對菌株ΔSSAAI發酵過程的影響Fig.2 Time course of L-serine fermentation by ΔSSAAI

2.2 重組菌ΔSSAAI-noxA的構建

依據方法1.2.1構建重組質粒pDXW-10-noxA，依據方法1.2.2構建重組菌ΔSSAAI-noxA，挑取轉化子培養，提取質粒并利用EcoRI/XhoI雙酶切驗證，結果如圖3所示。從圖3可以看出，1、2、3泳道條帶分別與8351 bp的質粒pDXW-10和582 bpnoxA基因相對應，表明成功構建重組菌ΔSSAAI-noxA。

M1-DL10000 DNA Marker；M2-DL2000 DNA Marker；1，2，3-重組質粒pDXW-10-noxA雙酶切結果圖3 重組菌ΔSSAAI-noxA構建結果Fig.3 Verification of recombinant strain ΔSSAAI-noxA

2.3 重組質粒pDXW-10-noxA傳代穩定性分析

將活化的種子平板上重組菌ΔSSAAI-noxA轉接至液體培養基中進行傳代培養，分別取4，8，12，16，20代的菌液稀釋至適當濃度涂布固體種子平板和添加卡那抗性的平板上，30 ℃培養2～3 d，對平板上的菌落數進行統計，考察重組質粒pDXW-10-noxA的傳代穩定性。結果如表3所示，隨著傳代次數的增加，菌株依然保持原有特性，當傳代20次，重組菌ΔSSAAI-noxA所占比例為90.18%，說明重組質粒pDXW-10-noxA在ΔSSAAI中穩定性良好。

表3 質粒穩定性評價

2.4 重組菌ΔSSAAI-noxA與出發菌ΔSSAAI中NADH氧化酶酶活力的測定

收獲種子培養基中對數生長期的重組菌和出發菌細胞，破碎細胞取上清得到粗酶液，檢測NADH氧化酶酶活力，結果如表4所示。加強表達noxA基因能夠顯著提高NADH氧化酶酶活力，重組菌中NADH氧化酶比酶活是出發菌的11.6倍。

表4 重組菌ΔSSAAI-noxA和出發菌ΔSSAAI中NADH氧化酶酶活

2.5 重組菌ΔSSAAI-noxA發酵過程分析

noxA基因的過表達對菌株ΔSSAAI發酵性能的影響如圖4所示。從圖4(a)可以看出，發酵前期重組菌ΔSSAAI-noxA的生長略慢于出發菌ΔSSAAI，說明質粒過表達在一定程度上給菌體代謝造成負擔，隨著發酵時間的增加，在菌體對數生長期，重組菌ΔSSAAI-noxA生長明顯好于出發菌ΔSSAAI，發酵至84 h，重組菌OD562達到最大值51.38，出發菌株OD562最大值為48.21，較出發菌提高6.6%，由此可以看出，基因noxA的過表達能夠在一定程度上促進菌體的生長，增加生物量。從圖4(b)可以看出，發酵前期重組菌的糖耗相比于出發菌未見明顯變化，從36 h開始，重組菌的糖耗明顯快于出發菌，發酵至96 h，重組菌消耗完所有的糖，說明基因noxA的過表達能促進菌體對糖的利用。從圖4(c)可以看出，發酵96 h，重組菌L-絲氨酸達到最大值28.93 g/L，較出發菌提高9.0%，重組菌的糖酸轉化率為0.29 g/g蔗糖，較出發菌提高7.4%，說明基因noxA的過表達能提高重組菌的L-絲氨酸產量糖酸轉化率。

圖4 重組菌ΔSSAAI-noxA和出發菌ΔSSAAI發酵過程比較Fig.4 The fermentation performance comparison of ΔSSAAI-noxA and ΔSSAAI

3 結論

谷氨酸棒桿菌在利用糖質原料合成L-絲氨酸過程中產生2個NADH，而L-絲氨酸的合成過程并不涉及NAD+的生成，NADH/NAD+不平衡的問題可能會對菌株生長產酸造成影響。本文通過內源外源2個方面調控NADH/NAD+，考察其對谷氨酸棒桿菌ΔSSAAI生長和發酵的影響。首先通過外源添加不同濃度的NAD+前體物質煙酸，菌株ΔSSAAI的生長及產酸略有提高；隨后，通過加強表達 NADH 氧化酶編碼基因noxA，成功構建1株過量表達noxA的L-絲氨酸生產菌ΔSSAAI-noxA，比較了重組菌ΔSSAAI-noxA和出發菌ΔSSAAI中NADH氧化酶的酶活力，重組菌ΔSSAAI-noxA中NADH氧化酶酶比活力是出發菌ΔSSAAI的11.6倍。通過對重菌株發酵過程分析發現，過表達基因noxA提高了谷氨酸棒桿菌產L-絲氨酸的能力。重組菌ΔSSAAI-noxAOD562最大值為51.38，較出發菌ΔSSAAI提高6.6%，L-絲氨酸產量達到28.93 g/L，較出發菌提高9.0%，糖酸轉化率提高7.4%，由此可以看出，基因noxA的過表達能夠提高重組菌的L-絲氨酸產量及糖酸轉化率，促進重組菌的生長及加快碳源的消耗。利用過表達NADH氧化酶編碼基因noxA調控菌株NADH的策略，為提高相關氨基酸產量提供了參考。

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The effect of NADH/NAD+regulation onL-serine production by recombinantCorynebacteriumglutamicum

ZHU Jia-fen1, CHEN Zi-wei1, ZHANG Xiao-mei1, SHI Jin-song1, XU Zheng-hong2*

1(School of Pharmaceutics Science, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)2(School of biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

TheL-serine is produced by a three-step reaction of a glycolytic intermediate 3-phosphoglycerate, 2 molecules of NADH were generated in the production ofL-serine from sugars byCorynebacteriumglutamicum. However, no NAD+was generated in this process. Did NADH affectL-serine production and cell growth ofCorynebacteriumglutamicumThis study aimed to investigate the effects of regulation of NADH/NAD+onCorynebacteriumglutamicumSYPS-062 33aΔSSAAI growth, sugar consumption andL-serine accumulation by exogenous addition of niacin and endogenous overexpression of NADH oxidase. The results showed that exogenous addition of niacin had slightly enhanced the cell growth, sugar consumption andL-serine accumulation. When NADH oxidase was overexpressed, the recombinant strainCorynebacteriumglutamicumSYPS-062 33aΔSSAAI-noxA was constructed. The NADH oxidase activity in the recombinant strain was 11.6 folds higher than that of the parent strain. The production ofL-serine in recombinant strain was 28.93 g/L，increased by 9.0%, and the yield was 0.29 g/g sugar, increased by 7.4%. Its OD562was 51.38, increased by 6.6%. The results indicated that the overexpression of NADH oxidase could increase the cell growth, sugar consumption andL-serine production.

Corynebacteriumglutamicum;L-serine; NADH oxidase; NADH; NAD+

碩士研究生(許正宏教授為通訊作者,E-mail:zhenghxu@jiangnan.edu.cn)。

2017-02-03，改回日期：2017-03-04

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201706009