奶豆腐來源植物乳桿菌的益生特性評價

呂冠薇，段翠翠，高磊，欒暢，趙玉娟，牛春華，李盛鈺*

1(長春醫學高等專科學校 臨床醫學部，吉林 長春，130031)2(吉林省農業科學院 農產品加工研究所，吉林 長春，130033)

奶豆腐來源植物乳桿菌的益生特性評價

呂冠薇1，段翠翠2，高磊2，欒暢2，趙玉娟2，牛春華2，李盛鈺2*

1(長春醫學高等專科學校 臨床醫學部，吉林 長春，130031)2(吉林省農業科學院 農產品加工研究所，吉林 長春，130033)

以奶豆腐來源的3株植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)為研究對象，分析了菌株的耐酸耐膽鹽能力、表面疏水性和體外抗氧化能力，旨在評價菌株的益生特性。結果表明：植物乳桿菌對強酸和高膽鹽具有較好的耐受能力，能保持較高的活性；供試菌株均對二甲苯的疏水性作用較強，而對三氯甲烷的疏水作用較弱；3株菌株均具有較好抗氧化活性。

益生菌；植物乳桿菌；耐受；抗氧化

益生菌(probiotic)是一類對人體有益的活性微生物，可作為食品添加劑加入食品中直接食用，定植于人體腸道、生殖系統內，調節腸道菌群結構，改善宿主微生態平衡，促進機體健康[1]。隨著對益生菌研究的不斷深入，越來越多的益生性發酵食品得到人們的認可。將益生菌添加到食品中，不僅可以增加食品的保健功效，而且還可以改善口感、質地和風味[2]。目前，市場上的益生菌功能食品種類很多，如酸奶、奶酪、飲料等，但是不同來源的菌株的功能特性存在很大的差異，因此篩選優良益生特性和功能特性的乳酸菌新菌株，對益生菌的應用和產品開發至關重要。本研究主要通過對傳統發酵食品奶豆腐源植物乳桿菌菌株的耐酸耐膽鹽特性、抗氧化能力、蛋白水解活性等進行測定，著力于篩選出具有潛在益生特性的優良菌株，為今后開發新型功能性益生菌制品奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

試驗菌株C12、C26和C40為內蒙古傳統奶豆腐中分離的新菌株。上述菌株經API50 C生化鑒定盒及16S rDNA序列比對分析，均鑒定為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。菌種保存于吉林省農業科學院農產品加工所。使用前連續活化傳代培養2代后，按3%量接種于MRS液體培養基中，連續培養16 h，離心(6 000 r/min，10 min，4 ℃)，滅菌生理鹽水洗滌2次，離心(6 000 r/min，10 min，4 ℃)，菌泥用滅菌生理鹽水調整菌數為1010CFU/mL，置4 ℃冰箱備用。

1.2 培養基

MRS(de Man，Rogosa and Sharpe，MRS)液體培養基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏10.0 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，K2HPO42.0 g/L，無水乙酸鈉5.0 g/L，檸檬酸鈉5.0 g/L，MgSO40.2 g/L，MnSO40.05 g/L，葡萄糖20.0 g/L，吐溫80 1.0 mL/L，加水至1 000 mL，調pH至pH6.6±0.2，115 ℃滅菌15 min。

MRS固體培養基：每升MRS液體培養基中加入瓊脂20 g。

MRS-THIO液體培養基：每升MRS液體培養基中加入巰基乙酸鈉2 g。

1.3 試劑

蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉、葡萄糖、D-山梨醇、瓊脂粉(分析純)，北京奧博星生物技術有限責任公司；脫脂乳粉(食品級)，新西蘭進口；膽酸-脫氧膽酸鈉鹽混合物(產品編號：48305)，SIGMA-ALDRICH公司；其余試劑均為分析純。

1.4 儀器與設備

高壓蒸汽滅菌鍋，日本Sanyo公司；超低溫冰箱，Thermo Electron公司；無菌超凈工作臺，哈爾濱東聯電子技術開發有限公司；HZQ-Q型電熱恒溫培養箱，上海一恒實驗設備有限公司；紫外可見分光光度計，美國Varian公司；全自動凱氏定氮儀，丹麥Foss公司。

1.5 試驗方法

1.5.1 菌株耐酸性能的測定

分別將菌株接種于pH 2.0、pH 3.0和pH 6.6的MRS液體培養基中，分別培養1、2和3 h。培養后，各取0.5 mL菌液，無菌生理鹽水稀釋至適宜梯度，取50 μL涂布在MRS固體培養基中，37 ℃培養箱中靜置培養48 h后菌群計數[3-5]。每個稀釋度做3個平行，按公式(1)計算存活率：

(1)

1.5.2 菌株耐膽鹽性能的測定

分別將菌株接種于膽鹽質量分數為0.3%、0.5%和1.0%的MRS液體培養基中，分別培養1、2和3 h，以不含膽鹽的MRS培養基為對照。培養后，各取0.5 mL菌液，無菌生理鹽水梯度稀釋后，取50 μL接種在MRS固體培養基中，37 ℃培養箱中靜置培養48 h后菌群計數[6-7]。每個稀釋度做3個平行，按公式(1)計算。

1.5.3 菌株表面疏水性的測定

采用細菌黏著物質法(bacterial adhesion substance,BATS)測定疏水性。菌泥用PBS溶液(pH 7.2)清洗2次后用PBS溶液重懸，調整菌懸液濃度為1×108CFU/mL，測定其在600 nm處的吸光度值(A0)。各取菌懸液3 mL，分別加入1 mL二甲苯酯、乙酸乙酯和三氯甲烷混合，靜置10 min，漩渦振蕩2 min后再靜置30 min，在600 nm處測水相吸光度值(A1)[8]。試驗重復3次。按公式(2)計算菌株疏水性：

(2)

1.5.4 羥自由基清除能力的測定

采用Fenton法進行測定[9-10]。在試管中依次加入1 mL 0.435 mmol/L的亮綠溶液，2 mL 0.5 mmol/L的FeSO4溶液和1.5 mL 3%(體積分數)的H2O2溶液后，分別加入1 mL 1×109和1×1010CFU/mL濃度的菌株懸液。混勻后，于37 ℃恒溫水浴鍋中靜置20 min，離心(6 000 r/min，10 min，4 ℃)，624 nm波長下測定吸光度。按公式(3)計算菌株清除羥自由基的能力：

(3)

式中：As，樣品加亮綠和Fenton試劑(Fe2+與過氧化氫構成的氧化體系稱為Fenton試劑)的OD值；Ao，無樣品加亮綠和Fenton試劑的OD值；A，無樣品只加亮綠的OD值。

1.5.5 DPPH清除能力的測定

避光條件下，向2 mL 0.5 mmol/L的DPPH甲醇溶液中加入1 mL菌株混懸液，充分混合，靜置30 min后，離心(6 000 r/min，10 min，4 ℃)，517 nm處測定吸光度[11-12]。空白組以等體積甲醇溶液代替DPPH甲醇溶液，對照組以等體積無菌水代替無細胞提取液。試驗重復3次。按公式(4)計算菌株清除DPPH自由基的能力：

(4)

式中：A樣品，樣品只加DPPH的OD值；A空白，樣品只加甲醇的OD值；A對照，無樣品只加DPPH的OD值。

1.5.6 超氧陰離子清除能力的測定

向1 mL不同濃度的菌株混懸液中依次加入2.8 mL 3 mmol/L的二乙三胺五乙酸溶液和0.2 mL 1.2 mmol/L的鄰苯三酚溶液。混勻后，于25 ℃恒溫水浴鍋中靜置10 min，在325 nm波長條件下測定吸光度值[13]。按公式(5)計算乳酸菌清除超氧陰離子的能力：

(5)

式中：A11，樣品加二乙三胺五乙酸和鄰苯三酚的吸光度值；A10，樣品只加二乙三胺五乙酸的OD值；A01，無樣品加二乙三胺五乙酸和鄰苯三酚的OD值；A00，無樣品只加二乙三胺五乙酸的OD值。

1.6 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 菌株的酸耐受能力

由表1分析可知，在pH 6.6的條件下菌株均能良好生長，3株菌存活數隨著培養時間的增加呈上升趨勢。在pH 3.0的條件下，3株菌對酸性環境的耐受性很好，菌株培養3 h后的存活率均能達到70%以上，其中C26的存活率較低，耐酸能力較低，C40的存活率最高，為72.71%。在pH 2.0條件下，C26培養3 h后的活菌數為5.65 lg CFU/mL，存活率最高為70.98%，C12、C40的活菌數都在5 lg CFU/mL以下。試驗結果表明，這3株菌在酸性條件下耐受性良好，仍保持較高的菌株存活數，其中植物乳桿菌C26在pH 2.0 條件下具有較強的耐酸性，植物乳桿菌C40在pH 3.0條件下具有較強的耐酸性。耐酸能力是植物乳桿菌重要的特征之一，其耐受力的高低意味著該菌株在胃腸道中的存活能力的高低。HECHARD等[14]研究結果表明，干酪乳桿菌212.3、F19和L.rhamnosusGG均不能耐受pH 2.0的酸度。MARAGKOUDAKIS等[15]報道乳桿菌能夠在pH 2.5～3.0的環境中定植，但對更低pH的酸度均不耐受。與已報道菌株相比，本實驗3株乳酸菌對低pH具有較強的耐受能力。

表1 菌株的耐酸性

2.2 菌株膽鹽耐受能力

益生菌必須能耐受機體消化道內的膽鹽環境，才能定植于腸道發揮益生作用。本研究通過模擬機體消化環境下的膽鹽濃度，考察菌株在腸道中的存活能力。由表2結果可見，供試菌株在不含膽鹽的MRS培養基中，培養3 h后的菌數均能達到8 lg CFU/mL以上，在含0.3%、0.5%、1.0%的牛膽鹽培養基中，生長狀況良好，有不同程度的耐膽鹽性。在0.3%膽鹽濃度的培養基中培養3 h后，C12和C26菌株活菌數均高于7 lg CFU/mL，C40菌株活菌數最低且菌株存活率最低。在膽鹽濃度為0.5%和1.0%時，培養3 h后，C12、C26活菌數都在6 lg CFU/mL以上，菌株存活率均在78%以上，說明這兩株菌的膽鹽耐受能力較強。相比之下，C40在膽鹽濃度為0.5%和1.0%的培養基中活菌數較低，難以維持較高的存活率。結果表明，供試菌株均隨著膽鹽濃度的增加，活菌數有不同程度的降低，菌株C12和C26具有較強的膽鹽耐受能力，能適應人體內的膽鹽環境，定植于腸道中發揮有益作用。這與一些植物乳桿菌具有較強的膽鹽耐受能力相一致。例如王歡[16]考察了植物乳桿菌的耐膽鹽能力，結果表明植物乳桿菌對0.3%膽鹽有較強的耐受能力，菌株存活率可達到77.19%。JULIUS[17]研究發現傳統發酵乳制品中分離出的乳桿菌，在0.3%膽鹽的培養基中存活率能達到50%～84%。

表2 菌株的耐膽鹽性

2.3 菌株表面疏水性

疏水性能反映出細菌和腸道上皮細胞相互作用能力的強弱。研究表明，植物乳桿菌對宿主腸道的黏附能力與表面疏水性呈正相關性。試驗中采用二甲苯和乙酸乙酯用于檢測菌株表面對電子的接受能力，三氯甲烷用于檢測菌株表面蛋白供給電子能力。結果表明，各菌株對二甲苯的疏水性較高并對三氯甲烷的疏水性較低，說明所有菌株的接受電子能力均強于供給電子能力。圖1結果顯示，供試菌株對二甲苯、氯仿和乙酸乙酯3種有機溶劑的表面疏水性存在較大差異。菌株LGG對二甲苯、乙酸乙酯和三氯甲烷的疏水性分別為24.37%、18.16%和30.95%。與對照菌株鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)LGG相比，供試菌株對二甲苯均有較好的疏水性(P<0.05)，疏水率均高于45%。與LGG相比C40對乙酸乙酯的吸附能力較低(<20%)，表明其接受電子的能力較弱，C12、C26的疏水率分別為17.45%、24.77%，但均低于對二甲苯的疏水率。供試菌株對三氯甲烷的吸附能力均較低(<25%)。

圖1 菌株的疏水性Fig.1 The hydrophobic ratio of L. plantarum strains注:數據上標含有*、#或&表示與LGG組相比差異較顯著(P<0.05)；含**表示與LGG組相比差異極顯著(P<0.01)。

2.4 菌株羥自由基清除能力

羥自由基是一種對機體毒性最強、危害最嚴重的活性氧自由基，它通過電子之間的轉移、脫氫以及加成等方式與機體多種分子作用，損傷細胞大分子進而影響細胞的正常生理功能[18-19]。因此物質對羥自由基清除能力能夠反映其抗氧化性能。本研究采用Fenton反應測定供試菌株對羥自由基的清除能力，并與LGG進行比較。結果如圖3所示，3株供試菌株和LGG對羥自由基均具有一定的清除作用，但各菌株對羥自由基的清除能力存在較大差異。隨著菌株濃度的增加，對羥自由基清除能力增加，當菌液濃度為109CFU/mL時，供試菌株對羥自由基的清除率在18.26%～31.15%之間不等，均明顯低于LGG(50.77%)的清除率(P<0.05)。隨著菌液濃度增加，菌株清除羥自由基的能力增強，當菌液濃度為1010CFU/mL時，試驗菌株的清除率在40.44%～50.15%之間，而LGG的清除率為53.50%。低濃度的C40對羥自由基的清除較明顯，高濃度的C26對羥自由基的清除率明顯。

圖3 菌株清除羥自由基的能力Fig.3 Hydroxyl radical scavenging ability of L. plantarum strains注:數據上標含有*或#表示與LGG組相比差異較顯著(P<0.05)；含**或##表示與LGG組相比差異極顯著(P<0.01)。

2.5 菌株DPPH清除能力

DPPH是一種穩定存在于有機溶劑的自由基，乳酸菌對DPPH自由基的清除率，能反映出菌株對過氧化自由基、烷自由基或脂質自由基的清除能力[10,20-22]。由圖4分析可知，供試菌株和LGG對DPPH自由基均具有一定的清除作用。隨著菌株濃度的增加，對DPPH清除能力增加，當菌液濃度為109CFU/mL時，菌株DPPH清除率在9.39%～22.60%之間不等，對照菌株LGG的清除率為11.72%，C40對DPPH自由基的清除作用顯著高于LGG(P<0.05)，清除率最低的菌株是C26，其清除率為9.39%。菌液濃度為109CFU/mL相比，菌液濃度為1010CFU/mL時3株供試菌株的DPPH清除作用明顯提高。當菌液濃度為1010CFU/mL時，DPPH清除率在31.09%～46.03%之間不等，菌株C26的DPPH自由基清除能力低于LGG(37.42%)，其他2株菌清除能力高于LGG，其中C40的清除能力顯著高于LGG(P<0.05)，DPPH自由基清除率46.03%。

圖4 菌株清除DPPH自由基的能力Fig.4 DPPH free radical scavenging ability of L. plantarum strains注:數據上標含有*或#表示與LGG組相比差異較顯著(P<0.05)；含**或##表示與LGG組相比差異極顯著(P<0.01)。

2.6 菌株超氧陰離子清除能力

由圖5分析可知，供試菌株和LGG對超氧陰離子均具有一定的清除作用。隨著菌株濃度的增加，對超氧陰離子清除能力增加，當菌液濃度為109CFU/mL時，LGG的清除率為28.74%，3株供試菌株的清除率在5.50%～17.97%之間不等，C26對超氧陰離子的清除率較高；當菌液濃度為1010CFU/mL時，供試菌株對超氧陰離子的清除率明顯提高，清除率在17.99%～38.17%之間不等，其中C26的清除能力(38.17%)高于LGG。

圖5 菌株清除超氧陰離子的能力Fig.5 Superoxide anion scavenging ability of L. plantarum strains注:數據上標含有*或#表示與LGG組相比差異較顯著(P<0.05)；含**或##表示與LGG組相比差異極顯著(P<0.01)。

3 結論

本文分析了3株奶豆腐來源植物乳桿菌的益生特性，結果表明3株實驗菌株對強酸和高膽鹽具有較強的耐受能力，并具有較強的表面疏水性。功能特性分析表明3株菌株具有較好抗氧化活性。綜上所述，植物乳桿菌C12、C26、C40均具有較好的益生特性，可作為今后開發功能性產品的潛在益生菌資源。

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Probiotic properties ofLactobacillusplantarumstrains isolated from Dairy Toufu

LYU Guan-wei1, DUAN Cui-cui2, GAO Lei2, LUAN Chang2,ZHAO Yu-juan2, NIU Chun-hua2, LI Sheng-yu2*

1(Clinical Medicine Department, Changchun Medical College, Changchun 130031, China)2(Institute of Agro-food Technology, Jilin Academy of Agricultural Sciences, Changchun 130033, China)

ThreeLactobacillusplantarumstains isolated form Dairy Toufu were taken as the object of this study. It analyzed the acid and bile salt resistance, surface hydrophobicity and anti-oxidation activityinvitroso as to evaluate their probiotic properties. The results showed that the three strains presented better tolerances to acid and bile salt and could maintain higher activities. All the strains manifested stronger hydrophobicity to p-xylene but weak hydrophobicity to chloroform. All the three strains possessed preferable antioxidant activity.

probiotics;Lactobacillusplantarum; tolerance；anti-oxidant activity

碩士研究生(李盛鈺教授為通訊作者，E-mail：lisy720@126.com)。

國家現代農業(奶牛)產業技術體系建設專項(CARS-37)；長春市產學研協同創新示范點建設專項項目(16CX20)；吉林省科技型中小企業創新創業資金項目(20160308089HJ)；吉林省重點科技攻關項目(20170204030N Y)

2017-01-05，改日期：2017-03-14

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201706022