植物乳桿菌JLA-9產細菌素的分離純化

趙圣明，趙巖巖，馬漢軍

(河南科技學院 食品學院，河南 新鄉，453003)

植物乳桿菌JLA-9產細菌素的分離純化

趙圣明*，趙巖巖，馬漢軍

(河南科技學院 食品學院，河南 新鄉，453003)

將來源于東北傳統發酵酸菜中的植物乳桿菌JLA-9產的細菌素進行分離純化，首先利用飽和度為80%的硫酸銨溶液對發酵上清液進行沉淀粗分離。復溶后利用Sephadex LH-20進行凝膠層析純化，之后采用Hitrap QFF進一步進行離子交換層析純化，利用反相高效液相色譜(Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography，RP-HPLC)C18柱進行最終純化，得到單一活性抑菌組分，說明細菌素得到基本純化，經基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF/MS)確定該細菌素的分子質量約為0.9 kDa左右。采用瓊脂擴散法測定了細菌素對常見的食源性致病菌和腐敗菌的抑菌效果，結果顯示該細菌素具有較好的抑制作用。

植物乳桿菌；細菌素；分離；純化；分子質量

植物乳桿菌作為一種重要的乳酸菌，目前已經被廣泛的應用到食品加工相關領域中[1]。許多植物乳桿菌能夠產生細菌素，且細菌素具有熱穩定性高，耐酸，抑菌譜廣以及能夠被蛋白酶降解等優點，已經成為食品行業生物防腐劑開發的一個熱門方向[2-3]。目前從發酵食品中已經獲得多種植物乳桿菌產的細菌素，例如plantaricin 163[4]，plantaricin A-1[5]，plantaricin 35d[6]，bacteriocin AMA-K[7]，plantaricin MG[8]以及plantaricin ZJ5[9]等。有的植物乳桿菌產的細菌素抑菌譜較廣，對革蘭氏陽性菌和陰性菌都具有抑制效果，如分離自泡菜中的植物乳桿菌163產的細菌素plantaricin 163對食品中常見的大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，蠟樣芽孢桿菌等均具有較好的抑菌作用[4]。但有的細菌素抑菌譜卻很窄，僅能抑制少數種類的細菌，例如從山羊奶中分離獲得的植物乳桿菌 LC74產的細菌素plantaricin LC74，僅能夠抑制植物乳桿菌，短乳桿菌和布氏乳桿菌[10]。

細菌素的分離純化主要是根據細菌素的帶電性、分子質量大小及疏水性等特點來進行。一般的純化主要包括3個基本的步驟：即粗提取、初步純化和精細純化。粗提取大部分都是采用鹽析的方法，主要是在發酵上清液中加入無機鹽，最常用的是硫酸銨，使蛋白類細菌素的溶解度降低從而從液體中析出。SOUMAYA等利用鹽析的方法從唾液乳桿菌 SMXD51的發酵液中對細菌素進行粗分離，取得了很好的效果，回收率為1.36%[11]。RAMAKRISHNAN等利用硫酸銨沉淀粗分離鼠李糖乳桿菌 L34產的細菌素，得到了較好的分離效果[12]。也有少部分人選用有機溶劑進行萃取，主要是利用細菌素在互不相溶或者微溶的發酵上清液和有機溶劑中溶解度的不同，從而使細菌素從發酵上清液中轉移到有機溶劑中，然后將有機溶劑通過真空旋轉濃縮除去，最后得到粗提的細菌素，如TAYLOR等利用甲醇和乙醇提取nisin取得了較好的分離效果[13]。初步純化一般主要目的是除去大部分的雜質，使細菌素的純度達到50%～90%，用于進一步的純化鑒定，通常采用離子交換層析和凝膠層析等方式進行純化。由于乳酸菌產的細菌素一般所帶的電荷大小不同，因此選用離子交換層析能夠達到對細菌素分離純化的目的，該方法具有操作簡單及交換容量大等特點，已經成為細菌素純化過程中的最常用的方法之一。ZHU等利用離子交換層析結合凝膠層析的方法，以0.15 mol/L NaCl 進行洗脫分離得到植物乳桿菌 ZJ008產的細菌素plantaricin ZJ008，純化倍數達到24.8[14]。HATA等采用離子交換和凝膠層析對植物乳桿菌 A-1產的細菌素plantaricin ASM1進行分離，純化倍數達到20倍[15]。一般精細純化作為整個純化的最后一步，目的是除去樣品中殘留的痕量雜質，是樣品中的純度高于99%，以便于采用質譜和氨基酸測序等手段對其結構進行鑒定。目前大部分純化實驗的最后一步都是采用反相高效液相色譜法，它可以顯著地提高樣品的純度，因此反相高效液相色譜技術已經在細菌素純化中得到了廣泛的應用[14-16]。

本課題組前期從東北傳統發酵酸菜中分離得到1株植物乳桿菌JLA-9，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均具有較強的抑制作用。本研究擬選用硫酸銨沉淀，凝膠柱層析，離子交換層析和反相高效液相色譜等分離純化手段對植物乳桿菌JLA-9產的細菌素進行分離純化，為深入研究其結構及性質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌JLA-9，本實驗室分離自吉林省蛟河市農家自制發酵酸菜，現已保存于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC No.10686)。

指示菌菌株及來源：大腸桿菌(ATCC25922)、蠟樣芽孢桿菌(AS1.1846)、熒光假單胞菌(AS1.1802)、藤黃微球菌(CMCC(B)2800)、枯草芽孢桿菌(ATCC9943)和腸炎沙門氏菌(CICC21527)。

MRS培養基：牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，乙酸鈉5 g，K2HPO42 g，檸檬酸氫銨2 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O0.25 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1 mL，蒸餾水1 L，pH 6.2～6.4，115 ℃、20 min滅菌備用，固體培養基另加1.5%～2%的瓊脂。LB培養基：酵母粉5 g，蛋白胨10 g，NaCl5 g，蒸餾水1 L，pH 7.0，121 ℃、20 min滅菌備用，固體培養基另加1.5%～2%的瓊脂。

Sephadex LH-20，美國Phamarcia公司；乙腈、三氟乙酸(TFA)、甲醇：色譜純，美國Tedia公司；硫酸銨：分析純，國藥集團化學試劑公司。

1.2 儀器與設備

全自動高壓滅菌鍋TOMY-SX-70，日本Tomy公司；高速離心機5418，芬蘭Eppendorf公司；pH計Orion 3 STAR，美國Thermo公司；超凈工作臺SW-CJ-IBU，蘇州蘇凈集團；冷凍干燥機，德國Christ公司；AKTA蛋白純化系統、Hitrap QFF離子交換層析柱，GE Healthcare公司；分光光度計UV-2450，日本Shimadzu公司；旋轉蒸發儀，德國Heidolph公司；高效液相色譜儀Agilent 1100 series，美國Agilent公司；基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀，德國Bruker公司；電腦自動部分收集器DBS-100，上海滬西分析儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 細菌素粗提液的制備

將植物乳桿菌 JLA-9在試管斜面MRS瓊脂培養基上活化后接種于MRS液體培養基，培養至對數生長期，制成濃度為107～108CFU/mL的種子液。將植物乳桿菌JLA-9種子液以1%濃度接種于MRS發酵培養基中， 37 ℃靜止培養36 h，得到細菌素發酵液后離心除去菌體得到無細胞上清液。將該上清液分為4組，分別經60%、70%、80%、90%飽和硫酸銨攪拌過夜后，9 000 g離心10 min收集沉淀。用1/30體積的去離子水復溶后，用1 mol/L NaOH調至pH6.5，經5.0 g/L的過氧化氫酶37 ℃處理2 h后即為獲得的細菌素粗提物。

1.3.2 細菌素抑菌圈直徑的測定

細菌素抑菌圈直徑的測定采用瓊脂孔擴散法[17]，以蠟樣芽孢桿菌AS1.1846作為指示菌。

1.3.3 凝膠層析純化細菌素

采用Sephadex LH-20凝膠層析對細菌素的粗提物進行層析純化。純化條件為：將2 mL細菌素粗提液上樣于Sephadex LH-20柱表面，采用色譜甲醇和純水(體積比為80：20)進行洗脫,洗脫流速3 mL/min，利用電腦自動收集器收集組分[4]。以蠟樣芽孢桿菌作為指示菌，通過檢測其抑菌活性，得到抑菌活性組分。

1.3.4 離子交換層析純化細菌素

采用Hitrap QFF離子交換層析柱，利用AKTA蛋白純化系統對Sephadex LH-20純化得到的活性組分進行層析純化。純化條件為：流速2 mL/ min, 最高柱壓0.3 MPa, 收集體積為1 mL, 洗脫體積為5個柱體積, 平衡體積為5個體積, 進樣2 mL。分別用0.1 mol/L，0.25 mol/L，0.4 mol/L，1 mol/L的NaCl (pH8.5的 Tris-Hcl作為緩沖液)進行梯度洗脫。255 nm 紫外光下檢測，收集各個洗脫組分，經蒸餾水透析脫鹽后通過測定抑菌圈直徑檢測其抑菌活性。

1.3.5 反相高效液相色譜純化細菌素

將經過Hitrap QFF離子交換層析純化得到的活性組分經濃縮后采用反高效液相色譜Acchrom XCharge C18柱(4.6 mm×250 mm)進行分離純化，純化條件：洗脫液為含0.1%體積的三氟乙酸的水和乙腈溶液(水和乙腈體積比為95∶5)等濃度洗脫，時間：50 min；進樣量: 20 μL；流速：0.3 mL/min；檢測波長：255 nm。收集液相色譜洗脫組分，通過測定抑菌圈直徑檢測其抑菌活性。

1.3.6 細菌素分子質量測定

采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS) 對RP-HPLC最終純化得到的單一抑菌活性組分進行細菌素分子質量測定：儀器為Re Flex TM MALDI-TOF質譜儀；質譜基質為α-氰基-4-羥基肉桂酸[18]；質譜條件：激光源為波長355 nm的Nd YAG激光器，加速電壓20 kV，激光強度4 100，正離子模式檢測，線性高分子模式，質量掃描范圍m/z700～3 500。

1.3.7 細菌素抑菌活性測定

采用經Sephadex LH-20部分純化獲得的細菌素活性組分，利用瓊脂孔擴散法測定細菌素的抑菌活性，指示菌株包括：大腸桿菌(ATCC25922)、蠟樣芽孢桿菌(AS1.1846)、熒光假單胞菌(AS1.1802)、藤黃微球菌(CMCC(B)2800)、枯草芽孢桿菌(ATCC9943)和腸炎沙門氏菌(CICC21527)。

2 結果與分析

2.1 細菌素硫酸銨沉淀粗提取

本試驗中分別選用60%、70%、80%、90%飽和度的硫酸銨進行沉淀，由表1可以看出80%和90%飽和硫酸銨沉淀的效果較好，由于90%飽和硫酸銨沉淀下來的雜蛋白會更多，因此選用80%飽和硫酸銨沉淀作為細菌素的粗提取方法。

表1 植物乳桿菌 JLA-9發酵上清液硫酸銨沉淀后抑菌活性

2.2 細菌素凝膠層析純化

經硫酸銨沉淀得到的細菌素粗提樣品首先采用Sephadex LH-20凝膠層析進行純化，以蠟樣芽孢桿菌AS1.1846作為抑菌指示菌，通過瓊脂孔擴散法對收集的樣品進行檢測，結果見圖1。由圖1可以看出，在收集管中的第36管至49管之間得到一個抑菌活性洗脫組分，因此將其收集后用于下一步分離純化。

圖1 植物乳桿菌JLA-9所產細菌素的Sephadex LH-20洗脫曲線Fig.1 Elution curve of bacteriocin from L. plantarum JLA-9 on Sephadex LH-20 gel

2.3 細菌素離子交換層析純化

將經Sephadex LH-20純化得到的樣品進行Hitrap QFF離子交換層析純化，以蠟樣芽孢桿菌作為抑菌指示菌，通過瓊脂孔擴散法對收集的樣品進行檢測，結果見圖2。經抑菌實驗檢測，在NaCl的洗脫濃度為0.1mol/L時得到的洗脫組分1具有抑菌活性，在第16管至24管之間得到該抑菌活性組分，將其收集后用于下一步的分離純化。

圖2 植物乳桿菌JLA-9所產細菌素的Hitrap QFF Fast Flow洗脫曲線Fig.2 Elution curve of bacteriocin from L. plantarum JLA-9 on Hitrap QFF Fast Flow gel

2.4 細菌素反相高效液相色譜純化

由Hitrap QFF離子交換層析純化得到的抑菌活性洗脫組分經濃縮后利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)進一步純化結果見圖3。

圖3 植物乳桿菌JLA-9產細菌素的RP-HPLC圖Fig.3 RP-HPLC of bacteriocin produced by L. plantarum JLA-9

由圖3可知，在保留時間為14.879 min時得到一個對蠟樣芽孢桿菌具有抑菌活性的洗脫組分，將該抑菌活性組分收集后用于下一步的分子量測定分析。

2.5 細菌素分子量測定

將經RP-HPLC保留時間為14.879 min的抑菌活性組分收集后濃縮，利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)進行質譜分析，測定細菌素的分子量，結果見圖4。由圖4可知，出現多個質譜峰，說明樣品中仍存在多種物質，這可能由于前面的分離純化效果不佳，但是主要質譜峰都是集中在0.9 kD左右，初步可以判斷植物乳桿菌JLA-9產細菌素的分子量約為0.9 kD左右，可以根據分子量測定結果，進一步選用合適的純化方法對細菌素進行分離純化。

圖4 植物乳桿菌JLA-9所產細菌素的MALDI-TOF質譜圖Fig.4 MALDI-TOF MS of bacteriocin produced by L. plantarum JLA-9

2.6 細菌素的抑菌活性

經RP-HPLC純化得到的細菌素對常見的一些食源性致病菌及腐敗菌均具有較好的抑制作用。如圖5所示。

a：熒光假單胞菌；b：大腸桿菌；c：藤黃微球菌 d：蠟樣芽孢桿菌；e：枯草芽孢桿菌；f：腸炎沙門氏菌圖5 植物乳桿菌JLA-9產細菌素的抑菌活性Fig 5. The antibacterial activity of active bacteriocin from L. plantarum JLA-9

植物乳桿菌JLA-9產的細菌素對熒光假單胞菌、大腸桿菌、藤黃微球菌、蠟樣芽孢桿菌菌、枯草芽孢桿菌和腸炎沙門氏菌具有明顯的抑制效果。

3 討論

本研究從東北傳統發酵酸菜中分離得到一種細菌素，分子量大約在0.9 kDa左右，對食品中常見的一些食源性致病菌及腐敗菌具有較好的抑制作用。這與一些已經報道的植物乳桿菌產的細菌素具有相似的抑菌活性，如plantaricin 163對食品中常見的大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，蠟樣芽孢桿菌等均具有較好的抑菌作用[4]，Plantaricin MG主要對革蘭氏陰性食源性致病菌具有較好的抑制作用，但也能抑制一些革蘭氏陽性致病菌如枯草芽孢桿菌等[8]。到目前為止已經有許多植物乳桿菌產的細菌素被報道，其分子量一般都在1 k～5kDa之間，如植物乳桿菌 ZJ008產的plantaricin ZJ008分子量為1.3 kDa[14]， 植物乳桿菌 NRIC 149產的plantaricin 149分子量為2.2 kDa[19]，植物乳桿菌423產的plantaricin 423分子量為3.5 kDa[20]，植物乳桿菌C19產的plantaricin C19分子量為3.8 kDa[21]，植物乳桿菌510產的plantaricin Y分子量為4.2 kDa[22]等。本研究獲得的細菌素在分子量在0.9 kDa左右，有可能為一種新的細菌素，以后的研究將對分離純化工作進行優化，進一步對該細菌的結構及性質進行深入的研究。

本研究在離子交換層析純化細菌素中，選用pH8.5的 Tris-Hcl作為緩沖液，分別以0.1、0.25、0.4、1 mol/L的NaCl進行梯度洗脫，實現較好的分離效果，獲得細菌素的活性峰。一般在離子交換層析中，緩沖液的作用是維持待分離物質性質的穩定，同時保證待分離物質帶上穩定的電荷從而更加容易結合離子交換介質上，由于不同物質帶電荷不同，與交換介質結合能力也不同，通過鹽溶液的梯度洗脫，可以將它們進行有效地分離。目前文獻報道中一般多采用磷酸鹽或者醋酸鹽作為緩沖液，如ZHU等用Na3PO4和NaCl為洗脫緩沖液對plantaricin ZJ008進行分離純化[14]，BAUER等用Na3PO4和NaCl為洗脫緩沖液分離純化得到了Pediocin PD-1[23]，Deraz用NaAc和NaCl為洗脫緩沖液對Acidocin D20079 進行了分離純化[24]。還有報道稱王輝等采用超純水和NaCl為洗脫緩沖液分離純化得到了植物乳桿菌KLDS1.0391產的細菌素[25]。一般較少采用水作為離子交換層析的緩沖液，可能由于這種細菌素具有特殊的性質。本試驗采用常用的磷酸鹽和醋酸鹽作為緩沖液所收集到的洗脫峰幾乎沒有洗脫峰，而采用Tris-Hcl作為緩沖液收集到的洗脫峰卻抑菌活性較強，說明本試驗純化得到的細菌素與之前報道的細菌素可能具有一些不同的性質，具體原因尚不清楚，有待對其進行進一步的深入研究。

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Isolation and purification of bacteriocin produced byLactobacillusplantarum

ZHAO Sheng-ming*,ZHAO Yan-yan,MA Han-jun

(School of Food Science, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, China)

The bacteriocin produced byLactobacillusplantarumJLA-9 from fermented Chinese sauerkraut was purified. The cell-free supernatant ofLactobacillusplantarumJLA-9 was precipitated by ammonium sulfate and higher precipitation efficiency was obtained using 80% ammonium sulfate. Then, the samples were further purified by Sephadex LH-20 gel chromatography and Hitrap QFF ion exchange chromatography. The reverse-phase high-performance liquid chromatography with C18column was utilized for final purification. The bacteriocin produced byLactobacillusplantarumJLA-9 was essential purified to be a single peak by RP-HPLC chromatography. The molecular mass of purified bacteriocin was estimated by MALDI-TOF/MS to be approximately 0.9 kDa. The purified bacteriocin showed a high antibacterial activity against common food-borne pathogens and spoilage bacteria.

Lactobacillusplantarum; bacteriocin; isolation; purification; molecular mass

博士研究生，講師(本文通訊作者，E-mail:Zhao.sheng ming@hist.edu.cn)。

河南省重大科技專項項目(161100110600)；河南科技學院高層次人才科研啟動項目(2016018,2016019)；河南省高等學校重點科研項目(18B550003)

2016-11-29，改回日期：2017-02-09

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201706010