冷藏鰱魚優勢腐敗菌致腐能力的初步分析

李婷婷，陳思，李歡，趙前程，馬堃，勵建榮*

1(大連民族大學 生命科學學院，遼寧 大連，116600)2(西南大學 食品學院，重慶，400715)3(渤海大學 食品科學與工程學院，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心，遼寧 錦州，121013)4(大連海洋大學 食品科學與工程學院)，遼寧 大連，116600)

冷藏鰱魚優勢腐敗菌致腐能力的初步分析

李婷婷1, 2，陳思3，李歡3，趙前程4，馬堃1，勵建榮3*

1(大連民族大學 生命科學學院，遼寧 大連，116600)2(西南大學 食品學院，重慶，400715)3(渤海大學 食品科學與工程學院，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心，遼寧 錦州，121013)4(大連海洋大學 食品科學與工程學院)，遼寧 大連，116600)

為探究鰱魚腐敗菌(熒光假單胞菌、腐敗希瓦氏菌和溫和氣單胞菌)對冷藏鰱魚的致腐能力，以接種鰱魚腐敗菌(熒光假單胞菌、腐敗希瓦氏菌和溫和氣單胞菌)的無菌鰱魚塊為研究對象，通過定期測定其在4 ℃貯藏過程中的感官、TVB-N值、TMA值、電導率等新鮮度指標以及腐敗菌的變化情況，并以腐敗菌生長動力學參數和腐敗代謝產物產量因子(YTVB-N/CFU和YTMA/CFU)為指標，探討冷藏過程中鰱魚腐敗菌的腐敗能力。研究表明，接種3種腐敗菌的無菌魚塊腐敗速度明顯優于無菌對照組；腐敗希瓦氏菌的腐敗能力最強，熒光假單胞菌的YTMA/CFU較低。3種腐敗菌都有一定的腐敗能力，但在較高數量時才會出現明顯的致腐作用。

鰱魚；腐敗菌；產量因子；腐敗能力

鰱魚(Hypophthalmichtysmolitrix)作為中國著名的四大家魚之一，養殖產量常年位于淡水魚類前三位。鰱魚肉質鮮嫩，含有豐富的蛋白質、氨基酸、脂肪等營養物，其中粗蛋白含量約為16.5%，有人體必需的8種氨基酸及嬰幼兒所必需的組氨酸[1-2]。近年來，鰱魚加工業發展十分迅速，鰱魚肉色白、價格低廉、凝膠性能好，是非常適合用于工業化加工的淡水魚種。然而，由于鰱魚水分含量高，富含各種營養物質，在冷鏈物流和銷售過程非常容易產生品質劣變。參與魚類腐敗的只有部分優勢細菌能大量增殖。占據主導地位并最終導致魚類腐敗變質，這些產生腐敗代謝產物(臭味、異味、顏色)的優勢微生物被稱為特定腐敗菌(Specific Spoilage Organism, SSO)[3]。研究表明，在有氧冷藏條件下，腐敗希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)多為海洋魚類的SSO，假單胞菌多為淡水魚的SSO[3-5]。

希瓦氏菌是嗜冷的革蘭氏陰性菌，腐敗活性強，在低溫環境下能夠生長繁殖，并逐漸占主導地位，能把氧化三甲胺(trimethylamine oxide，TMAO)還原為三甲胺(trimethylamine，TMA)，產生硫化氫[6]。假單胞菌屬同樣是典型的低溫腐敗菌，具有很強的蛋白質和脂肪分解能力，腐敗特征表現為硫化氫味、水果或酸臭味等異味[7]。氣單胞菌在自然界中廣泛存在，在魚類等水產品常有檢出。目前，關于這3種菌致腐能力差異的研究鮮有報道，為此本研究將從冷藏鰱魚中分離得到的3種菌接種到無菌魚塊中，對其致腐能力進行測定和分析，研究結果將為進一步探究水產品致腐機制、豐富水產加工理論提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

養殖鮮活鰱魚，購自錦州林西水產市場，平均重量 1.5～1.8 kg。假單胞菌CFC選擇性培養基、營養瓊脂、營養肉湯培養基、鐵瓊脂、氣單胞菌培養基、假單胞菌CFC選擇性培養基添加劑、氣單胞菌選擇性培養基，青島海博生物科技有限公司；超微量ATP(Ca2+)試劑盒，南京建成生物工程研究所；三甲胺、磷酸鹽、8-苯胺基-1-萘磺酸銨(ANS)試劑等，均為分析純，購于天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

PL602-L電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；FOSS凱氏定氮，丹麥福斯公司；冷凍離心機，德國Beckman制造公司；LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；LRH-150生化培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；JHG-Q60-P100實驗室均質機，上海融合機械設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鰱魚無菌魚片的制備

參照HERBERT[8]的方法制備無菌魚塊。鮮活鰱魚，冰水致死，清洗后，無菌操作切取鰱魚背部魚肉，去皮，再用滅菌剪刀修剪魚塊至大小形狀一致(25～35 g/塊)后，將鰱魚魚塊使用無菌水清洗，用無菌濾紙擦拭魚塊上水分，再用75%的酒精擦拭魚塊，將制備好的魚塊放在酒精燈火焰周圍灼燒1～2 s。上述所有無菌操作均在無菌操作臺中進行。對制備好的無菌魚塊進行菌落總數測定(<102CFU/g)，符合實驗要求。

1.3.2 細菌菌懸液的制備

參考李學英等[5]的方法。菌種均保藏于-80 ℃超低溫冰箱中，將從腐敗鰱魚中分離鑒定的優勢腐敗菌腐敗希瓦氏菌、熒光假單胞菌、溫和氣單胞菌活化后，接種到營養瓊脂培養基表面劃線接種，25 ℃培養，挑取典型菌落用營養肉湯培養基25 ℃過夜培養。用麥氏比濁法制備108CFU/mL菌液，無菌生理鹽水稀釋100倍后備用。

1.3.3 接種及貯藏

無菌操作臺中，將無菌鰱魚魚塊分為4組，其中試驗的3組放入制好的3種菌懸液中，對照組放入無菌生理鹽水中，浸泡10 s，拿出瀝干，裝入滅菌的食品袋中，封口后置于4 ℃冰箱中貯藏。

1.3.4 TVB-N測定

TVB-N值測定依照SC/T 3032—2007《水產品中揮發性鹽基氮的測定》中的微量擴散法測定。

1.3.5 TMA測定

參照GB/T 5009.179—2003《火腿中三甲胺氮的測定》和許龍福等[9]的修訂方法，采用苦味酸法測定。

1.3.6 電導率測定

取鰱魚魚肉10 g，加蒸餾水90 mL至燒杯中，用均質機均質，攪拌30 min后過濾，所得濾液用電導率儀進行測定。

1.3.7 Ca2+-ATPase測定

參照超微量ATP(Ca2+)測試盒的操作說明進行測定。

1.3.8 表面疏水性

采用ANS熒光探針法[10]測定表面疏水性，將樣品用20 mmol/L含0.6 mol/L KCl的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)稀釋至0～1 mg/mL，加入20 μL 8 mmol/L ANS后混合均勻，避光靜置10 min，熒光分光光度計測定條件為：激發波長374 nm，發射波長250～500 nm，狹縫10 nm。以熒光強度對蛋白濃度作圖，曲線初始斜率即為蛋白質分子的表面疏水性指數。

1.3.9 微生物動力學模型

用修正的Gompertz描述微生物的生長動態：

(1)

式中：t為時間，h；N(t)為時間t時的菌數；Nmax，N0為最大和初始菌數，CFU/g；μmax為最大生長速率，h-1；λ為生長延滯時間。

1.3.10 腐敗能力的定量分析

以單位腐敗菌產生的腐敗代謝產物，作為腐敗能力的定量指標，腐敗代謝產物因子(YTVB-N/CFU和YTMA/CFU)如下所示[4]：

(2)

(3)

式中：產量因子YTVB-N/CFU/(mg TVB-N/CFU)；YTMA/CFU/(mgTMA/CFU)；N0為初始菌落數，CFU/g；NS為貨架期終點時的腐敗菌菌落數即最小腐敗菌落數，CFU/g；(TVB-N)0、(TVB-N)S為初始點和貨架期終點時的TVB-N量，mg/100g；(TMA)0、(TMA)S為初始點和貨架期終點時的TMA量，mg/100g。

2 結果與分析

2.1 TVB-N值分析

圖1為接種不同菌種的鰱魚無菌魚塊在4 ℃貯藏過程中的TVB-N值變化圖。

圖1 接種不同菌種的無菌魚塊TVB-N值變化趨勢圖Fig.1 Changes of TVB-N of different bacterial strains inoculated in sterile silver carp fillets

魚類在貯藏過程中容易受到微生物和酶的作用使蛋白質產生分解，生成氨以及胺類等堿性含氮物質，有研究表明[11]，微生物增殖與TVB-N值的增加具有很好的一致性。從圖1可以看出，接種熒光假單胞菌的魚塊貯藏初期TVB-N值變化不明顯，2 d后呈直線上升趨勢，可能是由于熒光假單胞菌經過短暫的延滯期后快速生長，腐敗產物大量積累。接種腐敗希瓦氏菌的魚塊TVB-N的累積速度僅次于熒光假單胞菌，但高出溫和氣單胞菌和對照組。丁婷等[12]對0 ℃冷藏三文魚優勢腐敗菌的致腐能力進行分析，研究發現熒光假單胞菌具有較強的致腐能力。

2.2 TMA值分析

氧化三甲胺(trimethylamine oxide，TMAO)廣泛分布于海產硬骨魚類的肌肉中，是海產硬骨魚類具有的一種特殊鮮味物質，淡水魚中含量較少，每100 g魚肉中一般含有5～20 mg TMAO[13]。接種不同菌種的鰱魚無菌魚塊在4 ℃貯藏過程中的TMA值變化如圖2所示。從圖2可以看出，TMA值隨著貯藏時間的延長而上升，由于淡水魚類TMAO含量較少，所以整體TMA值較低。其中接種腐敗希瓦氏菌和溫和氣單胞菌的魚塊TMA值呈快速增長趨勢，而接種熒光假單胞菌的魚塊TMA變化趨勢和對照組幾乎一致，明顯慢于腐敗希瓦氏菌和溫和氣單胞菌。從TMA值變化可以說明假單胞菌還原TMAO能力較弱，與對照組相似，腐敗希瓦氏菌和溫和氣單胞菌還原TMAO能力要強于熒光假單胞菌，這與MILLER[14]、GRAM[15]等的研究成果相一致。

圖2 接種不同菌種的無菌魚塊TMA值變化趨勢圖Fig.2 Changes of TMA of different bacterial strains inoculated in sterile silver carp fillets

2.3 電導率分析

由于微生物蛋白酶的作用，蛋白質、脂肪等分解成大量小分子物質，產生大量離子，從而使魚肉浸出液產生大量具有導電能力的物質[16]。貯藏時間越長，魚肉的分解產物越多，導電能力越強，新鮮度越差。接種不同菌種無菌魚塊的電導率如圖3所示。從圖3可以看出，接種腐敗希瓦氏菌魚塊的電導率值明顯高于其他3組，可以說明腐敗希瓦氏菌蛋白酶具有較強的分解活性。而接種溫和氣單胞菌魚塊的電導率略微高于熒光假單胞菌，空白對照組電導率值最小，說明三種微生物在增殖過程中都會分解營養物質產生離子致使鰱魚新鮮度下降。SHEN等[17]對不同貯藏溫度下虹鱒魚魚片的電導率進行分析，研究發現隨著貯藏時間的延長，電導率呈上升趨勢，而貯藏溫度越低電導率增加越緩慢，可能是低溫抑制微生物的活動，從而降低了營養物質的分解速率。

圖3 接種不同菌種的無菌魚塊電導率值變化趨勢圖Fig.3 Changes of electric conductivity of different bacterial strains inoculated in sterile silver carp fillets

2.4 Ca2+-ATPase活性分析

肌球蛋白是肌原纖維蛋白的主要部分，ATPase位于肌球蛋白的頭部，當肌球蛋白在冷藏過程中發生變性時，ATPase活性已因受到影響而隨之變化，從而失去活性[18]。因此Ca2+-ATPase活性是評定蛋白質品質的重要指標，測定ATPase活性的變化可以反映出肌球蛋白的變化情況，繼而反映出肌肉的變化情況[19]。接種不同菌種無菌魚塊的Ca2+-ATPase活性如圖4所示。由圖4可知，整個貯藏過程中鰱魚Ca2+-ATPase活性呈下降趨勢，其中，接種溫和氣單胞菌和熒光假單胞菌的無菌魚塊Ca2+-ATPase活性在貯藏中后期與對照組相比出現明顯下降，而接種腐敗希瓦氏菌的魚塊在貯藏中期Ca2+-ATPase活性甚至略高于對照組，說明微生物活動可能不是引起鰱魚Ca2+-ATPase活性變化的主要原因。

圖4 接種不同菌種的無菌魚塊Ca2+-ATPase活性變化趨勢圖Fig.4 Changes of Ca2+-ATPase activity of different bacterial strains inoculated in sterile silver carp fillets

2.5 表面疏水性指數分析

低溫貯藏過程中魚肉蛋白質的變性還表現為蛋白質疏水性的變化。維持蛋白質三級結構穩定的作用力是疏水基的作用，蛋白質疏水性能夠反映蛋白質分子疏水性氨基酸的相對含量，因而可用它來表征蛋白質的變性程度[20]。接種不同菌種魚塊的表面疏水性指數變化如圖5所示，在整個貯藏過程中，表面疏水性指數先快速上升后趨于平緩。其中，接菌魚塊表面疏水性指數在貯藏6 d后趨于平緩，對照組在貯藏8 d后趨于平緩，可以說明微生物繁殖和活動可以明顯加快蛋白質的變性速度，導致魚肉新鮮度下降。

圖5 接種不同菌種的無菌魚塊表面疏水性指數變化趨勢圖Fig.5 Changes of surface hydrophobicity of different bacterial strains inoculated in sterile silver carp fillets

2.6 菌落總數分析

接種3種腐敗菌后，鰱魚魚塊的菌落總數的變化如圖6所示。從圖6可以看出，經過75%酒精擦拭的對照組魚塊菌落總數小于102CFU/g，說明無菌魚塊符合標準。接種后的腐敗希瓦氏菌、熒光假單胞菌和溫和氣單胞菌經過短暫的延滯期后均快速增長，在這個過程中腐敗產物大量積累，致使魚肉腐敗變質。

表1為3種腐敗菌用修正的Gompertz方程擬合所得的動力學參數，回歸系數R2都在0.98以上，說明擬合精度較高，其中熒光假單胞菌的延滯期明顯較長，這也解釋了接種熒光假單胞菌的魚塊各種指標貯藏初期變化較慢。

圖6 接種不同菌種的無菌魚塊菌落總數變化趨勢圖Fig.6 Changes of total viable counts of different bacterial strains inoculated in sterile silver carp fillets

表1 鰱魚腐敗菌4 ℃貯藏過程中生長動力學參數

2.7 腐敗菌致腐能力分析

表2是接種熒光假單胞菌、腐敗希瓦氏菌和溫和氣單胞菌的無菌魚塊在4 ℃貯藏過程中初始點及腐敗點的菌落總數、TMA值、TVB-N值。通過公式(2)、公式(3)可以計算得出3種腐敗菌在無菌鰱魚魚塊中的產量因子YTVB-N/CFU和YTMA/CFU。

表2 接菌魚塊貯藏過程中初始點和腐敗點的TVB-N值、TMA值和菌落數

表3為熒光假單胞菌、腐敗希瓦氏菌和溫和氣單胞菌接種無菌魚塊后的產量因子。其中，腐敗希瓦氏菌的兩項產量因子最高，說明腐敗希瓦氏菌具有很強的致腐能力，而熒光假單胞菌的TMA產量因子最低，這與許振偉[21]等的研究結果相一致。溫和氣單胞菌的TVB-N和TMA產量因子并不弱于熒光假單胞菌。由于3種腐敗菌的產量因子都很小，必須在數量較高時才能發揮作用。

表3 三種腐敗菌的產量因子

3 結論

以鰱魚無菌魚塊為介質，接種鰱魚的特定腐敗菌熒光假單胞菌，腐敗希瓦氏菌和溫和氣單胞菌，研究TVB-N值、TMA值、菌落總數等指標的變化情況，并用修正的Gompertz對腐敗菌的生長動態進行分析。結果顯示，接種腐敗菌的魚塊新鮮度下降速度明顯優于無菌對照組。以TVB-N和TMA為腐敗產物定量指標對3種腐敗菌進行致腐能力分析，結果發現腐敗希瓦氏菌致腐因子明顯較高，熒光假單胞菌的TMA產量因子較低。3種腐敗菌都具有一定的致腐能力，但都需要微生物積累到一定數量才會產生明顯的致腐效果。

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Analysis of spoilage ability of specific spoilage organism in refrigerated silver carp

LI Ting-ting1,2, CHEN Si3, LI Huan3, ZHAO Qiancheng4, MA Kun1, LI Jianrong3*

1(College of Life Science, Dalian Minzu University，Dalian 116600，China)2(College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715,China)3(College of Food Science and Technology, Bohai University,National & Local Joint Engineering Research Center of Storage, Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products, Jinzhou 121013,China)4(College of Food Science and Engineering, Dalian Ocean University, Dalian 116023,China)

To explore the spoilage abilities of specific spoilage organismPseudomonasfluorescens,AeromonassobiraandShewanellaputrefacienson refrigerated silver carp, freshness indexes including sensory evaluation, TVB-N, TMA, electric conductivity and total viable counts of sterile silver carp tissue respectively inoculated with these three kinds of spoilage bacteria were measured periodically. The yield factor for production of metabolite and the cell concentration at off-odour period were quantitatively measured. Results showed the freshness of sterile silver carp tissue blocks inoculated with spoilage bacteria deteriorated obviously compared with the sterile control group.Shewanellaputrefacienshad the strongest spoilage ability, and YTMA/CFUofPseudomonasfluorescenswas lower than that ofShewanellaputrefaciensandAeromonassobira. Three kinds of spoilage bacteria had certain spoilage abilities. However, the spoilage effect was not significant until the bacteria reached high counts.

Silver carp; specific spoilage organisms; yield factor; spoilage ability

博士，副教授(勵建榮教授為通訊作者，E-mail：lijr6491@163.com)。

國家自然科學基金(31301572，31471639)；重慶市項目博士后資助 (Xm2014041)；國家科技支撐計劃課題(2015BAD16B08)

2016-07-23，改回日期：2016-08-28

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201706023