發酵液中水溶性熱凝膠提取工藝的優化

丁含，梁贏，朱莉，高敏杰，林莉，詹曉北*

1(江南大學 生物工程學院，糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)2(江蘇瑞光生物科技有限公司，江蘇 無錫，214125)

發酵液中水溶性熱凝膠提取工藝的優化

丁含1，梁贏1，朱莉2，高敏杰1，林莉1，詹曉北1*

1(江南大學 生物工程學院，糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)2(江蘇瑞光生物科技有限公司，江蘇 無錫，214125)

為提取純化發酵液中水溶性熱凝膠，首先采用單因素結合響應面分析方法優化Sevag法去除發酵液中的蛋白，在單因素優化基礎上，根據中心組合實驗設計(Central Composite Design)實驗原理，設計3因素5水平的響應面分析實驗，最終得到最優去蛋白工藝：氯仿與正丁醇體積比為3.5的Sevag試劑，按發酵上清液與Sevag試劑體積比3.75的比例加入上述試劑，振蕩混勻后靜置33 min，重復上述操作5次；此條件下蛋白去除率為85.73%，水溶性熱凝膠回收率為90.29%。對去蛋白后的處理液進行有機溶劑法的最佳提取工藝優化，優化得到乙醇為最佳提取試劑，加入乙醇至終濃度為90%，混勻后靜置4 h，最后得到水溶性熱凝膠的提取率為40.12%，純度為89.10%。

水溶性熱凝膠；脫蛋白；單因素優化；響應面分析；多糖提取

熱凝膠是一種水不溶性、由β-1,3-糖苷鍵將葡萄糖殘基連接而成的無分支微生物胞外多糖[1]。1996 年，熱凝膠被美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批準作為食品添加劑，同時大量實驗也證明了熱凝膠的安全性[2]，其在食品、醫藥及生命科學領域有著十分廣泛的應用。有研究表明，隨著熱凝膠分子量降低，其與細胞表面作用的機會更大[3]，因此，熱凝膠的分子量與其生物活性密切相關。同時熱凝膠分子量的降低也會提高其在水中的溶解度，溶解度的增加也拓寬其在生命科學領域的應用范圍。

近年來的研究也越來越重視β-葡聚糖在癌癥和傳染病治療中的應用[4]。水溶性熱凝膠作為無分支均一的一種微生物胞外多糖，產品具有更大的利用價值。β-1,3-低聚糖具有抗腫瘤活性[5]、誘導動物產生細胞因子[6]、提高人體免疫力等功能。針對目前有關低分子量β-1,3-葡聚糖的制備研究較少，本文以土壤桿菌和哈茨木霉混合發酵的發酵液為研究對象，進行可溶性熱凝膠的提取工藝研究。

共培養發酵結束后發酵液中主要存在水溶性熱凝膠、哈茨木霉分泌的β-1,3-葡聚糖酶以及少量未被酶解的大分子不溶性熱凝膠。因此，對發酵液的主要處理在于離心去除不溶物后，脫去上清液中蛋白。多糖去蛋白的方法主要有Sevag法(氯仿和正丁醇按一定體積混合)[7]、三氟三氯乙烷法(TTF法)、三氯乙酸法(TCA法)等。Sevag法是經典溫和的去蛋白方法，但該方法需要多次重復操作才能達到較好效果；TCA法沉淀效果比Sevag法好，但有機酸會造成多糖降解，導致多糖損失率高[8]，該法常用于植物多糖。本研究選擇Sevag法去除發酵液中的蛋白，并采用單因素結合響應面分析的方法優化Sevag法。

去蛋白后的發酵液上清中大部分為可溶性熱凝膠。對于水溶性胞外多糖，可根據其溶于水而不溶于一些有機溶劑的特點，降低其在溶液中的溶解度從而析出以達到分離的目的。主要的方法有有機溶劑沉淀法和鹽析法[9]，其中常用的有機溶劑有小分子醇類(如甲醇、乙醇、異丙醇)或丙酮等。

低分子量的水溶性熱凝膠是一類新型功能性低聚糖，它具有特殊的生理活性，正在被廣泛研究。但是目前國內對其研究相對較少，本文是在了解熱凝膠結構及性質的基礎上，針對目前涉及較少的可溶性熱凝膠的制備進行了研究，為水溶性熱凝膠的推廣應用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

土壤桿菌(Agrobacteriumsp.)ATCC 31749 ，哈茨木霉(Trichodermaharzianum) GIM 3.442均由江南大學糖化學與生物技術研究中心保藏。

土壤桿菌斜面培養基(g/L)：葡萄糖 40.0，酵母粉 5.0，CaCO310.0，瓊脂粉 20.0，pH 7.0。

種子培養基(g/L)：葡萄糖20.0，酵母膏1.0，MgSO40.5，KH2PO41.74，pH 7.0。

發酵培養基(g/L)：葡萄糖 80.0，酵母膏1.0，KH2PO42.7，(NH4)2SO42.0，MgSO40.5，無機鹽濃縮液10 mL，pH 7.0。

哈茨木霉種子培養基(g/L)：葡萄糖 20.0，酵母粉 15.0，KH2PO46.0，(NH4)2SO42.5，MgSO40.5，pH 6.0；發酵培養基(g/L)：葡萄糖 30.0，米糠 20.0，KH2PO45.0，MgSO40.5，無機鹽濃縮液10 mL，pH 6.0。

無機鹽濃縮液(g/L)：FeCl31.0，NaCl 1.0，MnCl21.0，CaCl21.0。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵液的制備

斜面保存的哈茨木霉和土壤桿菌在相應的種子

液中分別培養18 h和16 h，然后以5%的接種比接入相應的發酵培養基單獨培養18 h最后按照/(土壤桿菌)∶/(哈茨木霉發酵液)=5∶4，將哈茨木霉發酵液離心棄去上清，沉淀接入到土壤桿菌發酵液中，繼續培養126 h，獲得含有水溶性熱凝膠的發酵液。

1.2.2 水溶性熱凝膠提取工藝流程

1.2.3 Sevag法去蛋白單因素優化策略(表1)

表1 去蛋白單因素優化策略

1.2.4 Sevag法去蛋白響應面優化策略

通過單因素實驗，確定響應面實驗設計的因素與水平，選取氯仿與正丁醇的體積比(A)、發酵液上清與Sevag試劑的體積比(B)、萃取靜置時間(C)的最優實驗點為中心點，對3個顯著因子進行中心組合設計(Central Composite Design，CCD)優化。通過Design-Expert V 8.0.6輔助設計，根據CCD實驗設計原理，進行3因素5水平的響應面分析實驗，實驗設計如表2所示[10]。

表2 中心組合設計實驗中的因素及水平

1.2.5 水溶性熱凝膠提取優化(表3)

表3 水溶性熱凝膠提取優化

1.2.6 蛋白含量和去除率測定

采用考馬斯亮藍法[11]測定去蛋白后的發酵液中殘留蛋白質含量。取1 mL稀釋至合適濃度的待測液，加入5 mL考馬斯亮藍試劑，室溫反應5 min，選擇波長595 nm測其吸光度，并測定去蛋白前發酵液中總蛋白。根據標準曲線方程y=4.275 7x+0.002 94(R2=0.999)計算相應的蛋白質含量，按照公式(1)計算蛋白質的去除率。

(1)

1.2.7 水溶性熱凝膠含量和提取率測定

采用蒽酮-硫酸法[12]測定去蛋白后的發酵液中總糖含量。取1 mL稀釋至合適濃度的待測液，加入4 mL濃H2SO4，酸解5 min后加入0.5%的蒽酮-乙酸乙酯試劑1 mL，搖勻后沸水浴10 min，選擇波長600 nm測其吸光度，并測定去蛋白前發酵液中總糖含量。根據標準曲線方程y=0.003 9x-0.000 5(R2=0.999)計算相應的糖含量，最后按照式(2)計算水溶性熱凝膠的回收率。

(2)

1.2.8 水溶性熱凝膠純度的測定

采用國家標準推薦的方法[13]，即苯酚-硫酸法測定最終獲得的可溶性熱凝膠純度。取1 mL稀釋至合適濃度的待測液，加入1 mL質量分數5%的苯酚溶液和5 mL濃H2SO4，混勻后立即冷卻，在波長490 nm處測其吸光度，與相同濃度葡萄糖標準溶液比較，最后按照式(3)計算水溶性熱凝膠的純度。

(3)

2 結果與分析

2.1 Sevag法去蛋白單因素優化結果

Sevag試劑是氯仿和正丁醇(或戊醇)按一定比例混合得到的。其中，氯仿能使蛋白質變性，與蛋白質形成一種溶膠類型的復合物，正丁醇可以抑制泡沫的形成，因此，氯仿與正丁醇的比例對其蛋白去除效果影響較大。

氯仿與正丁醇體積比的優化結果如圖1所示。隨著氯仿添加量的增加，蛋白去除效果也越佳，當氯仿與正丁醇比例大于4∶1后，其去除蛋白質的能力達到飽和，繼續加入氯仿蛋白的去除率并未增加，氯仿的加入也會造成多糖的損失。因此，選擇V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1的Sevag試劑進行后續的蛋白去除，此條件下的蛋白去除率為56.18%，可溶性熱凝膠回收率為92.06%。

圖1 氯仿與正丁醇體積比對去蛋白影響Fig.1 Effect of chloroform and n-butanol volume ratio on deprotentinizaiton

Sevag試劑與發酵上清液體積比的優化結果如圖2所示。Sevag試劑添加量越大，蛋白去除率越高，但是水溶性熱凝膠的損失率也越大。綜合考慮，選擇V(Sevag試劑)∶V(發酵液上清)=1∶5，該條件下，蛋白去除率為60.39%，可溶性熱凝膠回收率為94.88%。

圖2 Sevag試劑與發酵液上清體積比對去蛋白影響Fig.2 Effect of Sevag reagent and treatment solution volume ratio on deprotentinizaiton

萃取靜置時間的優化結果如圖3所示。靜置時間延長，蛋白去除率也越高，靜置30 min后，蛋白去除率也不再增加，并且時間的延長會導致變性的蛋白膠體吸附多糖沉降[14]。因此，振搖后靜置30 min最佳，此時蛋白去除率為68.42%，可溶性熱凝膠回收率為93.87%。

圖3 萃取靜置時間對去蛋白影響Fig.3 Effect of extraction times on deprotentinizaiton

萃取次數的優化結果如圖4所示。隨著萃取次數的增多，蛋白去除效果也越好，當萃取次數超過5次時，蛋白去除率不再增大，并且萃取次數的增多也會造成可溶性熱凝膠的損失，導致回收率降低。在氯仿與正丁醇體積比為4∶1，Sevag試劑與樣液體積比1∶5，振搖后靜置30 min，重復5次的條件下進行去蛋白實驗，最終蛋白去除率為76.54%，可溶性熱凝膠的回收率為93.87%。

圖4 萃取次數對去蛋白的影響Fig.4 Effect of extraction times on deprotentinizaiton

2.2 Sevag法去蛋白響應面優化結果

2.2.1 實驗設計方案

利用Design-Expert軟件進行3因素的中心組合實驗設計，按照表2編碼要求，生成實驗方案見表4，其中每組實驗做3個平行實驗，結果取3個平行實驗的平均值，將實驗結果記入表4中。

表4 中心組合設計的實驗方案及響應值

2.2.2 結果分析

通過Design-Expert軟件對表2 的實驗結果進行響應面分析，建立多元二次回歸方程如下，Y1= -3.245 72+3.307 76×A+8.454 06×B+3.601 80 ×C-0.081 570×A×B-0.034 088×A×C+0.22 403×B×C+0.263 68×A2-1.943 12×B2-0.066 882×C2，Y2=+89.556 21+22.417 90×A-12.468 55×B-0.656 80×C+0.866 94×A×B-0.244 66×A×C+1.213 33×10-3×B×C-2.930 51×A2+1.011 29×B2+0.023 854×C2。分別對Y1、Y2兩個方程進行方差分析，結果如表5、表6所示[15]。

表5 二次模型方差分析結果(蛋白去除率)

表6 二次模型方差分析結果(可溶性熱凝膠回收率)

圖5 不同因素對蛋白去除率影響的等高線圖和響應面圖Fig.5 Contours and response surfaces between different variables on the rate of deprotentinizaiton

圖6 不同因素對水溶性熱凝膠回收率影響的等高線圖和響應面圖Fig.6 Contours and response surfaces between different variables on therecovery of water-soluble curdlan

利用Design-Expert軟件求解方程Y1和Y2，以蛋白去除率和可溶性熱凝膠回收率兩者為指標，求解當蛋白去除率和可溶性熱凝膠回收率都最高時，得到最佳工藝：氯仿與正丁醇體積比3.52，發酵液上清與Sevag試劑體積比3.75，靜置時間32.81 min，此條件下的蛋白去除率為84.75%，多糖回收率為87.09%。

方便起見，將氯仿與正丁醇體積比設為3.5，發酵液上清與Sevag試劑體積比3.75，靜置33 min，重復5次，進行工藝驗證，實際測得響應面優化條件下蛋白去除率85.73%，水溶性熱凝膠回收率為90.29%，這與理論預測值相比無顯著差異，因此采用CCD的中心組合實驗設計優化的水溶性熱凝膠去蛋白工藝條件可靠。

2.3 水溶性熱凝膠提取優化結果

以4倍體積的溶劑進行水溶性熱凝膠的提取，提取溶劑的種類對提取率的影響如圖7所示。由圖7可以看出，在4倍體積提取溶劑的濃度下，乙醇和丙酮提取效果較好，提取率分別為22.0%和22.8%。對該數據進行方差分析可知，乙醇和丙酮對水溶性熱凝膠的提取率無顯著性差異(P=0.826>0.05)。考慮到乙醇更加安全、可靠[18]，而且在提取過程中也發現乙醇脫除發酵液中色素能力明顯優于丙酮，因此選擇乙醇作為水溶性熱凝膠的最佳提取試劑[19]。

圖7 不同提取溶劑的影響Fig.7 Effect of different extraction solutions

終體積分數為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇對水溶性熱凝膠的提取率如圖8所示，隨著乙醇的加入，越來越多的糖會析出，當乙醇體稷分宭達到90%時，水溶性熱凝膠的提取率可達32.41%。

圖8 乙醇終濃度的影響Fig.8 Effect of different final ethanol concentration

以終體積分數為90%的乙醇對去蛋白后的樣液進行處理，分別靜置1、2、3、4、5 h后水溶性熱凝膠的提取率如圖9所示。從圖9中可以看出，1 h后多糖基本全部析出。但在靜置過程中發現，加入乙醇后，多糖會慢慢沉淀至底部，1 h時體系中的多糖并未完全沉降至底部，到4h時，多糖全部沉降至底部，可直接將上清傾倒出來，減少了離心的次數，簡化工藝。因此選擇靜置4 h為水溶性熱凝膠的提取時間，此時水溶性熱凝膠提取率為40.12%，得到水溶性熱凝膠純度為89.10%。

圖9 提取時間的影響Fig.9 Effect of different extraction time

3 結論

熱凝膠不溶于中性和酸性溶液，僅溶于pH大于12的堿性溶液和少數有機溶劑(如DMSO)中，因此發酵過程中熱凝膠的提取多采用酸沉堿溶的方法。通過共培養發酵所得的熱凝膠多糖可溶于水中，發酵結束后多糖溶于發酵液中，無法通過調節pH的方法提取，因此可溶性熱凝膠的提取需要探索出一種新的方法。本研究建立了一種從發酵液中提取純化β-1,3-低聚糖(水溶性熱凝膠)的方法。單因素結合響應面優化Sevag法去除發酵液上清中的蛋白，配制氯仿與正丁醇的體積比3.5∶1的Sevag試劑，按Sevag試劑與發酵上清液的體積比3.75∶1的比例進行萃取，振搖后靜置33 min，重復去除5次，最終發酵液中蛋白去除率達到85.73%，可溶性熱凝膠回收率為90.29%；然后，在脫蛋白后的處理液中加入乙醇至終濃度90%，混合均勻后靜置4 h，棄去上清，離心回收沉淀，真空干燥得到可溶性的熱凝膠多糖，提取率達40.12%，純度達到89.10%。

可溶性熱凝膠作為一種功能性低聚糖，具有活性強、毒副作用低的特點，是目前多糖領域中比較重要的一種。本文建立了一種可溶性熱凝膠的提取純化工藝，得到的低分子量熱凝膠可復溶于水中，拓寬了熱凝膠在生命科學領域的應用，為其后續在生理方面的應用奠定了基礎。

[1] ZHAN X,LIN C,ZHANG H.Recent advances in curdlan biosynthesis, biotechnological production, and applications[J].Applied Microbiology and Biotechnology, 2012,93(2):525-531.

[2] 李晶.熱凝膠制備β-1,3-葡聚寡糖及其誘導抗真菌功能的研究[D].無錫: 江南大學,2014.

[3 ] METHACANON P,WEERAWATSOPHON U,TANJAK P,et al. Interleukin-8 stimulating activity of low molecular weight β-glucan depolymerized by γ-irradiation[J]. Carbohydrate Polymers,2011(86):574-580.

[4] MANTOVANI M S,Bellini M F, Angeli J P F, et al. β-Glucans in promoting health: Prevention against mutation and cancer[J]. Mutation Research/reviews in Mutation Research, 2008,658(3):154-161.

[5] 王英杰. 低分子量水溶性 β-1,3-葡聚糖的制備及其活性研究[D]. 濟南: 齊魯工業大學, 2014.

[6] HIDA T H, ISHIBASHI K, MIURA N N,et al.Cytokine induction by a linear 1,3-glucan, curdlan-oligo, in mouse leukocytesinvitro[J]. Inammation Research, 2009,58(1):9-14.

[7] SEVAG M G, LACKMAN D B, SMOLENS J. The isolation of the components of streptococcal nucleoproteins in serologically active form[J]. Paleoceanography, 1938,13(1):42-49.

[8] 修愛慧.土壤桿菌ZX09胞外多糖的制備和結構解析以及生物學功能的研究[D].南京:南京理工大學, 2011.

[9] Garcíaochoa F, SANTOS V E, CASAS J A, et al. Xanthan gum: production, recovery, and properties[J]. Biotechnology Advances, 2000, 18(7):549-579.

[10] 蒙哥馬利·道格拉斯. 實驗設計與分析[M].第6版.北京:人民郵電出版社, 2009.

[11] 陳毓荃. 生物化學實驗方法和技術[M].科學出版社, 2002.

[12] 劉曉涵, 陳永剛, 勵林, 等. 蒽酮硫酸法與苯酚硫酸法測定枸杞子中多糖含量的比較[J].食品科技,2009,34(9):270-272.

[13] 中華人民共和國衛生部.GB 28304—2012食品安全國家標準食品添加劑可得然膠[S]. 北京: 中國標準出版社, 2012.

[14] 王珊,黃勝陽.植物多糖提取液脫蛋白方法的研究進展[J].食品科技,2012,37(9):188-191.

[15] DONG C H,XIE X Q,WANG X L,et al.Application of Box-Behnken design in optimisation for polysaccharides extraction from cultured mycelium ofCordycepssinensis.[J]. Food & Bioproducts Processing, 2009, 87(2):139-144.

[16] Richard F.Gunst. Response surface methodology:process and product optimization using designed experiments[J]. Technometrics, 1996, 38(3):284-286.

[17] 黃新仁. 響應面法在生物過程優化中的應用[D].長沙: 湖南大學, 2011.

[18] 欒慶祥, 趙楊, 周欣, 等. 單因素試驗結合響應面分析法優化杜仲最佳提取工藝[J].藥物分析雜志,2013,33(5):859-865.

[19] ZHAO L,DONG Y,CHENG G,et al.Extraction, purification, characterization and antitumor activity of polysaccharides fromGanodermalucidum[J]. Carbohydrate Polymers,2010, 80(3):783-789.

The optimal extraction of soluble curdlan from fermentation liquid

DING Han1,LIANG Ying1,ZHU Li2,GAO Min-jie1,LIN Li1,ZHAN Xiao-bei1*

1(Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology of Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)2(Jiangsu Rayguang Biotech Co. Ltd., Wuxi 214125, China)

In order to extract and purify the water-soluble curdlan from the fermentation broth, the single-factor experiment combined with response surface analysis was used to optimize the Sevag method to remove the protein in the fermentation broth. Based on the results of single-factor tests and the Central Composite Design experimental design principles, a response surface methodology which has three factors and five levels was designed to optimize the process. The optimal conditions for deprotenizing by these methods were found to be five treatment cycles with a mixture of chloroform and n-butyl alcohol (3.5∶1，V/V) at a solid-to-solvent ratio of 3.75∶1(V/V) for 33 minutes. Under these conditions, the rate of deprotentinizaiton and polysaccharide recovery was 85.7307% and 90.2974%, respectively. Then, the optimum extraction technology of the organic solvent was optimized. The ethanol was added as the best extraction reagent to the final concentration of 90%. After the mixture was left to stand for 4 hours，extraction rate of water-soluble curdlan could reach 40.12%.

water-soluble; curdlan deprotentinizaiton; single-factor experiment; response surface analysis; extraction of polysaccharides

碩士研究生(詹曉北教授為通訊作者，E-mail:xbzhan@yahoo.com)。

江南大學自主科研計劃-重點項目( JUSRP51632A)；國家自然科學基金(31171640)；江蘇省自然科學基金(BK20151122)

2017-01-06，改回日期：2017-02-24

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201706018