動態高壓微射流預處理對甘薯葉多酚提取物抗氧化性的影響機制初探

張露，盧遇，涂宗財, *，謝星，沙小梅，王輝，傅志豐

1(江西師范大學 生命科學學院功能有機小分子教育部重點實驗室，江西 南昌，330022)2(南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌，330047)

動態高壓微射流預處理對甘薯葉多酚提取物抗氧化性的影響機制初探

張露1，盧遇1，涂宗財1, 2*，謝星2，沙小梅1，王輝2，傅志豐2

1(江西師范大學 生命科學學院功能有機小分子教育部重點實驗室，江西 南昌，330022)2(南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌，330047)

動態高壓微射流(DHPM)是一種新興的高壓均質技術，有研究表明，DHPM能有效提高甘薯葉提取物的體外抗氧化活性，但其作用機制還不明確，因此文中旨在探索DHPM提高甘薯葉提取物抗氧化活性的作用機制。研究發現，DHPM提取和輔助提取均能有效降低物料顆粒的平均粒度、粒徑分布范圍，增加顆粒的比表面積和平均孔徑，提高甘薯葉多酚和黃酮的得率，增強提取物的DPPH·清除能力和還原能力。而甘薯葉多酚溶液再經DHPM處理對提取液中總酚、總黃酮含量以及體外抗氧化活性無顯著影響(P>0.10)。因此，DHPM是通過降低物料粒度、增加物料比表面積和孔徑提高甘薯葉總酚和總黃酮的得率，最終提高提取物的體外抗氧化能力，它不會引起甘薯葉中多酚類化合物的氧化降解。

動態高壓微射流；甘薯葉；抗氧化；多酚；提取

甘薯是世界上第7大主要糧食作物之一，甘薯葉是甘薯生產和加工的主要副產物，其多酚含量高于甘薯藤、甘薯皮、甘薯塊根和大部分食用蔬菜。甘薯葉的抗氧化活性高且富含三、二咖啡酰奎寧酸和香豆酰奎寧酸等酚酸類化合物，以及槲皮素、蘆丁、山奈酚等黃酮類化合物[1-4]。甘薯葉提取物具有多種保健效果，如抗誘變、抗癌、抗糖尿病、抗炎、抗氧化和抗高血壓活性等[5-6]。

動態高壓微射流(dynamic high pressure microfluidization，DHPM)是一種新興的動態均質技術，通過高頻振蕩、高速剪切、空穴、瞬時高壓和瞬時低壓等作用破碎、均質物料，已經被廣泛應用于食品組分改性、液體食品、脂質體制備和生物活性成分提取。作為改性方法，DHPM已被廣泛應用于蛋白質、糖、淀粉和膳食纖維的改性。例如，增加大豆分離蛋白的溶解性、乳化穩定性、表面疏水性和二硫鍵的含量[7]，促進卵清蛋白的糖基化[8]，降低高甲氧基果膠的表觀黏度、平均分子質量和粒度[9]。在液體食品加工和脂質體加工方面，CIRON等[10]發現，150 MPa DHPM處理的牛奶具有更小的顆粒粒度，制備的酸奶更易于形成具有脂肪球的蛋白網絡結構響；作為輔助提取手段，DHPM是一種新興的植物中活性成分提取方法，具有提取條件溫和、提取率高、提取時間短的優勢，它通過降低物料粒度、增加溶劑穿透能力提高目標產物的得率，可增加荷葉多糖和甘薯葉黃酮的得率[11-12]。

本研究以橘色肉型甘薯葉為原料，研究DHPM不同壓力(0～160 MPa)2次處理和120 MPa不同處理次數(1～5)提取和輔助提取對甘薯葉中多酚和黃酮的得率、產物抗氧化活性和物料顆粒粒度、比表面積、顆粒孔徑的影響，并通過與DHPM相同條件后處理對提取物的多酚含量和抗氧化性的影響相比較，研究DHPM提高甘薯葉多酚得率和抗氧化活性的作用機理。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

2015年10月初，新鮮甘薯葉采集于江西省宜春市，接著用自來水洗干凈，45 ℃烘干，粉碎，過200目篩處理后于4 ℃保存。Folin-Ciocalteu試劑、Na2CO3、AlCl3、NaOH、NaNO3、K3[Fe(CN)6]、三氟乙酸(TFA)、FeCl3等：分析純，阿拉丁；沒食子酸、蘆丁、ABTS(2,2’-azino-bis (3-ethyl-benzthiazoline-6-sulphonic acid)和1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)：分析純，Sigma。

1.2 儀器與設備

TGL-10C高速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；GYB60-6S高壓均質機，上海東華高壓均質機廠；M-110EH動態高壓微射流，美國Microfluidics公司；ML104電子天平，梅特勒托利多儀器(上海)有限公司；T6新世紀紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；LA-950激光散射粒度分布分析儀，日本HORIBA公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 甘薯葉多酚DHPM輔助提取物和DHPM提取

參照李志等[13]的條件提取甘薯葉中的多酚類化合物。取55 g甘薯葉粉末，用2 200 mL體積分數70%乙醇混勻后高壓均質機40 MPa處理2次，然后分別量取10份200 mL均質后的懸浮液。其中5份樣品分別用DHPM(M-110EH，Microfluidics Company，USA)于60、80、100、120、140和160 MPa處理2次，4份樣品分別于120 MPa處理1、3、4和5次，1個樣品不做任何處理，為減少沖洗反應腔過程中乙醇對樣品的稀釋作用，每個樣品在DHPM處理后只接收中間100 mL出腔樣品。接著將每個樣品平均分為2份(每份50 mL)，1份于直接4 000 r/min離心10 min，1份于75 ℃浸提2 h后再離心，收集上清液并定容至50 mL。最后分別得到甘薯葉多酚的DHPM提取物和DHPM輔助浸提提取物，并分別簡寫為DHPME和DHPMAE。提取實驗重復3次。

1.3.2 DHPM后處理

取27.5 g甘薯葉粉末，用1 100 mL體積分數70%乙醇混勻后于75 ℃提取2 h，4 000 r/min離心10 min后收集上清液。然后分別量取10份100 mL的提取液，其中5份樣品分別于DHPM 80、100、120、140和160 MPa處理2次，4份樣品分別于120 MPa處理1、3、4和5次，1個樣品為空白對照組。每個樣品在DHPM處理后只接收中間50 mL出腔樣品，最后將所有樣品定容至50 mL。實驗重復3次。

1.3.3 總酚含量測定

采用Folin-Ciocalteu法測定提取物中總酚的含量[17]。用0.5 mL體積分數70%乙醇代替樣品的體系為空白，用蒸餾水代替Na2CO3的體系為樣品空白(扣除樣品的顏色)。以沒食子酸(10～60 μg/mL)為標品計算總酚含量，結果表示為毫克沒食子酸當量每克干物質(mg GAE/g DM)。

1.3.4 總黃酮含量測定

參照李光等的方法[14]，采用AlCl3-NaOH-NaNO3法測定樣品中總黃酮的含量。2.0 mL體積分數70%乙醇代替樣品的體系為空白，用蒸餾水代替AlCl3的體系為樣品空白Aj(扣除樣品顏色)。以蘆丁為標品(0～54.6 μg/mL)繪制標準曲線，結果表示為毫克蘆丁當量每克干物質(mg RT/g DM)。

1.3.5 DPPH·清除能力測定

將所有樣品用體積分數70%乙醇稀釋至2 mg DM/mL，然后根據前期實驗采用的方法測定樣品對DPPH·的清除能力[2]。IC50是清除50% DPPH·所需要的樣品濃度，以BHA為陽性對照，結果表示為毫克BHA當量每克干物質(mg BHA/g DM)，所有實驗重復3次。

1.3.6 還原能力測定

參照前期研究采用的方法測定所有樣品的還原能力[15]。吸光值越大表示樣品的還原能力越強。IC0.5指使反應體系的吸光值為0.500所需要的樣品濃度，以BHA為陽性對照，結果表示為毫克BHA當量每克干物質(mg BHA/g DM)，所有實驗重復3次。

1.3.7 粒度和比較面積測定

分別稱取1.0 g 1.3.1中離心后得到的DHPM不同壓力和次數處理的甘薯葉粉末殘渣，用10 mL蒸餾水溶解混勻后，采用LA-950激光散射粒度分布分析儀(HORIBA，日本)測定DHPM處理對甘薯葉粉末顆粒的平均粒度、比表面積和孔徑的影響。測定時，取2.0 mL樣品于樣品池中，折光率設為1.33，溶液循環速度為5次/s，每個樣品重復測3次。

1.4 數據分析

所有實驗重復3次，結果以(平均值±標準偏差)表示。通過Origin 8.0(OriginLab Co.，US)的多項曲線擬合方程對樣品濃度對清除率/吸光值的曲線進行擬合計算DPPH·的半抑制濃度，以及還原能力的IC0.5值。采用一維ANOVA(SPSS 13.0)分析數據間的顯著性差異，P<0.05認為數據間存在顯著性差異，所有圖譜采用Origin 8.0軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 總酚含量分析

DHPM不同壓力和次數輔助浸提(DHPMAE)和DHPM提取(DHPME)對甘薯葉多酚和黃酮提取率的影響如圖1所示。

由圖1可知，DHPMAE對甘薯葉多酚和黃酮的提取效率高于直接DHPME，處理壓力為0～160 MPa時，其多酚得率分別為16.14～18.69和14.04～17.79 mg GAE/g DM，黃酮得率分別為12.91～16.00和15.21～21.90 mg RE/g DM。這可能是因為DHPM提取過程中，物料與萃取溶劑間的接觸時間不超過1.5h，物料中的多酚類化合物不能充分溶解到溶劑中[13, 15]。DHPM處理后再70 ℃浸提2 h一方面增加了甘薯葉細胞中多酚類化合物向溶劑中轉移的時間，另一方面，DHPM處理使物料顆粒降低，提取溫度增加，物料與溶劑接觸的表面積增加，細胞中的內容物向溶劑中轉移的速度和效率也被大大提高[11]，因此，DHPMAE對甘薯葉多酚和黃酮的提取率大大高于DHPME。

圖1 DHPM輔助浸提和DHPM提取對甘薯葉多酚(A)、黃酮(B)得率的影響Fig.1 Effect of DHPM assisted-extraction and DHPM extraction on the yield of Ipomoea batatas leaves polyphenols and flavonoids

DHPMAE 60 MPa處理對甘薯葉多酚的提取效率無顯著性影響(P>0.05)，處理壓力為120 MPa時具有最高的多酚得率，為18.62 mg GAE/gDM。當DHPM處理壓力由100 MPa升到160 Mpa時，處理壓力的變化對總酚的得率不存在顯著性影響(P>0.05)。但甘薯葉黃酮的得率隨DHPM處理壓力的增加(60～100 MPa)逐漸升高，且處理壓力達100～160 MPa時，DHPMAE和DHPME兩種提取方法對甘薯葉黃酮得率的影響不同，前者逐漸升高，后者無顯著性差異(P>0.05)，DHPM 160 MPa輔助提取制備的甘薯葉提取物具有最高的總黃酮含量，達21.90 mg RE/g DM，該得率高于前期測得的最大得率(16.51 mg RE/g DM)[2]，但低于李志[13]等測得的3.5%～5.44%，這可能是由于原料和提取方法的差異所產生的。

從圖1可以看出，當DHPM處理壓力為120 MPa時，處理次數對甘薯葉多酚和黃酮的提取效率的影響不同。DHPME提取物中的總酚含量隨處理壓力的增加逐漸增加，但當處理次數超過2次后，處理次數的增加對總黃酮的得率無顯著性影響(P>0.05)。DHPMAE提取物中的總酚含量隨處理次數的增加呈先增加后不變的趨勢，處理次數超過2次后，總酚和總黃酮的得率均無顯著性差異。這可能是因為，對于DHPM提取而言，處理次數越多，溶劑與甘薯葉細胞中的多酚類化合物的置換時間越長；另外，微射流處理次數越多，物料顆粒越小[11, 16]，溶劑與物料顆粒的接觸面積越大，從而使多酚的得率越高。對于DHPMAE而言，由于0 MPa DHPMAE制備樣品中的總酚含量高于DHPME 80～160 MPa 2次處理制備的樣品，且總黃酮含量與后者相近，因此，70 ℃，2 h浸提對紅薯葉多酚和黃酮的萃取效率高于單獨DHPM提取，此時增加DHPM處理壓力和次數對提高多酚和黃酮的萃取效果的作用就會減弱，李志等[13]發現，當DHPMAE時間超過90 min后，總黃酮含量的提取率與萃取時間不成正比關系。

2.2 體外抗氧化活性分析

DHPMAE和DHPME處理壓力和次數的變化對甘薯葉提取物DPPH·清除能力和還原能力的影響如圖2所示。

A-DPPH·清除能力；B-Fe3+還原能力圖2 DHPM輔助浸提和DHPM提取對甘薯葉提取物體外抗氧化性的影響Fig.2 Effect of DHPM assisted-extraction and DHPM extraction on the antioxidant activities of Ipomoea batatas leaves extracts

由圖2可知，隨著處理壓力和次數的增加，甘薯葉樣品的DPPH·清除能力和Fe3+還原能力的變化趨勢與提取物中總酚含量的變化趨勢相似，其相關系數r分別達0.931和0.843，而與總黃酮含量的相關系數r分別為0.416和0.379。因此，酚酸為甘薯葉中起主要作用的抗氧化成分，這與前期實驗的結果一致[2, 17]。甘薯葉提取物的DPPH·清除能力隨DHPMAE和DHPME處理壓力和次數的增加均呈逐漸上升的趨勢，160 MPa 2次處理和120 MPa 5次處理的DHPMAE提取物具有最高的DPPH·清除能力清除能力(P>0.05)，清除率分別為60%和58.08%。

由圖2-B可知，DHPMAE和DHPME均能提高甘薯葉提取物的還原能力，但2種方法的影響規律不同。提取物的還原能力先隨DHPMAE處理壓力的增加而上升，壓力高于120 MPa后無顯著差異，但隨處理次數的增加先增加后下降，DHPMAE 120～160 MPa 2次處理和120 MPa 4次處理制備的樣品具有最大還原能力(P>0.05)。但是，當DHPME處理壓力高于120 MPa后，DHPM處理壓力和次數對的變化對甘薯葉DHPME樣品的還原能力無顯著影響(P>0.05)。

因此，DHPM處理能提高甘薯葉提取液的體外抗氧化能力，這與HUANG[12]和ZHANG[2]等的研究結果一致。甘薯葉提取物的體外抗氧化能力主要取決于提取物中酚酸和和黃酮的含量[2-3, 17]，那么，DHPM是通過提高提取液中多酚類化合物的含量，還是通過改變多酚類化合物的組成提高提取液的抗氧化活性？為闡述這一科學問題，本試驗采用與DHPM提取相同的條件對70 ℃浸提2 h制備的甘薯葉樣品進行處理，并分析DHPM處理對提取液中總酚、總黃酮和體外抗氧化能力的影響。結果如表1所示，由表1可知，DHPM處理壓力(60～160 MPa)和次數(120 MPa，1～5次)對提取液中總酚和總黃酮的含量均無顯著性影響(P>0.05)，對提取物的DPPH·清除能力和Fe3+還原能力的影響很小(0.05

表1 DHPM處理壓力和次數對甘薯葉提取物中總酚、黃酮含量以及抗氧化活性的影響

注：同一列右上角的不同字母(a,b,e等)代表樣品間的數值具有顯著性差異(P<0.05)。

2.3 物料粒度和比表面積分析

DHPM不同處理壓力和次數對甘薯葉粉末平均粒度、粒徑分布、平均比表面積和平均孔徑的影響如表2所示。

表2 DHPM處理壓力和次數對甘薯葉物料平均粒度、粒徑分布、平均比表面積和平均孔徑的影響

由表2可知，隨著DHPM處理壓力(60～160 MPa)的增加，物料的平均粒度和粒度標準偏差逐漸下降，分別由未處理的43.07 μm和43.27 μm減少到25.52 μm和21.81 μm；平均比表面積和平均孔徑逐漸增加，分別由未處理的8.83 cm3/g和9.09 nm增加到12.3 cm3/g和15.96 nm。DHPM 120 MPa處理次數的增加也會降低甘薯葉粉末的粒度，使物料粒度分布更加集中，物料的比表面積和平均孔徑增大，但當處理次數超過4次后，處理次數對物料的粒度和平均比表面積的影響較少(P>0.05)。圖3更加直觀地表示，DHPM處理壓力和次數的增加可使甘薯葉粉末粒度分布更加集中，平均粒度下降。因此，甘薯葉粉末的比表面積和平均孔徑越大，溶劑與物料的接觸面積越大，使多酚類化合物越容易溶解到溶劑中，從而提高了多酚和黃酮的得率，最終提高提取液的抗氧化能力。

圖3 DHPM處理壓力和次數對甘薯葉粉末粒度分布的影響Fig. 3 Effect of DHPM processing pressures and times on the particle size distribution of Ipomoea batatas leaves powders

DHPM技術細化物料的機理可能是，當甘薯葉懸濁液加速進入DHPM反應腔時，瞬時高壓和空化效應產生的高速剪切作用使甘薯葉顆粒破碎；當物料從反應腔噴出時，瞬時低壓、湍流碰撞與摩擦進一步使顆粒剪切破碎，同時，高速射流與腔壁發生高速碰撞，強化粉碎效果[18]。HUANG等[12]通過掃描電鏡發現，DHPM處理能破壞甘薯葉粉末的細胞壁結構，降低顆粒粒度、增加物料的比表面積，并使物料更加蓬松。ZHANG等的研究[15]也表明，DHPMAE能降低荷葉粉末的粒度，使物料表面更加蓬松，從而提高多糖的得率。

3 結論

隨著DHPM處理壓力(60～160 MPa)和次數(120 MPa，1～5次)的增加，多酚和黃酮的得率總體上先逐漸增加后不變；提取液的DPPH·清除能力逐漸增強，而還原能力呈先增加后不變的趨勢。DHPM 120 MPa處理2次輔助提取的樣品具有最高的總酚和還原能力，160 MPa處理兩次輔助提取的樣品具有最高的總黃酮含量和DPPH·清除能力，樣品的抗氧化能力主要取決于提取物中多酚的含量。甘薯葉粉末的平均粒度、粒徑分布范圍隨處理壓力和次數的增加逐漸下降，粉末的比表面積和平均孔徑逐漸增加。而DHPM后處理對甘薯葉多酚浸提液中總酚、總黃酮含量無顯著影響(P>0.05)，對樣品的體外抗氧化活性影響不大(P>0.10)。因此，DHPM主要是通過細化物料，提高總酚和總黃酮的得率來提高樣液的體外抗氧化能力，它不會引起甘薯葉中多酚類化合物的氧化降解，亦不會改變其結構。因此，DHPM技術可以作為一種有效的天然植物活性成分提取的方法。

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Mechanism of dynamic high pressure microfluidization assisted-extraction on the effect of antioxidant activities of polyphenols fromIpomoeabatatasleaves

ZHANG Lu1, LU Yu1, TU Zong-cai1, 2*, XIE Xing2, SHA Xiao-mei1, WANG Hui2, FU Zhi-feng2

1 (Key Laboratory of Functional Small Organic Molecule, Ministry of Education, College of Life Science, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China)2 (State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Dynamic high pressure microfluidization (DHPM) is an emerging homogenization technique with high pressure. Previous research indicated that DHPM could obviously improve theinvitroantioxidant activities (AAs) ofIpomoeabatatasleaves extracts, but the mechanism is still unknown. Therefore, this research was to investigate how DHPM increases AAs ofIpomoeabatatasleaves extracts. Results indicated that DHPM treatment could significantly decrease the average particle size and particle size distribution, and increase the specific surface area and average pore diameter ofIpomoeabatatasleaves powder. The yield of total phenolics and total flavonoids, as well as the DPPH radical scavenging ability and ferrous ion reducing power were also greatly enhanced. When the solution ofIpomoeabatatasleaves polyphenols was subjected to DHPM processing, insignificant difference was observed on the total phenolic and total flavonoids content, along with tested AAs among the post-treated samples(P>0.10). Therefore, DHPM assisted-extraction improves AAs of extracts through the increased of total phenolics and flavonoids yield, the decrease of particle size, and the increase of the specific surface area and pore diameter. The process will not cause oxidative degradation of the polyphenols inIpomoeabatatasleaves.

dynamic high pressure microfluidization;Ipomoeabatatasleaves; antioxidant activity; polyphenols；extraction

博士，講師(涂宗財教授為通訊作者,E-mail：Tuzc_mail@aliyun.com)。

國家自然科學基金(21276118)；江西省教育廳一般項目(GJJ150331)

2016-10-10，改回日期：2016-11-07

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201706028