翡翠貽貝不同醇沉物體外抗氧化活性研究

劉淑集，羅欽欽，潘裕添，劉智禹，蘇永昌，林嬌芬，陳錦權

1(福建農林大學 食品科學學院，福建 福州，350002) 2(福建省水產研究所， 福建 廈門，361013)3(閩南師范大學 菌物工程技術研究中心，福建 漳州，363000)4(福建省海洋生物增養殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門，361013)

翡翠貽貝不同醇沉物體外抗氧化活性研究

劉淑集1,2，4，羅欽欽3，潘裕添3，劉智禹2，4，蘇永昌2，4，林嬌芬3，陳錦權1*

1(福建農林大學 食品科學學院，福建 福州，350002) 2(福建省水產研究所， 福建 廈門，361013)3(閩南師范大學 菌物工程技術研究中心，福建 漳州，363000)4(福建省海洋生物增養殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門，361013)

翡翠貽貝；分級;醇沉；抗氧化

自由基，是人體生命過程中生化反應產生的中間產物，種類非常多。但是過多的自由基會對人體產生攻擊，且攻擊途徑是多方面的，會引起人體細胞、分子甚至器官受損，導致病變，從而產生各種各樣的疑難雜癥[1]。因此為了防止機體受到自由基損傷，各種抗氧化保健品的研究成為了人們的研究熱點[2]。然而由于很多工業上的抗氧化劑是人工合成，對人體產生一定的毒性。因此，利用我國豐富的資源尋求天然的、對人體無毒害的抗氧化劑成為了當下抗氧化科學研究領域的重要突破口。

迄今為止，人們對海洋生物資源的開發和糖類藥物的研究不斷增多，已有研究表明，貝類中的糖復合物是貝類體內一種含量豐富的生物活性物質，是創新型藥物和功能型保健食品的重要資源，具有良好的應用前景。例如具有抗衰老作用的波紋巴非蛤多糖、文蛤多糖等；具有抗腫瘤作用的牡蠣多糖、珠母貝糖胺聚糖等；具有抗病毒作用的牡蠣糖胺聚糖、扇貝裙邊糖胺聚糖等[3]。翡翠貽貝(Pernaviridis)是海產雙殼貝類，俗稱海虹，廣泛分布在我國福建、浙江，山東，遼寧等沿海地帶，其味道鮮美，營養豐富。蘇頌的《本草圖經》記載，其有“補五臟，益陽事，消宿食”等功效，現代研究表明，貽貝中多種活性物質具有抗菌、抗腫瘤、抗衰老、增強免疫力等作用且安全無毒害[4]，因而在臨床的應用中將會有越來越廣泛的前景。因此，本文通過采用不同體積分數乙醇分級沉淀翡翠貽貝提取物，獲得不同醇沉物，并比較不同組分在體外化學體系中對清除DPPH自由基、超氧陰離子自由基(·O2-)、羥自由基(·OH)、總抗氧化能力及抑制肝組織自發性脂質過氧化作用(LPO)的影響，研究其抗氧化活性，旨在為翡翠貽貝功能性食品及天然抗氧化劑的開發提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

翡翠貽貝(Pernaviridis)：購自廈門市東渡水產品市場，活貝購回后立即取肉、勻漿、均質、分裝，-18 ℃冷凍備用。

KM小鼠，SPF級，體重(20±2) g，雄性，購自中國科學院上海生命科學研究院(動物中心)上海斯萊克實驗動物有限責任公司(動物許可證號：SCXK(滬)2014-0002)，飼養環境溫度為(22±2) ℃，光照12 h/日，自由取食和飲水，適應環境飼養7 d。

基礎飼料，購自中國科學院上海生命科學研究院(動物中心)上海斯萊克實驗動物有限責任公司。

1.2 主要試劑

抗壞血酸、鄰苯三酚(焦性沒食子酸)、醋酸鹽緩沖液、1,1-二苯-2-苦基肼(DPPH)、FeSO4、水楊酸-無水乙醇、硫代巴比妥酸(TBA)、三氯乙酸、FeCl3、磷酸鹽緩沖液、三吡啶三吖嗪(TPTZ)、FeCl3、HCl、H2O2均為分析純。

1.3 儀器與設備

UV-2102 PC型紫外可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；BS 124 S型電子分析天平，德國Sartorius公司；PRO 200型組織勻漿器，美國PRO Scientific公司；Centrifuge 5810 R型高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；50型膠體磨，鄭州長城科工貿有限公司；SPX-250 B-Z型生化培養箱，上海博迅實業有限公司；BCD-216 TX型電冰箱，青島海爾股份有限公司；HH-2型數顯恒溫水浴鍋，金壇市科析儀器有限公司；LG-0.2型真空冷凍干燥機，上海沃迪科技有限公司；TC 101型電熱鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 翡翠貽貝不同醇沉物的制備[4-5]及其成分分析

取于-18 ℃低溫貯藏的翡翠貽貝均質勻漿液若干袋，稱其質量m克，放入燒杯中，加入等質量的水，于60 ℃恒溫水浴浸提1.5 h，離心取上清液，加入無水乙醇，使其終濃度為45%，-20 ℃靜置12 h，8 000 r/min離心10 min，沉淀即為45%乙醇提取物，命名為ME45，上清液繼續加入無水乙醇進行分級沉淀，分別得到ME60和ME80翡翠貽貝提取物。

將得到的3種翡翠貽貝醇沉物凍干備用。采用苯酚硫酸法測定總糖含量，凱氏定氮法測定總氮含量；GB 5009.3—2010直接干燥法測定水分含量；GB 5009.4—2010灼燒稱重法測定灰分含量；硫酸鋇比濁法測定硫酸根含量。

1.4.2 總抗氧化活力的測定——FRAP(ferric reducing antioxidant power)法[6-7]

FRAP工作液的配制：0.3 mol/L的醋酸鹽緩沖液(pH 3.6) 25 mL、10 mmol/L的TPTZ溶液(用40 mmol/L HCl配制)2.5 mL、20 mmol/L FeCl3溶液2.5 mL。用前37 ℃預熱。

FeSO4的標準曲線的繪制：以0.01～0.1 mmol/L FeSO4的標準溶液，用蒸餾水補足到2.0 mL，加入FRAP工作液3.0 mL混勻，置于37 ℃恒溫水浴反應10 min，測定OD593nm，重復3次，計算其平均值，繪制標準曲線。

在試管中加入2.0 mL一定濃度的樣品水溶液，后按上述方法測定翡翠貽貝不同醇沉物的的OD593nm值。抗氧化活性以相同吸光度值的FeSO4濃度表示。

1.4.3 對DPPH自由基清除能力的測定

DPPH自由基清除能力的測定參照SHANKAR[8]的方法并進行改進。在試管中加入1.0 mL一定濃度的樣品水溶液，再加入4.0 mL DPPH 溶液(0.1 mmol/L，用無水乙醇配制)，充分混合均勻，室溫下靜置30 min，然后測定OD517 nm吸光值，記作A，用無水乙醇替代DPPH，測吸光值為A1，以蒸餾水代替樣品溶液，測吸光度為A0。以VC作為標準對照。

(1)

式中：C1,樣品對DPPH自由基的清除率,%;A0,空白管的吸光值;A,加入樣品后的吸光值;A1,未加DPPH樣品溶液本底的吸光值。

1.4.4 對超氧陰離子自由基(·O2-)清除能力的測定

·O2-清除能力的測定方法參照范秀萍[9]的方法并進行改進。在試管中加入1.0 mL蒸餾水，3.5 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 8.04)，0.5 mL 10 mmol/L鄰苯三酚溶液，立即迅速混勻，測定OD325nm，30 s后開始記錄數據A1，每過30 s記錄一次吸光值，直到3.5 min(A2)，用10 mmol/L的鹽酸代替鄰苯三酚作為空白對照，計算鄰苯三酚自氧化速率。吸取一定濃度的的樣品水溶液1.0 mL，按照上述方法，測定加入樣品后的OD325nm，并計算加樣后鄰苯三酚自氧化速率。測定VC作為標準對照。

(2)

(3)

式中：A1,第30 s的吸光值；A2,第3.5 min的吸光值；S0，鄰苯三酚自氧化速率；S1，加樣后鄰苯三酚自氧化速率；C2，樣品對·O2-的清除率,%。

1.4.5 對羥自由基(·OH)清除能力的測定

清除羥自由基(·OH)能力測定參照MOHAMMADA[10]方法進行改進。在試管中加入一定濃度的樣品水溶液1.0 mL，然后加入9 mmol/L水楊酸-無水乙醇、8.8 mmol/L H2O2、和9 mmol/L FeSO4各0.5 mL，充分混勻，置于37 ℃恒溫水浴0.5 h，測定OD510nm吸光值，記為A，用蒸餾水代替H2O2，測定吸光值為A1，以蒸餾水代替樣品溶液，測定吸光值為A0，以VC作為標準對照。

(4)

式中：C3，樣品對·OH 的清除率,%;A，加樣后溶液的吸光值;A0，空白管的吸光值;A1，未加入的樣品溶液的吸光值。

1.4.6 體外抗肝組織自發性脂質過氧化的測定[11]

小白鼠禁食隔夜16 h 后處死，迅速取肝臟，用4 ℃生理鹽水清洗擦干，冰浴下勻漿，制成10%的肝組織液。在試管中加入一定濃度的樣品水溶液，然后加入1.0 mL的肝組織液液，充分混勻，置于37 ℃水浴3 h，后立即加入1.5 mL濃度為20%的三氯乙酸，混勻，3 500 r/min離心10 min。取3.0 mL上清液，加入1.5 mL 0.67%的TBA，置于90 ℃水浴15 min，后冷卻離心，測定上清液的OD532 nm。對照組用不加樣品水溶液，以生理鹽水代替；空白組不加樣品水溶液和肝臟組織液。計算肝組織脂質過氧化(LPO)的抑制率。

(5)

式中：C4，LPO抑制率,%;A，對照組的吸光值，Ai，各樣品組的吸光值。

1.4.7 數據處理

2 結果與討論

2.1 翡翠貽貝不同醇沉物的成分分析

乙醇分級沉淀體系，與物質的分子質量及極性有關。低濃度的乙醇能沉淀出黏液質、淀粉、高分子質量蛋白質等大分子物質，隨著乙醇濃度的升高，分子質量較小的物質逐漸沉淀出來，當體積分數達到90%以上時，幾乎可以沉淀出所有的多糖、蛋白質和無機鹽等小分子[12]。通過加入不同體積分數的乙醇沉淀翡翠貽貝粗提物獲得ME45、ME60和ME80三種翡翠貽貝醇沉物。分別測定其總氮、總糖、硫酸根、水分、灰分等基本成分，結果見表1。結果表明，3種醇沉物均含有蛋白質、多糖、硫酸酯等物質。ME45、ME60和ME80的蛋白質與多糖之和分別為71.91%、73.79%和74.14%。蛋白質與多糖含量之和以及所有測試項目之和均隨著乙醇濃度的升高而增加，說明通過由低到高的乙醇濃度的分級沉淀之后，醇沉物的純度也隨著提高。醇沉物ME80中的多糖含量最高，且硫酸根含量是前面2個組分的10倍，說明該組分中的多糖的硫酸化程度高，含有較多的多糖硫酸酯。同時，ME80的灰分含量最高，是由于高濃度的乙醇將無機鹽等小分子物質一并沉淀。

表1 翡翠貽貝不同醇沉物的成分分析 單位：%

2.2 體外抗氧化活性的檢測

2.2.1 總抗氧化活力的檢測

一般情況下，抗氧化劑通過自身還原作用給出電子達到清除自由基的目的[13]，因此其還原力越強，它的抗氧化能力也就越強。Fe3+-TPTZ在酸性條件下可被還原為Fe2+-TPTZ而呈藍色，在593nm處有最大吸光值。因此，根據吸光值的大小可判定總抗氧化能力的大小。

a：標準曲線；b：ME 80，ME60和ME45的總抗氧化能力圖1 翡翠貽貝不同醇沉物的總抗氧化能力的測定Fig.1 Total antioxidative capacity of differnet EtOH deposition fractions from P. viridis extract

從圖1-a標準曲線圖可以看出，FeSO4濃度在0～0.1 mmol/mL內與吸光值的線性關系良好，回歸方程式為y=9.831 5x+0.019 5，R2=0.996 6，這與江慎華、HUANG、董曉靜等研究一致[3, 12-13]。由圖1-b可以看出，ME45，ME60和ME80的總抗氧化能力基本與其質量濃度呈現正相關，當濃度達到16 mg/mL后，3種樣品的總抗氧化能力已經基本趨于平緩。通過總抗氧化能力的測定結果，可以看出ME60和ME80總抗氧化能力要優于ME45，且存在最佳的濃度范圍。3種不同體積分數乙醇分級醇沉的提取物均具有一定的總抗氧化活力，為其清除自由基或具備抗氧化作用奠定一定的基礎。

2.2.2 對DPPH自由基清除能力的檢測

由圖2-a可知，Vc在0.1～1.0mg/mL質量濃度呈顯著的量效關系，當Vc濃度達1.0mg/mL時清除率幾乎達到100%。由圖2-b可以看出，翡翠貽貝3種不同體積分數乙醇沉淀物ME45、ME60和ME80對DPPH自由基均有清除作用，且隨著濃度的增加，清除率明顯提高，呈明顯的量效關系。在相同濃度下，ME60對DPPH自由基的清除率最大，其次是ME80，ME45最小。當濃度為20 mg/mL時，ME80、ME60、ME45的清除率分別為60.23%，73.98%，34.78%，其擬合曲線方程式分別為y=9.789 3 Ln(x)-1.357 9，R2=0.897 0；y=22.731Ln(x)+0.024 6，R2=0.883 8；y=19.418Ln(x)-6.917 1，R2=0.890 4，根據曲線方程式計算IC50分別為16.55、9.01、34.17 mg/mL。因此，結果表明ME80、ME60對DPPH自由基具有一定的清除作用，ME60的樣品對DPPH自由基的清除能力優于ME80(P<0.01)，ME45對DPPH自由基的清除能力較弱。

a：Vc；b：ME 80，ME60和ME45清除DPPH自由基的能力圖2 翡翠貽貝不同醇沉物及Vc對DPPH自由基的清除能力Fig.2 Scavenging effect of Vc and differnet EtOH deposition fractions from P. viridis on DPPH

2.2.3 對超氧陰離子自由基(·O2-)清除能力的檢測

翡翠貽貝3種不同體積分數乙醇沉淀物ME45、ME60和ME80對·O2-的清除作用如圖3所示。Vc對·O2-的清除作用高于翡翠貽貝不同體積分數乙醇提取物。由圖3-b可以看出，ME45、ME60和ME80對·O2-均具有清除能力，且呈顯著的量效關系。當濃度達16 mg/mL時，ME80對·O2-的清除率達到最大，為99.78%，ME60和ME45的清除率分別為70.03%、51.98%。ME80、ME60和ME45的清除率擬合曲線方程式分別為y=31.501Ln(x)+7.195 1，R2=0.978 6；y=31.850Ln(x)-20.022，R2=0.965 5；y=26.882Ln(x)-23.947，R2=0.898 7。根據曲線方程式計算ME80，ME60和ME45清除·O2-的IC50分別為3.89、9.01、15.66 mg/mL。因此表明，ME80、ME60和ME45對·O2-具有一定的清除作用，ME80對的清除能力優于ME60和ME45(P<0.01)。

a：Vc；b：ME 80，ME60和ME45清除·O2-的能力圖3 翡翠貽貝不同醇沉物及Vc對·O2-的清除能力Fig.3 Scavenging effect of Vc and differnet EtOH deposition fractions from P. viridis on·O2-

2.2.4 對羥自由基(·OH)清除能力的檢測

由圖4-a可以看出，Vc為0.05～0.3 mg/mL呈顯著的量效關系。當Vc濃度達0.3mg/mL時清除率幾乎達到100%，說明Vc具有顯著的清除羥自由基能力。由圖4-b可以看出，翡翠貽貝3種不同體積分數醇沉物ME45、ME60和ME80對·OH均有清除作用，且隨著濃度的增加，清除率明顯提高，顯著正相關。當濃度大于3 mg/mL，ME80和ME45對·OH的清除率相差不大，增速減緩。當濃度為5 mg/mL時，ME80、ME60和ME45對·OH的清除率分別為98.37%、63.81%、98.53%，其擬合曲線方程式分別為y=41.517Ln(x)+33.660，R2=0.953 8；y=24.697Ln(x)+21.279，R2=0.933 5；y=25.128Ln(x)+58.481，R2=0.984 2。根據曲線方程式計算IC50分別為0.39、3.20、0.71 mg/mL。結果表明ME80、ME60和ME45對·OH具有一定的清除作用，ME45的清除能力優于ME80和ME60(P<0.01)。

2.2.5 對肝組織自發性脂質過氧化的檢測

脂質過氧化作用是指多不飽和脂肪酸和脂質氧化變質，形成脂質過氧化產物從而對脂蛋白、細胞膜等其它含脂質結構造成嚴重損害[11]。由圖5可知，Vc對體外抑制肝組織自發性脂質過氧化的作用高于翡翠貽貝不同體積分數乙醇沉淀物。隨著翡翠貽貝不同醇沉物濃度的增加，對體外抗肝組織自發性脂質過氧化的抑制作用越強，且呈明顯的正相關效應。ME80的抑制作用明顯高于ME60和ME45，ME60和ME45的抑制作用相差不大。當ME80濃度達到20 mg/mL時，對LPO的清除率達85.75%，仍然有持續上升的趨勢；當ME60濃度達18 mg/mL時，對LPO的清除率達到最大，為44.85%；ME45在濃度為16 mg/mL時對LPO的清除率達到最大，為36.25%。上述結果表明，翡翠貽貝不同醇沉物具有抑制肝組織自發性脂質過氧化的作用，ME80的抑制率優于ME60和ME45(P<0.01)。

a：Vc；b：ME 80，ME60和ME45清除·OH的能力圖4 翡翠貽貝不同醇沉物及Vc對·OH的清除能力Fig.4 Scavenging effect of Vc and differnet EtOH deposition fractions from P. viridis on·OH

a：Vc；b：ME 80，ME60和ME45清除LPO的能力圖5 翡翠貽貝不同醇沉物及Vc對LPO的清除能力Fig.5 Scavenging effect of Vc and differnet EtOH deposition fractions from P. viridis on LPO

3 結論

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Studies on antioxidative activitiesinvitroof the extracts by different EtOH precipitation fromPernaviridis

LIU Shu-ji1,2，4, LUO Qin-qin3, PAN Yu-tian3, LIU Zhi-yu2，4, SU Yong-chang2，4, LIN Jiao-fen3, CHEN Jin-quan1*

1(College of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University 350002, China)2(Fisheries Research Institute of Fujian, Xiamen 361013, China)3(Engineering Technological Center of Mushroom Industry,Minnan Normal University, Zhangzhou 363000,China)4(Key Laboratory of Cultivation and High-value Utilization of Marin Organisms in Fujian Province, Xiamen 361013,China)

In this paper, three extracts named ME45, ME60 and ME80 were precipitated by 45%, 60% and 80% EtOH fromPernaviridisrespectively. Their antioxidant activities were compared by scavenging activities for 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radicals, superoxidized radicals (·O2-), hydroxyl radicals (·OH), total antioxidant activities (TAC), and inhibitory effect on lipid peroxidation (LPO)invitro. The results showed that all precipitations had antioxidant activities and were dose-dependent. Different antioxidant activities were shown among different reaction systmes of three fractions. In TAC, ·O2-,and LPO reaction systems, the antioxidant activities order was: ME80>ME60>ME45. ME60 fraction had better scavenging effects than ME80 and ME45 for DPPH·. In the scavenging ·OH system, the order of removing ability was :ME45>ME80>ME60. In conclusion, ME80 fraction showed relatively strong antioxidant activities, a good potential as a natural antioxidant, and worth of further exploration and application.

P.viridis; extractives; ethanol fractional precipitation; antioxidant

博士研究生(陳錦權教授為通訊作者,E-mail: chenjq6613@gmail.com)。

福建省省屬公益類科研院所基本科研專項(2014R1003-9)；福建省海洋高新產業發展專項(閩海洋高新[2014]20號)

2015-03-18，改回日期：2015-12-30

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201706031